Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Summary

La procedura dimostra la metodologia di elastografia risonanza magnetica per monitorare l'esito di ingegneria del tessuto adiposo e costrutti osteogeniche ingegneria non invasiva attraverso la valutazione locale delle proprietà meccaniche utilizzando microscopici elastografia risonanza magnetica (μMRE).

Abstract

Tradizionale test meccanico comporta spesso la distruzione del campione, e in caso di lungo termine ingegneria tessutale costruire studi, l'uso di valutazione distruttivo non è accettabile. Un'alternativa proposta è l'uso di un processo di imaging chiamata elastografia risonanza magnetica. Elastografia è un metodo non distruttivo per determinare l'esito ingegnerizzato misurando locali valori delle proprietà meccaniche (ad esempio, complesso modulo di taglio), che sono essenziali per identificare marcatori la struttura e la funzionalità di un tessuto. Come mezzo non invasive per la valutazione, il monitoraggio dei costrutti ingegnerizzati con modalità di imaging come la risonanza magnetica (MRI) ha visto un crescente interesse negli ultimi dieci anni ^1. Ad esempio, i risonanza magnetica (MR) tecniche di diffusione e rilassometria sono stati in grado di caratterizzare le variazioni chimiche e fisiche durante lo sviluppo tessutale ^2. Il metodo proposto inil protocollo seguente utilizza microscopico elastografia risonanza magnetica (μMRE) come una tecnica non invasiva MR base per misurare le proprietà meccaniche di piccole tessuti molli ^3. MRE è ottenuta mediante accoppiamento di un attuatore meccanico sonora con il tessuto di interesse e registrare la propagazione delle onde di taglio con uno scanner MR ^4. Recentemente, è stato applicato μMRE nell'ingegneria dei tessuti per acquisire informazioni essenziali crescita che viene tradizionalmente misurata utilizzando tecniche meccaniche distruttive macroscopici ^5. Nella procedura seguente, elastografia è ottenuta attraverso l'imaging di costrutti ingegnerizzati con Hahn modificato spin-echo sequenza accoppiato con un attuatore meccanico. Come mostrato in figura 1, la sequenza modificata sincronizza acquisizione delle immagini con la trasmissione di onde di taglio esterni, successivamente, il movimento è sensibilizzato attraverso l'uso di oscillante coppie bipolari. Dopo raccolta di immagini con moto sensibi positive e negativezione, complessa divisione dei dati produrre un'immagine delle onde di taglio. Poi, l'immagine è valutata utilizzando un algoritmo di inversione per generare una mappa di taglio rigidità ^6. Le misure ottenute in ciascun voxel hanno mostrato di forte correlazione (R ^2> 0,9914) con i dati raccolti usando analisi meccanica dinamica ^7. In questo studio, elastografia è integrata nel processo di sviluppo per monitorare tessuto umano cellule staminali mesenchimali (MSC h) differenziazione in costrutti adipogenica e osteogenica come mostrato in Figura 2.

Protocol

1. Preparazione del tessuto Construct

Il tessuto costrutto processo di preparazione consiste di tre fasi principali: espansione della popolazione cellulare, la semina di cellule su un'impalcatura biomateriale, e differenziazione attraverso l'uso di molecole chimiche di segnalazione. La procedura per la preparazione costrutto è basato su metodi condotti da Dennis et al., Hong et al., E Marion e Mao ^8,9,10.

1. Dopo la coltura e l'espansione della linea cellulare, seme le cellule staminali mesenchimali (MSC h) su una spugna di gelatina (4 mm, spessore 3,5 mm) ad una densità di 1x10 ⁶ cellule / ml per ossa e 3x10 ⁶ cellule / ml adiposo formazione.
2. Per la differenziazione di cellule staminali mesenchimali h in adiposo, applicare i mezzi di induzione adiposi composti da 1 desametasone pM, 0,5 pM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml di insulina umana ricombinante-, indometacina e 200 pM in mezzo cellulare espansionevolta che le cellule appaiono confluenti sul patibolo. Dopo tre giorni, sostituire il supporto con 10 ug / ml di insulina umana ricombinante, in supporti di espansione per 24 ore poi tornare a supporti induzione. Ripetere il ciclo di tre volte e poi scambiare solo in terreno di mantenimento ogni due giorni.
3. Per indurre osteogenesi, preparare supporti induzione osteogeniche facendo una concentrazione finale di 0,1 pM desametasone, 50 pM di acido L-ascorbico-2phosphate, e 10 mM β-glicerofosfato in mezzo cellulare espansione. Sostituire con mezzi freschi osteogeniche ogni due giorni.

