Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss

Summary

Vi erbjuder ett protokoll för odling av högrenade hippocampus nervceller från prenatal mus hjärnor utan användning av en matare gliacell lager.

Abstract

Primära kulturer av rått-och mus-hippokampala neuroner används allmänt för att avslöja cellulära mekanismer i neurobiologi. Genom att isolera och växande enskilda nervceller, forskare kan analysera egenskaper som relaterade till cellulär människohandel, cellstruktur och individuell protein lokalisering med hjälp av olika biokemiska tekniker. Resultat från sådana experiment är avgörande för att testa teorier som behandlar den neurala grunden för minne och inlärning. Emellertid är entydiga resultat från dessa former av experiment baserad på förmågan att växa neuronala kulturer med minimal förorening av andra typer av hjärnceller. I detta protokoll använder vi specifika medier avsedda för neuron tillväxt och noggranna dissektion av embryonal hippocampusvävnad att optimera tillväxten av friska nervceller och samtidigt minimera kontaminerande celltyper (t.ex. astrocyter). Embryonal musen hippocampusvävnad kan vara svårare att isolera än liknande gnagare vävnaden på grund av storleken på provet för dissection. Vi visar detaljerade dissekering tekniker för hippocampus från embryonala dag 19 (E19) mus valpar. När väl hippocampusvävnad isoleras, är milda dissociation av neuronala celler som uppnås med en utspädd koncentration av trypsin och mekanisk sönderdelning utformad för att separera celler från bindväv och samtidigt tillhandahålla minimal skada på individuella celler. En detaljerad beskrivning av hur man framställer pipetter som skall användas i att upplösa ingår. Optimala plätering densiteter finns för immuno-fluorescens protokoll för att maximera framgång cellodling. Protokollet tillhandahåller en snabb (ungefär 2 h) och effektiv teknik för odling av neuronala celler från mus hippocampusvävnad.

Protocol

1. Set-up Innan Harvest

1. För att generera prenatala valpar för neuron skörd, schemalägga avel mellan vuxna möss 19 dagar före dagen för neuron isolering. (C57BL / 6 möss åldrar 2-8 månader användes i parningar för i syfte att utveckla detta protokoll). Lyckad parning kan bekräftas genom detektering av en vaginal plugg i honan, hjärtklappning eller visuell bekräftelse av graviditeten.
2. Dagen före neuron isolering:
   1. För immunfluorescens tillämpningar, jacka täckglas i en 24-brunnsplatta med en lätt beläggning av 3:1 Kollagen 1, råtta Svans: poly-D-Lysin-lösning.
   2. För cellodling tillämpningar, kappa lämplig storlek vävnadsodling plastartiklar med en lätt beläggning av 3:1 Kollagen 1, råtta Svans: poly-D-Lysin-lösning.
3. Vila plattorna otäckta i en vävnadskultur huv under en UV-ljus över natten.
4. Tvätta plattorna med steril Hanks Balans saltlösning (HBSS) föreatt använda. Belagda plattor kan fyllas med HBSS och lagrades upp till en vecka vid 4 ° C i mörker.

