Summary
Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.
Abstract
Les cultures primaires de rat et de souris neurones de l'hippocampe sont largement utilisés pour révéler les mécanismes cellulaires de la neurobiologie. En isolant et en pleine croissance des neurones individuels, les chercheurs sont capables d'analyser les propriétés liées à la traite cellulaire, structure cellulaire et la localisation des protéines individuelles en utilisant une variété de techniques biochimiques. Les résultats de ces expériences sont essentiels pour tester les théories portant sur les bases neurales de la mémoire et l'apprentissage. Cependant, des résultats sans ambiguïté de ces formes d'expériences sont fondées sur la capacité de croître des cultures de neurones à la contamination minimale par d'autres types de cellules du cerveau. Dans ce protocole, nous utilisons des supports spécifiques conçus pour la croissance des neurones et une dissection minutieuse du tissu hippocampique embryonnaire pour optimiser la croissance des neurones sains tout en minimisant les types de cellules contaminantes (astrocytes par exemple). Embryonnaire de la souris tissu hippocampique peut être plus difficile d'isoler que les tissus des rongeurs similaire en raison de la taille de l'échantillon pour dissection. Nous montrons les techniques de dissection détaillée de l'hippocampe à partir embryonnaires souriceaux jour 19 (E19). Une fois le tissu hippocampique est isolée, la dissociation des cellules neuronales douce est obtenue avec une concentration diluée de la trypsine et la rupture mécanique des cellules destiné à séparer les tissus conjonctifs tout en fournissant un minimum de dégâts à des cellules individuelles. Une description détaillée de la façon de préparer les pipettes à être utilisé dans la perturbation est inclus. Densités optimales de placage sont prévus pour l'immuno-fluorescence protocoles afin de maximiser la culture de cellules avec succès. Le protocole prévoit une technique rapide (environ 2 h) et efficace pour la culture des cellules neuronales à partir de tissus de la souris hippocampe.
Protocol
1. Mise en place avant la récolte
- Pour générer chiots prénatales pour la récolte des neurones, planifier la reproduction entre les souris adultes 19 jours avant le jour de l'isolement des neurones. (C57BL / 6 ans 2-8 mois ont été utilisés dans les accouplements pour les fins de l'élaboration de ce protocole). Accouplement réussi peut être confirmé par la détection d'un bouchon vaginal dans la confirmation de femmes, des palpitations ou visuelle de la grossesse.
- Le jour avant l'isolement des neurones:
- Pour les applications immunofluorescence, des lamelles de verre manteau dans une plaque de 24 puits avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution.
- Pour les applications de culture cellulaire, manteau tissu approprié taille en plastique culture de la céramique avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution.
- Reposez les plaques découvertes dans une hotte de culture tissulaire sous une lumière UV pendant la nuit.
- Laver les plaques avec une solution de Hank stérile de l'équilibre salin (HBSS) avantà utiliser. Plaques enduites peuvent être remplis avec du HBSS et stocké jusqu'à une semaine à 4 ° C dans l'obscurité.
2. Récolte des tissus
- La stérilité est toujours un facteur lors de la croissance des cultures de cellules primaires et en tant que telle, la plus grande prudence doit être exercée afin d'assurer l'environnement le plus stérile possible. Avec une attention particulière à une technique stérile, la dissection initiale et la récolte de tissu neural pour ce protocole peut être effectué en dehors d'une hotte à flux laminaire avec un risque minimal de contamination. Après la récolte initiale, toutes les étapes ultérieures doivent être menées sous des conditions stériles maximales au sein d'une hotte classé pour la culture cellulaire.
- Euthanasier une souris enceinte à environ 19 jours post-fécondation par décapitation. L'utilisation de l'anesthésie pour euthanasier la femme enceinte n'est pas recommandée car l'anesthésie est connu pour causer la mort des cellules du cerveau (Stratmann, et al., 2010). En utilisant des ciseaux de dissection stériles et des pinces, de créer une ouverture dans le côté mi-ventrale de lasouris pour révéler complètement la cavité du corps. Les instruments peuvent être stérilisés à l'aide d'alcool et d'une flamme nue.
