Summary
Musen innerörat är en placode-derived sinnesorgan, vars utvecklande program utarbetas under dräktigheten. Vi definierar en
Abstract
Däggdjurens inneröra har 6 distinkt sensorisk epitel: 3 crista i ampuller av båggångarna, maculae i utriculus och saccule, och Cortis organ i det hoprullade snäckan. Den crista och maculae innehåller vestibulära hårcellerna att transducera mekaniska stimuli till subserve den speciella känsla av balans, medan auditiva hårcellerna i Cortis organ är de primära givare för att höra 1. Cell öde specifikation i dessa sensoriska epitel och morfogenes av båggångarna och snäckan ske under andra veckan av dräktigheten i musen och i stort sett genomförts före födseln 2,3. Utvecklingsstudier på musen innerörat rutinmässigt utförs genom att skörda transgena embryon i olika embryon eller postnatal steg för att få insikt i den molekylära grunden för cell-och / eller morfologiska fenotyper 4,5. Vår hypotes är att genöverföring till utvecklingsländerna musen innerörat i livmodern </ Em> i samband med vinst-och förlust av funktion studier är en gratis sätt att traditionella musen transgenes för förhör av de genetiska mekanismerna bakom däggdjur innerörat utveckling 6.
Den experimentella paradigm att genomföra undersökningar gen misexpression i utvecklingsländerna musen innerörat visas här löser i tre allmänna steg: 1) ventrala laparotomi, 2) transuterine mikroinjektion, och 3) in vivo elektroporation. Ventral laparotomi är en mus överlevnad kirurgisk teknik som tillåter utläggning av livmodern för att få experimentell tillgång till de implanterade embryon 7. Transuterine mikroinjektion är användningen av fasade, glas kapillära mikropipetter att införa expressionsplasmid in i lumen av den otiska vesikeln eller otocyst. In vivo elektroporering är tillämpningen av fyrkantvågen, direkta strömpulser för att driva expression plasmid i progenitorceller 8-10.
11. Mus experimentella embryologiska tekniker kan vara svårt att lära av prosa och stillbilder ensam. I föreliggande arbete visar vi de 3 stegen i genöverföring förfarandet. Mest kritiskt, distribuera vi digital video mikroskopi för att visa exakt hur du: 1) identifiera embryo orientering i livmodern, 2) omorientera embryon för inriktning injektioner till otocyst, 3) mikroinjicera DNA blandas med spårämne färglösning i otocyst på embryonala dagar 11,5 och 12,5, 4) elektroporera den injicerade otocyst, och 5) etikett elektroporerade embryon för födsel urvalet vid födseln. Vi erbjuder representativa exempel på framgångsrikt transfekterade inre öron, en illustrerad guide till de vanligaste orsakerna till otocyst mistargeting, diskutera hur man kan undvika gemensamma metodologiska fel, och presentera riktlinjer för att skriva en i livmodern gENE transfer djurvård protokollet.
Protocol
1. Ventral Laparotomi
- Bedöva en damm vars embryon är på embryonala dag 11,5 (E11.5, kl dagen en vaginal plugg upptäcks är dag 0,5 av embryonal utveckling) genom intraperitoneal injektion av natrium pentobarbital anestesi-lösning (7,5 pl per gram kroppsvikt). Arbetar bedövningslösning: 180 | il av 50 mg / ml pentobarbitalnatrium lösning; 100 | il absolut etanol, 320 | il av 65 mg / ml vattenhaltig magnesiumsulfat (modulerar uterin ton), och 400 | il av propylenglykol (vehikel blandbar med vattenbaserade och organiska komponenter).
- Utvärdera fullständighet av anestesi genom att utföra skadliga stimuli tester: tassen squeeze, svans nypa och blinkar svar på kinden och vibrissae touch. Applicera sterilt oftalmisk salva till hornhinnor.
- Raka buken päls från suprapubisk området till bröstkorgen med sax och böter blad (Oster # 40 blad). Desinficera buken med 70% etanol, 10% povidonjod (Betadine), ennd 70% etanol, sekventiellt. Placera musen buken nedåt på en steril duk och ställ sedan in på en värmedyna eller varm platta (37 ° C) för 2-5 minuter.
- Incisionsfilm buken huden i ventrala mittlinjen med bollen spets sax. Utöka snittet i 10-14 mm. Identifiera linea alba, en avaskulär, vit bindväv bandet längs den ventrala mittlinjen av bukväggen. Incisionsfilm linea alba med boll tippade sax och utöka snittet 10-14 mm. Omedelbart spola buken med förvärmd (37 ° C) lakterad Ringers lösning.
- YTTRE de två hornen i livmodern med ringen pincett utan att alltför stort tryck på implantationsställen. Skölj de externaliserats livmoderhornen med förvärmt, laktat Ringers lösning.
2. Transuterine Mikroinjektion
- Tillverka en tjockväggig, borosilikatglas kapillär mikroinjektion pipett med följande egenskaper: 12-16 μm ytterdiameter och en 20 graders avfasning. På en Sutter P-97 pipett avdragare med liten box glödtråd, använd följande program: värme = ramp testet plus 3 enheter, tryck = 200; dra = 0; hastigheten = 46, tid = 100). Med Sutter BV-10 beveler använder 104C (guld) slipskiva för stora diameter pipetter. Återsuspendera expressionsplasmid vid 3-4 pg / pl i kalciumfri fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,2-7,4). Lägg kristallint fast grönt i koncentrerade DNA, vortex försiktigt i 30 sekunder, och snurra vid 10.000 g under 10 sekunder. Den minimala mängden av snabb grönt erfordras för att visuellt följa effekten av injektionen bestäms empiriskt. Återfyllning det avfasade pipetten med DNA / snabb grön lösning. Ansluta den laddade mikroinjektion pipetten till pipetten innehavaren av trycket injektor (Picospritzer användning> 99% rent kväve som källgas).