2. Vävnad Skörd

1. Sterilitet är alltid en faktor när allt primära cellkulturer och som sådan bör den största försiktighet iakttas för att säkerställa den mest sterila miljö som möjligt. Med noggrann uppmärksamhet på steril teknik kan initial dissekering och skörd av nervvävnad för detta protokoll fyllas utanför en huv med laminärt flöde med minimal risk för kontaminering. Efter initial skörden, bör alla efterföljande steg utföras under maximala sterila betingelser i en huv beräknat för cellodling.
2. Euthanize en gravid mus vid omkring 19 dagar efter befruktning genom halshuggning. Användning av anestesi till euthanize den dräktiga honan rekommenderas inte eftersom anestesi är känt för att förorsaka död hjärncell (Stratmann, et al., 2010). Med användning av sterila dissekera sax och tång, skapar en öppning i mitten ventrala sidan avmusen för att helt avslöja kroppen hålighet. Instrument kan steriliseras med användning av alkohol och en öppen låga.
3. Prenatala ungarna kommer att vara belägen mot den bakre delen av musens kroppshålighet och bör vara lätt synlig i livmodern. Med autoklaverad steril tång, öppna livmodern och ta valpar. Halshugga valpar med färska steril sax och plats bort huvudet på steril gasbinda under ett dissektionsmikroskop. Sterila autoklaverad instrument kan vara eld rengöras med alkohol och en öppen eld före och under användning.
4. Använda steril sax eller skalpell, öppna skallen på valp från nacken till näsan. Detta förfarande kan normalt slutföras genom att sätta in en spets saxen i ryggraden foramen och sedan fortsätter framåt. Ta försiktigt bort hela hjärnan med pincett. Placera hjärnan på steril gasbinda. Användning av en steril skalpell avlägsna cerebellum och incisionsfilm ned mittlinjen av hjärnan för att separera den i två hemisfärer (figur 1) .
5. Fatta en liten del av hjärnhinnor som omger hippocampus med sterila pincett och dra försiktigt bort. Även om det inte är strikt nödvändigt att avlägsna meningerna innan isolering av hippocampus, kan närvaron av meningerna göra dissektion av hippocampus svårare på grund av segheten hos membranet. I endera fallet kommer hippocampus vara mer klart synlig efter meningerna har avlägsnats. Hippocampus är en böjd struktur som börjar i distala delen av halvklotet och böjer ventralt (Figur 2). Som inre, konkava, sida (kaudalt) står inför en kammare, är det redan gratis. Därför, för att isolera hippocampus, behöver man skär längs den konvexa utsida. Efter dissektion försiktigt lyfta varje hippocampi med sterila vävnad pincett och överför till en liten vävnadsodling skålen med uppvärmda (37 ° C) HBSS under en cellkultur huva. Hjärnvävnad kan kombineras från flera valpar.

"> 3. Vävnadsdissociering

1. Användning av en steril skalpell försiktigt mala hjärnvävnad i 3 ml steril HBSS i en 100 mm vävnadsodlingsskål.
2. Överföra den malda vävnaden och HBSS till en 15 ml koniskt rör. Tillsätt 1,5 ml HBSS och 0,5 ml av 0,25% trypsin-lösning till en total volym av 5 ml.
3. Cap och försiktigt vända röret 4-5 gånger för att blanda. Försök att undvika framställning av bubblor som DNA frisätts från den digererade vävnaden kommer hädanefter att bubblor och orsaka det malda vävnaden att flyta i stället för sedimentering på botten av röret (figur 3).
4. Inkubera hippocampusvävnad vid 37 ° C i 15 minuter, vända röret som ovan var 5 minuter.
5. Tillåta vävnaden att sedimentera till botten av röret.
6. Noggrant avlägsna överskott lösning med användning av en steril pipett lämnar vävnad ostörd vid botten av röret.
7. Tvätta pelleten vävnad med 5 ml HBSS vid 37 ° C under 5 minuter. Upprepa totalt 3 gånger. Tillåta vävnaden att helt lösatill botten av röret varje gång innan man fortsätter till nästa tvättsteg.
8. Avlägsna den slutliga tvättningen från vävnaden pelleten och ersattes med 2 ml av färsk HBSS.

4. Neuron Triturering

1. Innan du börjar triturering steg kommer du att behöva förbereda Fire Polished Pasteur pipetter. Med hjälp av en Bunson brännare, håller en steril 9 tum pasteurpipett spets (figur 4a) i lågan tills diameter pipetten öppningen är cirka 0,5 mm i storlek och kanter i pipetten öppningen har avrundats något (figur 4b). Låt pipetten helt kall innan tritureringsprocessen.
2. Med en vanlig steril 9 tum pasteurpipett försiktigt mal sönder vävnaden totalt 7 gånger. Större vävnadsbitar är normalt vid denna punkt och bör tillåtas att bosätta sig på botten av röret innan han flyttade till nästa steg.
3. Överför supernatanten till ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör.
4. Tillåta alla återstående större vävnadsbitar att sedimentera till botten av röret och kombinera supernatanten med det tidigare supematanten för ett totalt 4 ml dissocierade neuronala celler.

