Magnetic Resonance elastografi metode til evaluering af manipuleret væv Construct Vækst

Summary

Fremgangsmåden demonstrerer metoden af ​​magnetisk resonans elastografi til overvågning af konstruerede resultatet af fedt-og osteogene manipuleret konstruktioner gennem invasiv lokal vurdering af de mekaniske egenskaber under anvendelse af mikroskopisk magnetisk resonans elastografi (μMRE).

Abstract

Traditionelle mekaniske afprøvning ofte resulterer i destruktion af prøven, og i tilfælde af længerevarende væv manipuleret konstruktion undersøgelser, er anvendelsen af ​​destruktive vurdering ikke acceptabel. En foreslået alternativ er anvendelsen af ​​en billeddannende proces kaldet magnetisk resonans elastografi. Elastografi er en ikke-destruktiv metode til bestemmelse af konstruerede resultatet ved at måle de lokale mekaniske egenskaber værdier (dvs. komplekse forskydningsmodul), som er vigtige markører til identifikation af struktur og funktionalitet af et væv. Som en noninvasiv midler til evaluering, er overvågningen af manipuleret konstruktioner med billeddiagnostiske metoder såsom magnetisk resonans imaging (MRI) ses en stigende interesse i det seneste årti ^1. For eksempel har de magnetisk resonans (MR) teknikker til diffusion og relaxometry været i stand til at karakterisere de ændringer i kemiske og fysiske egenskaber under manipuleret vævsudvikling ^2. Den foreslåede metode iFølgende protokol anvendes mikroskopisk magnetisk resonans elastografi (μMRE) som en ikke-invasiv MR baseret teknik til måling af mekaniske egenskaber af små bløde væv ^3. MRE opnås ved kobling af en sonisk mekanisk aktuator til vævet af interesse, og registrering af forskydningsbølgen formering med en MR-skanner ^4. For nylig har μMRE blevet anvendt i vævsmanipulering at erhverve vigtige vækst, oplysninger, der traditionelt måles ved hjælp af mekaniske destruktive makroskopiske teknikker ^5. I det følgende procedure, elastografi opnås ved billeddannelse af gensplejsede konstruktioner med en modificeret Hahn spin-ekko-sekvens koblet med en mekanisk aktuator. Som vist i figur 1, den modificerede sekvens synkroniserer billedoptagelse med transmissionen af ​​eksterne transversalbølger, efterfølgende bevægelse er sensibiliseret ved anvendelse af oscillerende bipolære par. Efter indsamling af billeder med positive og negative bevægelse sensitization, kompleks division af dataene frembringe en forskydningsbølge billede. Derefter bliver billedet vurderes ved hjælp af en inversion algoritme til at generere en forskydningsstivhed kort ^6. De resulterende målinger ved hver voxel er blevet vist at korrelere stærkt ^(r2> 0,9914) med data indsamlet ved hjælp af dynamisk mekanisk analyse ^7. I denne undersøgelse er elastografi integreret i vævet udviklingsprocessen for overvågning af humane mesenchymale stamceller (h MSC) differentiering til adipogeniske og osteogene konstruktioner som vist i figur 2.

Protocol

1. Tissue Construct Forberedelse

Vævet konstruktion fremstillingsprocessen består af tre faser: Udvidelsen af ​​cellepopulationen, podning af celler på et biomateriale stillads, og differentiering ved anvendelse af kemiske signalmolekyler. Proceduren for konstruktionen præparat baseret på metoder, der foretages af Dennis et al., Hong et al. Og Marion og Mao ^8,9,10.