- Chiots pendant la grossesse sera situé vers la partie postérieure de la cavité du corps de la souris et doit être facilement visible dans l'utérus. Avec autoclavés pinces stériles, ouvrez l'utérus et de supprimer les chiots. Décapitez chiots avec des produits frais de ciseaux stériles et chef lieu retiré sur une gaze stérile sous un microscope à dissection. Les instruments stériles et peuvent être autoclavés flamme nettoyés à l'aide d'alcool et d'une flamme nue avant et pendant l'utilisation.
- L'aide de ciseaux stériles ou un scalpel, crâne ouvert de chiot à partir de la nuque vers le nez. Cette procédure peut normalement être achevée en insérant une extrémité des ciseaux dans le trou vertébral, puis de procéder avant. Retirez soigneusement l'ensemble du cerveau avec une pince. Placez le cerveau sur de la gaze stérile. L'utilisation d'un scalpel stérile, retirez le cervelet et inciser en bas de la ligne médiane du cerveau afin de le séparer en deux hémisphères (Figure 1) .
- Saisir une petite section des méninges entourant l'hippocampe avec des pinces stériles et tirez doucement. Bien qu'il ne soit pas strictement nécessaire de retirer les méninges avant d'isoler l'hippocampe, la présence des méninges peut faire la dissection de l'hippocampe plus difficile en raison de la ténacité de la membrane. Dans les deux cas, l'hippocampe sera plus clairement visible après les méninges ont été supprimés. L'hippocampe est une structure incurvée qui commence dans la partie distale de l'hémisphère et se penche ventralement (Figure 2). Comme l'intérieur, concave, côté (caudale) est confrontée à un ventricule, il est déjà libre. Par conséquent, afin d'isoler l'hippocampe, on a besoin de couper le long du côté externe convexe. Après la dissection, soulevez doucement chaque hippocampes avec des pinces stériles tissus et le transfert dans une boîte de culture tissulaire petit chaudes (37 ° C) HBSS sous une hotte de culture cellulaire. Le tissu cérébral peuvent être combinés de multiples petits.
- Avec un scalpel stérile, les tissus du cerveau en douceur hachis dans 3 ml de HBSS stériles dans un plat de 100 mm culture de tissus.
- Transférer le tissu haché et HBSS à un tube de 15 ml conique. Ajouter 1,5 ml de HBSS et 0,5 ml de solution de trypsine à 0,25% pour un volume total de 5 ml.
- Cap et retourner doucement le tube 4-5 fois pour mélanger. Essayer d'éviter la production de bulles que l'ADN libéré à partir du tissu digéré adhère aux bulles et provoquer le tissu hachées à flotter au lieu de se fixer au fond du tube (figure 3).
- Incuber tissu hippocampique à 37 ° C pendant 15 minutes, retournant le tube comme ci-dessus toutes les 5 minutes.
- Laisser le tissu à se déposer au fond du tube.
- Soin retirer l'excès de solution à l'aide d'une pipette stérile, laissant intact le tissu au fond du tube.
- Laver les tissus culot avec 5 ml de HBSS à 37 ° C pendant 5 minutes. Répéter un total de 3 fois. Autoriser les tissus complètement réglerau fond du tube à chaque fois avant de passer à l'étape de lavage suivante.
- Retirez le lavage final à partir du culot de tissus et de le remplacer par 2 ml de HBSS frais.
4. Neuron trituration
- Avant de commencer les étapes de trituration, vous aurez besoin pour préparer polies au feu pipettes Pasteur. L'utilisation d'un brûleur Bunson, tenir une stérile à 9 pouces pipette Pasteur pointe (figure 4a) dans la flamme jusqu'à un diamètre de l'ouverture pipette est d'environ 0,5 mm de diamètre et les bords de l'ouverture pour pipettes ont été arrondis légèrement (figure 4b). Permettez-pipette pour refroidir complètement avant de commencer le processus de trituration.
- L'utilisation d'un stérile normale 9 pouces une pipette Pasteur, doucement triturer le tissu un total de 7 fois. Morceaux de tissu sont plus grandes normale à ce stade et devraient être autorisés à se déposer au fond du tube avant de passer à l'étape suivante.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube stérile de 50 ml conique.
- Autoriser tous les morceaux restants de tissus plus à se déposer au fond du tube et de combiner avec le surnageant surnageant précédente pour un total de 4 ml dissociées des cellules neuronales.