5. Cellutstrykning

1. Räkna de dissocierade celler med användning av en hemocytometer.
2. Som en allmän regel, när antalet celler har bestämts, subtrahera 20% från det slutliga antalet med hänsyn till eventuellt celldöd, som kan inträffa efter utstrykning.
3. Celler kan beläggas med de rekommendationer som nedan:
   För täckglas i en 24 brunnars platta - 6 x 10 ^4-celler / brunn i 0,5 ml
   Under 60 mm vävnadsodlingsplattor - 4 x 10 ⁵ celler / platta i 3 ml
   För 100 mm vävnadsodlingsplattor - 6 x 10 ⁶ celler / platta i 6 ml
4. Blanda lämpliga cellantal med angivna volymen Neurobasal Plätering Media (NeurobasalMedia innehållande B27 supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamin-lösning, 25 pM glutamat (Mr 147,13 g / mol), penicillin (10.000 enheter per ml) / streptomycin (10.000 xg / ml) [250 | il / ml 50] , 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% värmeinaktiverat donatorhästserum) och tillsätt celler på plattor. Virvlar runt plattorna försiktigt för att fördela celler jämnt. Hl-donatorhästserum sätts till Plätering media att anrika cellerna under de första 24 timmarna av tillväxt. Cellerna är därefter avvanda från serum och återförs till ett serumfritt miljö genom seriell reduktion av serum vid varje medium utbyte. Det bör också noteras att medan glutamat vid högre koncentrationer är toxisk för neuronala cellkulturer, vid de lägre koncentrationerna tillsätts här, kommer det att inhibera bindning av icke-neuronala celler ^11. Det bör dock endast läggas till plätering media för de första 24 timmarna i kultur och därefter lämnas utanför eventuella Feeding Media för att förhindra neurotoxicitet av cellerna.
5. Pspetsar neuroner i ett 37 ° C, _5% CO2 inkubator över natten.
6. Avlägsna halva volymen av media från cellerna och ersätts med samma volym av Neurobasal Matning media (Neurobasal-medium innehållande B27-supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamin-lösning, penicillin (10.000 enheter per ml) / streptomycin (10.000 xg / ml) [250 | il / ml 50], 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Nervceller bör utfodras var 4 dagar genom att ta bort hälften av de gamla medier och ersätta den med samma volym av färska Neurobasal Matning media. Neuronala processer bör börja att vara synliga på dag 1 (Fig. 5a) och bli förhärskande vid dag 10 (figur 5b).

6. Representativa resultat

Förmågan att växa och kultur primära neuronala celler har blivit en oumbärlig del av neurovetenskap. Primära kulturer tillåter forskaren att analysera specifika cellulära vägar, kemisk modifiering och behandling, mål localization och mönster tillväxt i en kontrollerad miljö. Många av dessa förfaranden använder sofistikerade metoder för att visualisera vissa förändringar i cell svar. I detta fall är hippocampala neuroner används för att studera specifika neuronala banorna som skulle visa sig svårt, om inte omöjligt att analysera i den intakta hjärnan. Framställning av nära homogena populationer av nervceller från specifika områden av hjärnan är kritisk för att studera hjärnfunktion. Molekylära effekter i nervceller kan vara avgörande för avgränsning högre ordningens vägar som minne eller inlärning. Eftersom detta protokoll ger relativt rena kulturer av hippocampala neuroner, utan behov av ett matarskikt av gliaceller, är dessa neuroner lätt utnyttjas för immunofluorescensstudier. Men som med alla primär kultur från andra organ som innehåller flera celltyper, kan viss förorening med mindre önskade celler förekommer. I isolering av neuronala celler, kan kontaminering av gliaceller är ett vanligt problem. Gliaceller cen lätt upptäckas vid mikroskopisk visualisering av kulturen som deras morfologi skiljer sig markant från målet nervceller (Figur 6). Effekterna av gliaceller föroreningar beror på den planerade användningen av kulturer. Om celler används för immuno-fluorescens undersökning kan glial förorening vara något annat än ett besvär när de försöker fotografera enskilda nervceller. Om emellertid de neuronala kulturer som skall användas för biokemisk analys, kunde någon betydande kontaminering av gliaceller orsaka stora förändringar i resultaten. Sätt att hantera gliacell förorening beskrivs ytterligare i diskussionen.