1. Efter dyrkning og udvidelse af den cellelinie, frø de humane mesenchymale stamceller (MSC'er h) på en gelatinesvamp (4 mm i diameter, 3,5 mm tykkelse) ved en densitet på 1x10 ⁶ celler / ml for knogle-og 3x10 ⁶ celler / ml for adipose-dannelse.
2. Til differentiering af H MSC'er i adipose gælder fedt-induktion medier bestående af 1 uM dexamethason, 0,5 uM isobutyl-methylxanthin, 10 ug / ml human rekombinant-insulin og 200 uM indomethacin i celleekspansion mediumnår celler vises konfluent på stilladset. Efter tre dage erstatte mediet med 10 ug / ml human rekombinant-insulin i ekspansion medier i 24 timer og derefter vende tilbage til induktion medier. Gentag cyklus tre gange og derefter udveksle kun i vedligeholdelse medier hver anden dag.
3. At inducere osteogenese, fremstilles osteogene induktion medier ved at foretage en endelig koncentration på 0,1 uM dexamethason, 50 pM af L-ascorbinsyre-2phosphate og 10 mM β-glycerophosphat i celleekspansion medium. Udskift med friske osteogeniske medierne hver to dage.

2. Aktuator Karakterisering

Karakterisering af aktuatoren er et afgørende skridt for MRE eksperimentet. MRE afhængig af udbredelsen af ​​mekaniske transversalbølger til at vurdere lokale værdier af mekaniske egenskaber og derfor er disse mekaniske vibrationer skal genereres og karakteriseret i vævet af interesse under anvendelse af en piezoelektrisk aktuator. En illustreret EXAmple af den karakterisering er vist i figur 3. Målet med denne procedure er at optimere bevægelse af aktuatoren for at generere uskadelige forskydningsbølger med betydelige amplituder (~ 250 mikron).

1. Forud for forsøget, anvendes 0,5% agarosegel for at omslutte konstruktionen i en 10 mm reagensglas. Temperaturen af ​​gelen bør være omtrent 37 ° C for at minimere beskadigelse af konstruktionen.
2. Efter at agarosegelen fem minutter sat til stuetemperatur, før spidsen af ​​den piezoelektriske bukkemotor ind i overfladen af ​​gelen.
3. Fastgøre rør indeholdende prøven og aktuatoren til en stiv støtte, og orientere strålen af ​​Laser Doppler Vibrometer mod spidsen af ​​den mekaniske aktuator. Justere placeringen af ​​systemet til optimering af reflekterede signal, anvendes reflekterende tape, hvis nødvendigt.
4. Baseret på den forventede resonansfrekvens mekanisk aktuator, funktionen generatoren indstilles til at feje desired frekvensområde (dvs. 20 til 2000 Hz i dette eksperiment) under anvendelse af en driftsspænding på 20 Vpp med en hvid støj signal.
5. Se kendetegnet spektret på Polytec Vibrosoft til identificering af resonansfrekvensen for systemet og indstille programmet til FFT og hastighed som y-aksen.
6. Til forskydning måling, der aktuatoren til at levere en kontinuerlig sinusformet ved den angivne resonansfrekvens ved anvendelse af en spænding på 200 Vpp og bemærke genererede forskydning leveres til overfladen af ​​gelen. Indstillet Vibrosoft at vise FFT med forskydning som y-aksen.