5. Plaquage portable
- Compter les cellules dissociées en utilisant un hémocytomètre.
- En règle générale, une fois le nombre de cellules ont été déterminés, il faut soustraire 20% de ce nombre définitif de rendre compte de toute la mort des cellules qui peuvent se produire après le placage.
- Les cellules peuvent être étalées en utilisant les recommandations ci-dessous:
Pour les lamelles dans une plaque à 24 puits - 6 x 10 4 cellules / puits dans 0,5 ml
Pour 60 plaques mm tissus Culture - 4 x 10 5 cellules / plaque dans 3 ml
Pour plaques de 100 mm de tissus Culture - 6 x 10 6 cellules / plaque dans 6 ml - Mélanger le nombre de cellules appropriées avec le volume indiqué des médias Placage Neurobasal (NeurobasalLes supports contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamine Solution, 25 uM de glutamate (M. 147,13 g / mol), la pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 pg / ml) [250 pi / 50 ml] , 1 mM HEPES (M. 238,3 g / mol), 10% des donateurs cheval inactivé par la chaleur du sérum) et ajouter des cellules à plaques. Plaques agiter doucement pour répartir uniformément les cellules. Sérum de cheval HI-bailleurs de fonds est ajoutée à des médias de placage pour enrichir les cellules au cours des 24 premières heures de la croissance. Les cellules sont ensuite sevrés à partir du sérum et est retourné à un environnement sans sérum par la réduction de série du sérum à chaque remplacement des médias. Il convient également de noter que, bien que le glutamate à des concentrations plus élevées est toxique pour les cultures de cellules neuronales, à des concentrations inférieures ajoutées ici, il va inhiber la fixation de cellules non-neuronales 11. Cependant, il ne devrait être ajoutée aux médias de placage pour les 24 premières heures de la culture et par la suite quitté sur un support quelconque d'alimentation afin de prévenir la neurotoxicité des cellules.
- Pdentelles neurones dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant la nuit.
- Retirez la moitié du volume des médias à partir des cellules et le remplacer par un même volume de médias d'alimentation Neurobasal (médias Neurobasal contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Solution glutamine, pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 mg / ml) [250 pl / 50 ml], 1 mM de HEPES (M. 238,3 g / mole).
- Les neurones doivent être nourris tous les 4 jours en enlevant la moitié des anciens médias et son remplacement par le même volume de Fresh Media alimentation Neurobasal. Processus neuronaux devrait commencer à être visible lors de la Journée 1 (figure 5a) et finissent par prévaloir par jour 10 (figure 5b).
6. Les résultats représentatifs
La capacité de croître et de la culture primaire des cellules neuronales est devenu un élément indispensable de la neuroscience. Les cultures primaires permettent au chercheur d'analyser les voies cellulaires spécifiques, modification chimique et de traitement, la cible loclisation et de la croissance dans un environnement contrôlé. Bon nombre de ces procédures utilisent la méthodologie sophistiquée pour visualiser les changements spécifiques dans les réponses cellulaires. Dans ce cas, neurones de l'hippocampe sont utilisées pour étudier les voies neuronales spécifiques qui se révéleraient difficile, voire impossible d'analyser dans le cerveau intact. Préparation de la proximité des populations homogènes de neurones à partir de zones spécifiques du cerveau est essentielle pour l'étude de la fonction cérébrale. Effets moléculaires dans les neurones individuels peuvent jouer un rôle dans la délimitation des voies d'ordre supérieur tels que la mémoire ou l'apprentissage. Comme ce protocole donne cultures relativement purs de neurones de l'hippocampe, sans la nécessité d'une couche nourricière de cellules gliales, ces neurones sont facilement utilisables pour les études d'immunofluorescence. Cependant, comme avec toute la culture primaire à partir d'organes contenant plusieurs types de cellules, une contamination par des cellules moins désirés peuvent se produire. Dans l'isolement de cellules neuronales, la contamination par les cellules gliales peuvent être un problème commun. Les cellules gliales cêtre facilement détecté une visualisation microscopique sur la culture en tant que leur morphologie diffère sensiblement des neurones cibles (figure 6). L'impact de la contamination par des cellules gliales dépendra de l'utilisation prévue des cultures. Si les cellules sont utilisées pour l'examen immuno-fluorescence, la contamination gliales ne peut être rien de plus qu'un désagrément lorsque vous essayez de photographier des neurones individuels. Toutefois, si les cultures de neurones doivent être utilisés pour l'analyse biochimique, toute contamination significative par les cellules gliales pourrait causer des changements majeurs dans les résultats. Moyens de répondre à la contamination de cellules gliales sont décrites plus loin dans la discussion.