När nervceller framgång har isolerats och odlas i kultur, är en typisk applikation för att undersöka cellulära processer immuno-fluorescens tekniker. Såsom illustreras i figur 7, kan organeller, såsom mitokondrier, färgas med användning av vitala färgämnen tillsättas till odlingsmediet före fixeraation. Endogena cellulära proteiner kan visualiseras från fixerade celler med användning av standardförfaranden immuno-fluorescenstekniker (figur 8). När väl neuronala cellerna fixeras, kan specifika antikroppar för proteiner av intresse kan introduceras i cellen och dessa proteiner kan visualiseras med användning av ett fluorescensmikroskop. Odlade nervceller ger också forskaren med medel för att undersöka enskilda protein effekter på neuronala funktioner. Användning av en mängd tekniker inkluderande DNA-transfektioner, elektroporering eller viral transduktion, kan proteiner vara överuttryckt i neuronala celler (figur 9). Hur neural celler svarar på effekterna av över-uttryckta proteinerna kan få direkta slutsatser om hur hjärnan kan reagera och erbjuder möjligheten att identifiera cellulära mål för läkemedelsbehandling. Detaljerna i dessa typer av experiment går utanför ramen för denna uppsats men de visar att kulturer som utarbetats av denna teknik är lämpliga för ett brett spektrum av ned-stream tillämpningar. Men den totala enkelheten av detta protokoll, liksom, den korta tid som krävs för att förbereda dessa neuronala kulturer gör detta en idealisk metod för användning i dagens neurovetenskap laboratorium.

Figur 1. Dissektion av prenatal mushjärna. Den första snittet är längs mittlinjen av hjärnan separera det i två hemisfärer.

Figur 2. Placering av hippocampus i prenatala mushjärna. Striatum förflyttas åt sidan för att visualisera hippocampus och noteras av det krökta "kidneyböna" typ struktur i det distala området av varje hemisfär.

Figur 3. Dissociation av hippocampusvävnad i trypsinlösning.

Figur 4. Pasteur pipettspetsar används i triturering av hippocampusvävnad. (A) Normal Pasteur pipettspets. (B) Brand-polerad pasteurpipett spets. Ta del av de rundade kanter och den ungefärliga 50% minskning av pipett öppning storlek.

Figur 5. Hippocampusneuroner isolerades med användning av detta förfarande och ströks ut i NB media. (A) Celltillväxt 1 dag efter utstrykning. Neuronala processerna börjar synas under dag 1. (B) Celltillväxt 10 dagen efter-plating är neuriter grenade och överlappande.

Figur 6. Hippocampusneuroner kontaminerade med gliala celler odlade i 7 dagar och färgades med organellen markör MitoTracker röda CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) och transfected med GFP-LC3 med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11.668.019). Mitokondrier är synliga i alla celler men endast en enda neuron framgångsrikt transfekterats med fluorescerande konstruktionen. Kontaminering med gliaceller som gör analys av GFP-LC3 uttryck i de neuronala processerna är svåra att visualisera.

Figur 7. Hippocampusneuroner odlas i 7 dagar och färgades med organellen markör MitoTracker röda CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513). Denna viktiga färgämne används för att färga aktiva mitokondrier i vävnadskulturceller. Cellerna fixerades i 4% paraformaldehyd / PBS och visualiserades genom fluorescensmikroskopi. Färgämnet i sig är icke-fluorescerande tills oxideras i mitokondrierna. Aktiv mitokondrier kan ses i hela neuronala processerna.

Figur 8.