2. Attuatore Caratterizzazione

Caratterizzazione dell'attuatore è un passo fondamentale per l'esperimento MRE. MRE si basa sulla propagazione di onde di taglio meccanici per valutare i valori locali di proprietà meccaniche, pertanto, queste vibrazioni meccaniche devono essere generato e caratterizzato all'interno del tessuto di interesse utilizzando un attuatore piezoelettrico. Un illustrato exaservite ad esempio del processo di caratterizzazione viene mostrato nella Figura 3. Lo scopo di questa procedura è di ottimizzare il movimento dell'attuatore per generare innocui onde di taglio con ampiezze significativi (~ 250 micron).

1. Prima dell'esperimento, applicare 0,5% gel di agarosio per racchiudere il costrutto in una provetta 10 mm. La temperatura del gel deve essere di circa 37 ° C per minimizzare i danni alla costruzione.
2. Dopo aver lasciato i gel di agarosio cinque minuti per impostare a temperatura ambiente, inserire la punta del motore piezoelettrico piegatura nella superficie del gel.
3. Fissare la provetta contenente il campione e l'attuatore di un supporto rigido, ed orientare il fascio del vibrometro laser Doppler verso la punta dell'attuatore meccanico. Regolare il posizionamento del sistema per ottimizzare il segnale riflesso, utilizzare nastro riflettente, se necessario.
4. Sulla base della frequenza di risonanza prevista l'attuatore meccanico, impostare il generatore di funzioni per spazzare la dGamma di frequenza esired (cioè 20 a 2000 Hz in questo esperimento) utilizzando una tensione di funzionamento di 20 Vpp con un segnale di rumore bianco.
5. Mostra lo spettro caratterizzato sul programma Polytec Vibrosoft per identificare la frequenza di risonanza del sistema e impostare il programma di FFT e velocità come l'asse y.
6. Per la misura di spostamento, impostare l'attuatore di fornire una sinusoide continuo alla frequenza di risonanza indicato utilizzando una tensione di 200 Vpp, e notare lo spostamento generato essere consegnato alla superficie del gel. Impostare Vibrosoft per visualizzare la FFT con spostamento come l'asse y.

3. Acquisizione di immagini

1. Dopo aver completato caratterizzazione attuatore, posizionare il campione e attuatore nel centro dello scanner MRI. Per gli esperimenti costrutto tessuto, utilizzare una piccola bobina RF e più sensibile (cioè 10 mm in questo esperimento) per la trasmissione e ricezione del segnale RF. (La procedura illustrata utilizza uno 9,4 Tmagnete foro verticale dotato di gradienti tre assi, 100 g / cm).
2. Acquisire una immagine scout per l'identificazione della posizione costrutto.
3. Impostare i parametri per l'acquisizione. Un tipico in vitro sagittale scansione avrà un tempo di ripetizione di 1000 ms, tempo di eco di 20-40 ms, spessore di strato di 0,5-1,0 mm, e campo di vista 12x10 mm ² con una matrice di dimensione 128x128 pixel.
4. Per i parametri elastografia, impostare la frequenza attuatore al valore determinato dalla caratterizzazione vibrometro laser Doppler. In questo studio, una coppia bipolare è stato necessario, con un gradiente di ampiezza di 50 g / cm. Altri parametri per regolare includono il ritardo che deve essere impostato a zero millisecondi per l'acquisto iniziale.
5. Modificare la funzione di generatore di modalità burst e regolare i parametri del generatore di funzioni affinché corrispondano a quelle dei parametri di acquisizione elastografia tra cui la frequenza e il numero di cicli. Inoltre, impostare la funzionezione del generatore da indurre dall'esterno.
6. Per una immagine sagittale, impostare la sensibilizzazione moto sia nella direzione positiva fetta e avviare la scansione. A seguito dell'acquisizione, controllare l'immagine e cambiare la sensibilizzazione alla direzione fetta negativa.
7. Eseguire il programma MATLAB che eseguirà la divisione complessa per la generazione delle immagini delle onde di taglio.
8. Valutare l'immagine per la presenza di onde di taglio e oggetti possibili, come il confezionamento di fase.
9. Se non regolazioni dell'immagine sono necessari, regolare la dimensione matrice parametro per otto valori equispaziati che vanno da zero secondi a un intero periodo della frequenza di risonanza caratterizzato.
10. Acquisire una scansione in entrambi gli orientamenti slice positivi e negativi.
11. Una volta che le immagini sono acquisite, utilizzare un programma MATLAB progettato per la generazione dei dati delle onde di taglio da una serie di immagini.