3. Billede Acquisition

1. Efter endt aktuator karakterisering, placere prøven og aktuator i midten af ​​MR scanneren. For væv konstrukten eksperimenter, skal du bruge en lille og mere følsom RF spole (dvs. 10 mm i dette eksperiment) for transmission og modtagelse af RF-signalet. (Den viste fremgangsmåde anvender en 9,4 Tvertikal boring magnet forsynet med tredobbelte akse gradienter, 100 g / cm).
2. Anskaf en spejder billede til identifikation af konstruktionen placering.
3. Indstil parametre for købet. En typisk in vitro sagittal-scanning vil have en gentagelse tid på 1000 ms, ekkotid 20-40 ms, skivetykkelse på 0,5-1,0 mm, og synsfeltet af 12x10 ^mm2 med en matrix størrelse 128x128 pixel.
4. For elastografi parametre indstilles aktuatoren frekvens til værdien bestemt ved laser Doppler Vibrometer karakterisering. I den aktuelle undersøgelse blev en bipolær par nødvendigt med en gradient amplitude på 50 g / cm. Andre parametre at justere inkludere den forsinkelse, der skal sættes til nul millisekunder for den første erhvervelse.
5. Ændre funktionen generatoren burst mode og justere parametre funktionsgeneratoren at matche dem i de elastografi erhvervelse parametre, herunder hyppighed og antallet af cykler. Indstil også funktion generator til eksternt udløses.
6. For en sagittal billede, sætte bevægelse sensibilisering at være i den positive skive retning og starte scanningen. Efter overtagelsen billedet kontrollere og ændre sensibilisering til den negative skive retning.
7. Udfør MATLAB program, der vil udføre den komplekse division for generering af forskydningsbølgen billedet.
8. Vurdere billedet for tilstedeværelsen af ​​transversalbølger og mulige artefakter som f.eks fase indpakning.
9. Hvis der ikke justeringer af billedet er nødvendigt, justeres parametertabelerklæring størrelse til otte jævnt fordelte værdier fra nul sekunder til en fuld periode af præget resonansfrekvens.
10. Erhverve scan i både de positive og negative skive orienteringer.
11. Når billederne er erhvervet, bruge et MATLAB program designet til at generere forskydningsbølgen data fra en række billeder.

4. MRE Experiment Image Processing

1. The sidste trin MRE at beregne forskydningsstivhed fra forskydningsbølgen billeder. Placering af data i MATLAB program, der vil vurdere den tredimensionelle datasæt (2 rumlig, 1 tidslig).

Bemærk: Ved antagelse af en plan forskydningsbølge, bevægelsesligningerne afkobler muliggør vurdering af de komplekse værdsatte forskydningsmodul som en funktion af forskydningen og Laplace. Algoritmen tilnærmer rumlige andet derivater med finit forskel og beregner forskydningsmodulet på pixel-for-pixel basis. Fra denne komplekst tal, kan mange mekaniske parametre udledes såsom forskydningsbølge hastighed, bølgedæmpende, forskydningsstivhed, forskydning elasticitet, forskydningsviskositet osv. algoritmen tillader også udvælgelse af områder af interesse, som middelværdi og standardafvigelse af hver parameter beregnes.

2. De billeddannende parametre skal specificeres ved begyndelsen af ​​programmet. Derudover the øvre grænse for elastogram kan justeres for at optimere kontrast i prøven.

Bemærk: Programmet giver foreløbige resultater (bølge efter lav-pass filtre, bølge efter retningsbestemte filtrering, tidsmæssige FFT, line profiler osv.), der hjælper brugeren estimere trofasthed af opsvinget.

3. Nogle parametre kan justeres baseret på denne information, såsom niveauer af lavpasfiltre og den tidsmæssige hyppighed af bevægelse, udbredelsesretningen for bølgen osv. standardafvigelse af en parameter i en specifik region af interesse er også en indikator for kvaliteten af ​​beregningen.

5. Repræsentative resultater

Figur 4 noter ændringen i mekaniske egenskaber i hele fire uger af osteogent og adipogeniske konstruktion udvikling. MRE blev udført ved 730-820 Hz. Mens begge podede svampe startede ved ca 3 kPa, osteogenic dirigerede væv resulterede i en stivhed af 22 kPa, henviser til, at fedtvæv rettet væv faldt i stivhed til 1 kPa. Endvidere osteogene konstruktioner udviste en bemærkelsesværdig formindskelse i størrelse i forhold fra begyndelsen til afslutningen af ​​undersøgelsen. Yderligere egenskaber afledt elastografi undersøgelse er vist i tabel 1.

Figur 1. Billedet erhvervelse proces for magnetisk resonans elastografi. Under billedoptagelse, styrer en pulssekvens (a) synkroniseringen (b) af funktionen generatoren med den bipolære gradienter pulser af MRI scanneren. Efter erhvervelse af bipolar gradienter skiftes i positive og negative orienteringer en forskydningsbølge billede (c) fremstilles ved anvendelse af komplekse division.