Figur 9. Hippocampala neuronala kulturer odlades under 5 dagar och transfekterades med GFP-LC3β DNA-konstruktion med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11.668.019). Vid dag 7, fixerades celler med användning av 4% paraformaldehyd / PBS och aggresomes med GFP-märkt LC3β införlivas deras yttre membran visualiserades med användning av fluorescensmikroskopi. Aggresomes finns över hela cellkroppen och neuriter och betecknas med pilar.

Discussion

Hippocampus kulturer har använts i molekylär biologi för mer än 20 år. I princip kan neuronala kulturer göras från någon del av hjärnan har hippocampus kulturer visat sig vara den mest populära på grund av den relativt enkla arkitektur nervcell befolkningen i hippocampus ^7. Hippocampus kulturer vanligtvis tillverkade av sent skede embryonal vävnad. Denna vävnad är lättare att skilja och innehåller färre gliaceller än vad moget hjärnvävnad ^1. Isolering av hippocampus neuroner från embryonal vävnad minskar också klippning skador på axoner och dendriter på grund av färre vidhäftning kontakter ^3. Medan hippocampus kulturer oftast genereras från råttor på grund av den relativt lättare isoleringen av hippocampus, kan möss också användas med samma protokoll vid lämplig vård tas under vävnad isolering. När nervceller odlas, förmågan att använda avancerade molekylära tekniker för att analysera subcellulärt localization och människohandel kan användas. Detta kan vara särskilt fördelaktigt när man analyserar embryonala dödliga transgena möss som det ger möjlighet att studera protein interaktioner som skulle resultera i död av embryot.

Hippocampus har varit inblandad i både rumslig och kontextuell inlärning ⁵ och minne ^6. Tillväxt av primära kulturer från hippocampus kan tillåta en korrelation mellan subcellulära biologiska händelser och deras inverkan på hjärnans förmåga att lära och minnas.

Som med alla neurala celler, neuroner odlade från hippocampus kulturer kräver kritisk tillväxtfaktorer, hormoner och aminosyror. I hjärnan, är dessa faktorer som tillhandahålls av gliaceller. Detta symbiotiskt förhållande kan också utföras i en odlingsmiljö genom odling av en "feeder"-skikt av gliala celler tillsammans med de odlade neuroner. Kommer dock gliaceller producerar även cytotoxiska faktorer under sin livstid ¹¹ Which kan vara toxiskt för odlade neuroner. För att kringgå detta har neuroner odlats i serumfritt medium såsom Neurobasal-medium kompletterat med B27. B27 tillskott är optimerad för överlevnad av hippocampus neuroner, men kommer att stödja tillväxten av andra neuronala kulturer samt ^4. L-glutamin är en essentiell aminosyra för energiproduktion och proteinsyntes i cellkultur. Däremot kan glutamin vara instabilt med tiden, förnedrande till ammoniak och karboxylsyror biprodukter sura gång lagt till kultur media. Glutamax, en cellodling komplement från Invitrogen, kan användas som en direkt ersättning för L-glutamin, om så önskas. Glutamax är mer stabil i media men något dyrare. Tillväxt av nervceller i serumfria medier möjliggör studie av effekterna av tillväxtfaktorer och hormoner på neuronal tillväxt och differentiering.

Vi lämna ett protokoll för snabb isolering av hippocampus neuroner från mus prenatal embryon med Neurobasal medier och B27 supplement för tillväxt av nervceller i ett serum-fri miljö utan användning av matarceller. Som med alla odlade primära cell-protokoll, är det fördelaktigt att minimera tillväxten av icke önskade celltyper (dvs. gliaceller). Detta är mest lätt åstadkommas genom noggrann dissektion av hippocampus från omgivande delar av hjärnan. Prenatal celler innehåller också ett jämförelsevis litet antal gliaceller medhjälp i detta mål. Däremot kan gliacell förorening förekommer fortfarande. Det är möjligt att reducera gliacell kontaminering genom behandling med cytosinarabinosid (AraC) vid tidiga tidpunkter i kulturen ^8,9. AraC kan användas som ett anti-mitotiskt medel för att reducera populationen av icke-neuronala celler med förmåga att DNA-syntes. Emellertid, för att undvika eventuella toxiska effekter av behandlingen på neuroner, bör det användas vid sin lägsta effektiva gör (5 pM) och inte tillsättas efter 3-4 dagars odling ^11. Ett annat alternativ skulle vara att använda 5-fluor-2'-deoxiuridin (FUdR) behandling för decemberrease andelen fibroblastisk-reaktiva mikrogliaceller ^10.