4. MRE Experiment Image Processing

1. Thfase e finale di MRE è calcolare la rigidezza a taglio dalle immagini onda di taglio. Inserimento dei dati nel programma MATLAB che valuterà il dataset tridimensionale (2 spaziale, uno temporale).

Nota: Assumendo un'onda planare taglio, le equazioni del moto permettendo disaccoppiare la stima del valore complesso modulo di taglio in funzione dello spostamento e del suo laplaciano. L'algoritmo approssima spaziali derivate seconde con differenze finite e calcola il modulo di taglio su un pixel-per-pixel. Da questo numero complesso, molti parametri meccanici può dedurre come la velocità delle onde di taglio, attenuazione dell'onda, rigidezza a taglio, elasticità taglio, viscosità di taglio, ecc L'algoritmo permette inoltre la selezione di regioni di interesse per cui la deviazione media e standard di ciascun parametro viene calcolato.

2. I parametri di imaging devono essere specificate all'inizio del programma. Inoltre, the il limite superiore della elastogramma può essere regolata per ottimizzare contrasto nel campione.

Nota: Il programma fornisce i risultati intermedi (onda dopo filtri passa-basso, onda dopo il filtraggio direzionali, temporali FFT, profili di linea, ecc) che aiutano l'utente stimare la fedeltà della ripresa.

3. Alcuni parametri possono essere regolati in base a questa informazione, come i livelli di filtri passa-basso, la frequenza temporale del moto, la direzione di propagazione dell'onda, ecc La deviazione standard di un parametro in una specifica regione di interesse sia anche un indicatore della qualità del calcolo.

5. Risultati rappresentativi

Figura 4 note la modifica delle proprietà meccaniche in tutto quattro settimane di sviluppo costrutto osteogenico e adipogenico. MRE è stata condotta a 730-820 Hz. Mentre entrambe le spugne teste di serie iniziata circa 3 kPa, osteogenic tessuti dirette portato ad una rigidità di 22 kPa e che, diretto tessuti adiposi sono diminuiti in rigidità a 1 kPa. Inoltre, i costrutti osteogeniche mostrato una notevole diminuzione delle dimensioni rispetto dall'inizio alla fine dello studio. Ulteriori oggetti derivate da elastografia studio sono mostrati nella Tabella 1.

Figura 1. Il processo di acquisizione di immagini per risonanza magnetica elastografia. Durante l'acquisizione delle immagini, una sequenza di impulsi (a) controlla la sincronizzazione (b) del generatore di funzione con la gradienti impulsi bipolari dello scanner MRI. Dopo l'acquisizione di gradienti bipolare attivata in orientamenti positivi e negativi, (c) una immagine delle onde di taglio è prodotto utilizzando complessa divisione.