Figur 2. Flowdiagram over MRE fremgangsmåde til væv motorlagdelte konstruktioner. Først celler (a) først dyrket, og udvidet til befolkningens størrelse afgørende for tilrettelagt projekt. Derefter Cellerne podes (b) på et biomateriale stillads og kemiske reagenser anvendes til at signalere differentiering. Stilladser er kendetegnet med MRE, hvis første trin (c) er bestemmelsen af ​​resonansfrekvensen af ​​aktuatoren koblet til konstruktionen. Dernæst MRI-billeder (d), erhvervet at generere en forskydningsbølge billede (e). Endelig er en algoritme anvendt til opnåelse af en elastogram (f), der kortlægger stivhed af konstruktionen. Samtidigt konstruktioner er snittet til histologisk vurdering (g) for at validere differentiering.

Figur 3. Actuator karakterisering procedure. Gelatinen stillads er omsluttet af en 0,5% agarosegel. At karakterisere bevægelse overføres til prøven en hvid støj sendes først til systemet(1a) og den resulterende bevægelse detekteres ved hjælp af en laser Doppler Vibrometer (1b). Når resonansfrekvens bestemmes en kontinuerlig sinusformet signal ved resonans (2a) sendes til bestemmelse af forskydning (2b) overføres til gelatine miljøet.

Figur 4. Konstruere udvikling kort over fire ugers periode. Adipogeniske (A) og osteogene (O)-konstruktioner er vist fra venstre til højre med tilsvarende størrelse og forskydningsbølge billeder, elastogram og gennemsnitlig forskydningsstivhed. Den colormap for elastogram svarer med farveskemaet af søjlediagram og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen inden for hver konstruktion har region af interesse.

Tabel 1. Mekaniske egenskaber af fedt-og osteo-konstruktioner over en fire ugers vækst.

Discussion

I denne fremgangsmåde er fremgangsmåden MRE til manipuleret konstruktioner demonstreret fra cellepræparat til frembringelse af en elastogram. Ved at anvende en ikke-destruktiv mekanisk vurdering af metode til vævsmanipulering rørledningen, er det nu muligt at vurdere ændringer i manipuleret konstruktioner gennem flere stadier af udvikling. Derudover supplerer MRE andre MR-metoder til overvågning manipuleret vævskonstruktioner såsom diffusion, magnetisering overførsel, og kemisk skift analyse ^1.

Når du udfører MRE eksperimenter, bør nogle begrænsninger bemærkes. Vurdering af in vitro prøver er tidsfølsomme undersøgelse. Derfor anbefales det, at undersøgelser bør ikke vare mere end en time, således at eventuel skade på vævet konstruktion er minimeret. Derudover kan tro inddrivelse af stivhed kortet blive kompromitteret på grund af konstruktioner, der enten er for lille eller stiv ^6. One mulig løsning på dette problem er at operere ved højere frekvens (> 2,5 kHz), som bølgelængden er omvendt proportional med frekvensen. Piezoelektriske stack aktuatorer drevet af høj spænding forstærkere er i stand til at levere tilstrækkelig bevægelse på sådanne frekvenser for at fremlægge en fuldstændig forskydning bølgelængde i prøven. En anden mulig ændring af protokollen er at bruge hurtigere sekvenser, såsom hurtig spin-ekko og ekko planar imaging ^{11, 12.}

Ud over mulighederne for MRE for manipuleret væv konstruktioner in vitro, er det næste trin i præ-klinisk vurdering til at evaluere udviklingen af implanterede væv i et levende system. Anvendelsen af ​​MRE til musestudier vil give endnu en mulighed for ikke-destruktivt vurdere udviklingen de vævskonstruktioner. Udvidelse af elastografi til behandling af knogle eller brusk defekter vil potentielt give en bedre forståelse af, hvordan man kan producere mere varig funktionel implantater feller brug i regenerativ medicin. Magnetisk resonans elastografi har potentialet til at spille en stigende rolle i valideringen af manipuleret konstruktioner både in vitro og in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b