Gång skördades kan hippocampusvävnad behandlas med en utspädd trypsinlösning för att dissociera / disaggregera adherenta celler. Däremot kan långvarig exponering för högre koncentrationer av trypsin vara skadligt för cellen subkultur så tiden i trypsin lösningen oftast begränsad till mellan 3-5 minuter. Den utspädda Koncentrationen av trypsin som används i detta protokoll gör det möjligt längre tid av enzym inkubation att öka den individuella cellulära avståndstagande, men försiktighet bör vidtas för att strikt följa den föreskrivna tiden punkter. Papain kan användas som en alternativ enzym och har visat sig vara mer effektiva och mindre destruktiv med vissa vävnader, såsom neuroner i näthinnan ^10.

Celldissociation följs av pulverisering av vävnaden. Detta har visat sig vara det viktigaste steget i konsekvent neuronal kultur och är markerad med två viktiga poängts. Första används två sterila pasteurpipetter användas under denna process. Den första används för att kraftigt störa vävnad / cellulär förening. Öppningsstorleken av denna första pipett bör vara mellan 1,0-1,5 mm. Noggrant urval av pipetter direkt från leverantören förpackningen kan oftast resultera i lämpliga pipetter för denna första rivning. Den andra Pasteur-pipett används är "flampolerad" över en Bunsen-brännare för att minska storleken på öppningen till cirka 0,5 mm i diameter. Detta resulterar också i "polering" glaset ringen av öppningen till en jämnare yta reducerande mekanisk skada på celler när de passerar genom. För det andra är den hastighet / kraft triturering genom pipett av stor betydelse. Som cellerna dissocieras från hel vävnad, är de naturligtvis mer skör. Således skulle "grov" behandling som denna punkt vara till förfång för överlevnad av de neuronala cellerna. Trypsinerades vävnaden bör passera genom pipetten med en konsekvent men fast flöde. Ett vanligt misstag av The forskare är tanken på att behöva helt ta avstånd vävnaden tills det inte finns någon urskiljbar struktur kvar. I de flesta fall kommer detta att resultera i omfattande neuronal död som cellerna kommer att alltför skadas av upprepad mekanisk manipulation. Det angivna antalet gånger för att passera genom vävnaden pipetten kommer att resultera i tillräckliga antal neuroner utan att resultera i grov skada på populationen.

När väl cellerna har dissocierat och poolades, en Trypan Blue-färgning av en alikvot av celler kommer att tillhandahålla ett förhållande av bor med döda celler. Typiskt bör 75-80% av cellerna överlever skörd processen och kan användas för plätering. Trypan blue-färgning kan också användas för att erhålla en noggrann cellräkning när gjort på en hemocytometer. I praktiken, när en total cellräkning uppnås, tillsätt 20% till den totala och använda det cellantal för plätering att ta hänsyn till den ungefärliga mängden av celldöd. Nummer som tillhandahålls inom ovanstående protokollet är ett bra starting peka för att uppnå goda tätheter av nervceller. Om neuron densiteten är alltför låg vid plätering, kommer celltillväxt sannolikt inte vara tillräcklig så plätering densitet är en viktig variabel i förökning av cellpopulationen. Cellerna ska matas var fjärde dag med B27/Neurobasal Feed media. Neuronal tillväxten under dessa förhållanden kan lätt utföras för att 10-14 dagar i kultur och har använts för att sprida nervceller ² ut till 30 dagar i kultur när såddes vid 80 celler / mm ^2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H