Une fois que les neurones ont été isolées et cultivées avec succès dans la culture, une application typique est d'examiner les processus cellulaires immuno-fluorescence techniques. Comme l'illustre la figure 7, les organites, comme la mitochondrie, peut être teinté avec des colorants vitaux ajoutés aux milieux de culture avant de fixeration. Endogènes protéines cellulaires peuvent être visualisées à partir de cellules fixes en utilisant types immuno-fluorescence des techniques (figure 8). Une fois les cellules neuronales sont fixés, des anticorps spécifiques des protéines d'intérêt peuvent être introduits dans la cellule et ces protéines peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence. Des neurones en culture a également fournir au chercheur les moyens d'examiner les effets des protéines individuelles sur les fonctions neuronales. En utilisant une variété de techniques, y compris transfections d'ADN, l'électroporation ou de transduction virale, les protéines peuvent être surexprimé dans les cellules neuronales (figure 9). Comment neurones des cellules de répondre aux effets de la sur-exprimés protéines peut avoir des déductions directes sur la façon dont le cerveau peut répondre et vous offre la possibilité d'identifier des cibles cellulaires pour des traitements médicamenteux. Les détails de ces types d'expériences aller au-delà de la portée du présent document, mais ils ne montrent que les cultures préparés par cette technique sont adaptés à un large éventail de bas-sapplications tream. Toutefois, la simplicité globale de ce protocole, ainsi que, le court laps de temps nécessaire pour préparer ces cultures de neurones font une méthode idéale pour une utilisation en neurosciences aujourd'hui le laboratoire.
Figure 1. Dissection du cerveau de souris prénatale. La première incision est en bas de la ligne médiane du cerveau qui la sépare en deux hémisphères.
Figure 2. Localisation de l'hippocampe dans le cerveau de souris prénatale. Le striatum est déplacé de côté pour visualiser l'hippocampe et est noté par le incurvée structure "haricot" de type dans la région distale de chaque hémisphère.
Figure 3. La dissociation du tissu de l'hippocampe dans une solution de trypsine.
Figure 4. Embouts de pipette Pasteur utilisée dans la trituration de tissu hippocampique. (A) normale Pasteur pointe de pipette. (B) l'incendie poli Pasteur pointe de pipette. Prenez note des bords arrondis et la diminution d'environ 50% de la taille d'ouverture pipette.
Figure 5. Neurones de l'hippocampe isolé en utilisant cette procédure et plaqué au Nouveau-Brunswick avec les médias. La croissance des cellules (a) un jour après placage. Processus neuronaux commencent à être visibles lors de la Journée 1. (B) La croissance des cellules 10 jours après placage, neurites sont ramifiées et se chevauchent.
Figure 6. Neurones de l'hippocampe contaminés par les cellules gliales cultivées pendant 7 jours et colorées avec l'organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) et transfeDECT avec la GFP-LC3 utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Les mitochondries sont visibles dans toutes les cellules mais seulement un seul neurone a été avec succès transfectées avec la construction fluorescent. La contamination par les cellules gliales qui rend l'analyse de la GFP-LC3 expression dans les processus neuronaux difficiles à visualiser.
Figure 7. Neurones de l'hippocampe cultivées pendant 7 jours et colorées avec l'organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H 2 Xros (Invitrogen # M7513). Ce colorant vital est utilisé pour colorer les mitochondries actif dans des cellules de culture tissulaire. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde 4% / PBS et visualisés par microscopie à fluorescence. Le colorant lui-même est non-fluorescente jusqu'à oxydé dans les mitochondries. Mitochondries actif peut être vu à travers les processus neuronaux.
Figure 8.
Figure 9. L'hippocampe des cultures de neurones ont été cultivées pendant 5 jours et transfectées avec GFP-LC3β construction d'ADN en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Au jour 7, les cellules ont été fixées à l'aide de paraformaldéhyde à 4% / PBS et aggresomes avec LC3β GFP étiqueté incorporé dans leur membrane externe ont été visualisées en utilisant la microscopie à fluorescence. Aggresomes sont situés dans tout le corps cellulaire et neurites et sont indiqués par des flèches.