Figura 2. Diagramma di flusso del processo per MRE motore tessutocostrutti Luin. In primo luogo, le cellule (a) vengono dapprima coltivate ed espanse a quelle della popolazione essenziale per il progetto ideato. Quindi le cellule sono seminate (b) su un'impalcatura biomateriale e reagenti chimici vengono applicati per segnalare differenziazione. Le impalcature sono caratterizzati con MRE, il cui primo stadio (c) è la determinazione della frequenza di risonanza del attuatore accoppiato al costrutto. Successivamente, immagini MRI (d) sono acquisiti per generare una immagine delle onde di taglio (e). Infine, viene applicato un algoritmo per ottenere un elastogramma (f) che mappa la rigidità del costrutto. Allo stesso tempo, costrutti sono sezionate per la valutazione istologica (g) al fine di convalidare la differenziazione.

Figura 3. Procedura di caratterizzazione attuatore. L'impalcatura gelatina è racchiuso da un gel di agarosio 0,5%. Per caratterizzare il moto viene trasferito nel campione un rumore bianco viene inizialmente inviato nel sistema(1a) e il moto risultante viene rilevato utilizzando un vibrometro laser Doppler (1b). Una volta che la frequenza di risonanza viene determinata, un segnale continuo sinusoide a risonanza (2a) viene inviato per determinare lo spostamento (2b) trasferita all'ambiente gelatina.

Figura 4. Costruire la mappa dello sviluppo nel periodo di quattro settimane. Adipogenica (A) e osteogenica (O) costrutti sono mostrati da sinistra a destra con grandezza corrispondente e le immagini delle onde di taglio, elastogramma, e rigidità taglio media. La mappa di colori per le corrisponde elastogramma con lo schema dei colori del grafico a barre e le barre di errore rappresentano la deviazione standard all'interno della regione di ogni costrutto di interesse.

Tabella 1. Proprietà meccaniche dei costrutti osteo adipose e per un periodo di quattro settimane di crescita.

Discussion

In questa procedura, il processo di MRE per costrutti di ingegneria tessutale è dimostrata dalla preparazione cella alla generazione di un elastogramma. Applicando un metodo non distruttivo valutazione meccanica alla conduttura di ingegneria tissutale, è ora possibile per valutare le variazioni costrutti artificiali tutto diversi stadi di sviluppo. Inoltre, integra MRE altri metodi di RM per il monitoraggio dei tessuti ingegnerizzati costrutti come la diffusione, il trasferimento di magnetizzazione, e lo spostamento analisi chimica ^1.

Quando si esegue esperimenti MRE, alcuni limiti noti. La valutazione dei campioni in vitro è uno studio momento delicato. Pertanto, si raccomanda che studi non dovrebbe durare più di un'ora in modo che eventuali danni al tessuto costrutto è minimizzato. Inoltre, il recupero fedele della mappa rigidità può essere compromessa a causa di costrutti che sono troppo piccole o rigida ^6. Sue possibile soluzione a questo problema è quello di operare a frequenza più alta (> 2,5 kHz), come la lunghezza d'onda è inversamente proporzionale alla frequenza. Pila piezoelettrica attuatori azionati da amplificatori ad alta tensione sono in grado di produrre una sufficiente a tali frequenze per produrre una lunghezza d'onda piena taglio nel campione. Un'altra possibile modifica al protocollo è quello di utilizzare più veloci sequenze come fast spin-echo e echo planare immagini ^{11, 12.}

Oltre le possibilità di MRE di costrutti di ingegneria tessutale in vitro, il passo successivo di pre-clinica è valutazione per valutare lo sviluppo di tessuti impiantati in un sistema vivente. L'applicazione del MRE a studi sui topi avrebbe fornito un'altra opportunità di valutare in modo non distruttivo dello sviluppo dei costrutti di tessuto. Estensione della elastografia per il trattamento di osso o cartilagine difetti potrebbe potenzialmente fornire una migliore comprensione di come produrre più durevole f funzionali impiantio utilizzare in medicina rigenerativa. Elastografia risonanza magnetica ha le potenzialità per svolgere un ruolo sempre più importante per la validazione dei costrutti ingegnerizzati sia in vitro che in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b