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Discussion
Cultures hippocampe ont été utilisés en biologie moléculaire pour plus de 20 ans. Bien qu'en principe, les cultures de neurones peuvent être fabriqués à partir de n'importe quelle partie du cerveau, l'hippocampe cultures se sont révélées être les plus populaires en raison de l'architecture relativement simple de la population de cellules nerveuses dans l'hippocampe 7. Cultures d'hippocampe sont généralement fabriqués à partir de tard-étape tissu embryonnaire. Ce tissu est plus facile de dissocier et contient moins de cellules gliales que ne le fait le tissu cérébral maturité 1. Isolement des neurones de l'hippocampe de tissu embryonnaire diminue également les dommages cisaillement à axones et des dendrites en raison de contacts d'adhésion moins de 3. Bien que les cultures d'hippocampe sont le plus souvent produite à partir de rats à cause de l'isolement relativement plus facile de l'hippocampe, chez la souris peut également être utilisé avec les mêmes protocoles de soins, si appropriées sont prises lors de l'isolement des tissus. Une fois que les neurones sont cultivés, la possibilité d'utiliser des techniques avancées moléculaires pour analyser l subcellulaireocalization et le trafic peut être utilisé. Cela peut être particulièrement avantageux lorsque l'on analyse embryonnaires létales souris transgéniques car il offre la possibilité d'étudier les interactions entre protéines qui se traduirait par la mort de l'embryon.
L'hippocampe a été impliquée dans l'apprentissage spatial et contextuel 5 et la mémoire 6. La croissance des cultures primaires de l'hippocampe peut permettre une corrélation entre subcellulaires événements biologiques et de leurs effets sur l'aptitude du cerveau à apprendre et à mémoriser.
Comme avec toutes les cellules neuronales, les neurones cultivés à partir de cultures d'hippocampe exiger des facteurs critiques de la croissance, les hormones et les acides aminés. Dans le cerveau, ces facteurs sont fournis par les cellules gliales. Cette relation symbiotique peut également être effectuée dans un milieu de culture par la croissance d'une «feeder» couche de cellules gliales avec les neurones en culture. Cependant, les cellules gliales produira également des facteurs cytotoxiques au cours de leur durée de vie 11 wUEL peuvent être toxiques pour les neurones en culture. Pour contourner cela, les neurones ont été cultivées dans un milieu sans sérum tel que le milieu Neurobasal complétée par B27. Le supplément B27 est optimisé pour la survie des neurones de l'hippocampe, mais contribuera à la croissance des autres cultures de neurones ainsi 4. L-glutamine est un acide aminé essentiel pour la production d'énergie et de la synthèse des protéines dans la culture cellulaire. Toutefois, la glutamine peut être labile au fil du temps, de se dégrader en ammoniaque et sous-produits acides carboxyliques fois ajoutés aux milieux de culture. Glutamax, un supplément de culture cellulaire de Invitrogen, peut être utilisée comme substitut direct pour la L-glutamine, si désiré. Glutamax est plus stable dans les médias, mais un peu plus cher. La croissance des neurones dans des milieux sans sérum permet l'étude des effets des facteurs de croissance et des hormones sur la croissance et la différenciation neuronale.
Nous soumettre un protocole pour l'isolement rapide des neurones de l'hippocampe à partir d'embryons de souris en utilisant les médias prénatales Neurobasal et le RECT B27ent pour la croissance des neurones dans un environnement exempt de sérum, sans l'utilisation de cellules nourricières. Comme avec tous les protocoles de culture de cellules primaires, il est avantageux de réduire au minimum la croissance de types de cellules non-désirés (c.-à-cellules gliales). Ceci est plus facilement accompli par une dissection minutieuse de l'hippocampe à partir des régions avoisinantes du cerveau. Cellules prénatales contiennent également un nombre relativement restreint de cellules gliales aidant à atteindre cet objectif. Cependant, la contamination de cellules gliales peuvent encore se produire. Il est possible de réduire la contamination de cellules gliales par traitement avec la cytosine arabinoside (AraC) à des moments précoces dans la culture 8,9. AraC peut être utilisé comme agent anti-mitotique de réduire la population de cellules non neuronales capables de synthèse d'ADN. Toutefois, pour éviter d'éventuels effets toxiques du traitement sur les neurones, il doit être utilisé à son plus bas en vigueur ne (5 uM) et non pas ajouté après 3-4 jours de la culture 11. Une autre option serait l'utilisation de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR) le traitement à décrease la proportion de fibroblastique-réactifs cellules microgliales 10.
Une fois récolté, le tissu hippocampique peut être traitée avec une solution de trypsine diluée à dissocier / désagréger les cellules adhérentes. Toutefois, une exposition prolongée à des concentrations plus élevées de la trypsine peut être préjudiciable à sous-culture de cellules tant de temps dans une solution de trypsine est le plus souvent limitée à 3-5 minutes. La concentration de la trypsine diluée utilisé dans ce protocole ne permet plus de temps d'incubation enzyme pour augmenter individuelle dissociation cellulaire, mais des précautions doivent être prises pour se conformer strictement aux points dans le temps prévu. La papaïne peut être utilisé comme une enzyme de remplacement et a été prouvé pour être plus efficace et moins destructrice avec certains tissus tels que les neurones rétiniens 10.
Dissociation cellulaire est suivie d'une trituration du tissu. Cela s'est avéré être l'étape la plus importante dans la culture neuronale cohérente et est mis en évidence par deux poin importantets. Tout d'abord, deux stériles Pipettes Pasteur sont utilisées au cours de ce processus. Le premier est utilisé pour perturber gravement les tissus / association cellulaire. La taille d'ouverture de cette première pipette doit être comprise entre 1.0-1.5 mm. Une sélection rigoureuse des pipettes directement à partir du fournisseur du package se traduisent généralement par des pipettes appropriées pour ce première trituration. La pipette seconde Pasteur utilisé est "poli au feu" sur un bec bunsen de réduire la taille de l'ouverture d'environ 0,5 mm de diamètre. Il en résulte aussi "polir" l'anneau de verre de l'ouverture à une surface plus lisse réduisant les dommages mécaniques aux cellules qu'ils traversent. Deuxièmement, la vitesse / force de trituration par le biais de la pipette est d'une importance majeure. Comme les cellules dissocier de l'ensemble du tissu, ils sont évidemment les plus fragiles. Ainsi, «rugueux» du traitement que ce point serait préjudiciable à la survie des cellules neuronales. Tissus trypsinisées devrait être repiquées dans la pipette à un débit compatible, mais ferme. Une erreur commune par ee est chercheur à l'idée d'avoir à dissocier complètement le tissu jusqu'à ce qu'il n'y a pas de structure visible restante. Dans la plupart des cas, cela se traduira dans la mort neuronale massive que les cellules seront trop endommagés par la manipulation répétée mécanique. Le nombre de fois indiqué pour passer le tissu à travers la pipette se traduira par un nombre suffisant de neurones sans qu'il en résulte des dommages brut à la population.
Une fois que les cellules ont été dissociées et mis en commun, un bleu Trypan tache d'une aliquote de cellules fournira un rapport de vivre pour les cellules mortes. Typiquement, 75-80% des cellules devrait survivre au processus de récolte et peut être utilisé pour le placage. Coloration au bleu trypan peut également être utilisé pour obtenir une numération des cellules précises lorsque vous avez terminé sur un hémocytomètre. Dans la pratique, une fois par nombre total de cellules est atteint, ajouter 20% au total et de l'utiliser le nombre de cellules pour le plaquage pour tenir compte de la quantité approximative de la mort cellulaire. Chiffres fournis dans le protocole ci-dessus sont un bon starting point à atteindre des densités de bons de neurones. Si la densité de neurones est trop faible au placage, la croissance des cellules ne sera probablement pas suffisante en tant que densité de placage est une variable importante dans la propagation de la population cellulaire. Les cellules doivent être nourris toutes les quatre jours avec les médias Flux B27/Neurobasal. La croissance neuronale dans ces conditions peut être facilement effectuée à 10-14 jours de culture et a été utilisé pour propager les neurones 2 sur 30 jours de culture quand ensemencées à 80 cellules / mm 2.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Michael Wooten pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 | |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 | |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 | |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 | |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
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