- Transilluminate livmodern med låg intensitet, halogen ljus för att visualisera embryot inom dess implanteringsställe. Identifiera beating hjärta, hjärna blåsor, knoppar lem och begynnande 4: e ventrikeln av bakhjäman och ögon. Spola livmodern varje 2 minuter med förvärmd, lakterad Ringers lösning för att bibehålla hydratisering. Tryck lätt på livmodern att omorientera embryot och identifiera de anatomiska landmärken ovan.
- Orient embryot för att identifiera den primära huvudet venen, vars främre och bakre grenar flankerar mesenkymala territorium där otocyst bosatt. Den otocyst rätta kan inte ses av genomlysning av livmodern. Den otocyst ligger mitt emellan de främre och bakre grenar från den primära huvudet ven som, tillsammans med huvudstammen av venen bildar formen av stolparna eller målstolparna på en amerikansk fotbollsplan. Den otocyst är halvvägs mellan stolparna.
- Sätt i injektionspipetten genom livmodern i en bana i överensstämmelse med det presumtiva placeringen av otocyst. Pulsa mikroinjektor gång efter att ha passerat genom den uteross att visualisera spårämnet färgämnet och den ungefärliga placeringen av pipett-spets. För fram pipetten i mikrometer kontroll och puls igen för att bedöma djupet. Ytterligare föra pipetten i den laterala huvudet mesenkymet och puls upprepade gånger. Framgångsrik otocyst inriktning kommer att avslöja avsmalnande form endolymfatisk kanalen dorsalt och pilgrimsmussla skal-form absiden. Släpp trycket på livmodern, ta pipetten från embryot / livmodern i en rörelse, och omedelbart spola livmodern med förvärmda, lakterad Ringers lösning.
3. In vivo elektroporering
- Skölj livmodern med lakterad Ringers lösning. Nyligen applicerade lakterad Ringers lösning är det nödvändigt att elektriskt koppla de paddel-liknande elektroder till livmodern. Fukta volfram ytorna av elektroderna med lakterad Ringers. Centrera injiceras otocyst i banan för elektroderna. Försiktigt ihop livmodern med elektroporering paddles. Katoden är i kontakt med livmoderväggen lateralt till injiceras otocyst och anoden är i kontakt med livmoderväggen intill den oinjicerade otocyst. Utlösa en kvadratisk tåg våg puls med fotpedal brytaren på elektroporator. Elektroporering parametrar är: 5, 50 ms pulser vid 43 volt per puls och en 950 msek mellanpulsintervall fördröjning. Spola genast livmodern efter att pulståget avges. Anteckna strömmen levereras till vävnaden: 60-100 mAmps är tillräcklig för att transfektera öron epiteliala stamfäder. Injicera och elektroporera 4-6, E11.5 embryon per dammen.
- Utföra en andra, oberoende transuterine mikroinjektion av vattenhaltig fluorescerande dextran (Alexa Fluor 488 om uttrycket plasmid kodar en röd fluorescerande protein eller Alex Fluor 594 om uttrycket plasmid kodar ett grönt fluorescent protein) i 4: e ventrikeln av dessa embryon, vars inre öron är exakt injiceras och minst 60 mAmps aktuella per puls var delevererats under elektroporering. Den fluorescerande dextran kommer att upptäckas vid födseln i bakhjäman och möjliggöra val av ungar vars inre öron manipuleras under embryogenes (se 3,5).
- Skölj livmoderns hornen med lakterad Ringers. Sätt i livmoderhornen i bukhålan. Spola livmoderkaviteten med 2-4 ml av förvärmd, lakterad Ringers lösning och tillåter överströmningsöppningen rinna ut ur snittet på sterila duken. Byt draperingen med torr, sterilt material. Suturera bukväggen med en icke-skärande nål och en 6-0 resorberbar sutur. Vi föredrar en rakstygn, låsa alla andra stygn, för både bukväggen och huden.
- Torka dammarna pälsdjur och administrera en icke-steroid anti-inflammatorisk, såsom Meloxicam genom subkutan injektion. Återgå dammen till förvärmda återhämtningen buren på en steril duk. Övervaka och registrera dammar kallad konventionen respirations och incisionsstället öppenhet, och slidan blodiga flytningar. Blödning är rare men om närvarande och oförminskad, euthanize dammen medan hon fortfarande är under narkos. Notera den tid hon återfår medvetandet och försök att pendla. Återgå dammen till musen kolonin när hon visar tecken på att äta och dricka och har börjat bygga bo bygga. Normalt sker detta inom 12 timmar.
- Vid födseln (postnatal dag 0), ställ Flash bakhjäman regionen varje valp i kullen att upptäcka fluorescerande dextran med en stereofluorescence dissektionsmikroskop med GFP eller Texas Red filter som är lämpligt. Återgå till ammande dammen endast de ungar som visar bakhjäman märkning.
4. Representativa resultat
Figur 1. Elektroporering genöverföring till att utveckla snäckan. Den E11.5 otocyst injicerades med en expressionsplasmid som kodar förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) och elektroporerades (puls trai parametrarna: fem, 43 volt pulser vid 50 msek / puls och 950 msek mellanpulsintervall fördröjning). A) En representant innerörat från en postnatal dag 6 (P6) PUP, vars otocyst injicerades, och elektroporerades vid E11.5 visa EGFP uttryck från basen genom mitten av koklea. Den laterala väggen hos snäckan avlägsnades från den mittre kröken och spetsen endast. E11.5 stamfäder som ger upphov till spetsen inte transfekterades. B) Hela monteringen immunfärgning av koklea i (A) med håret cellmarkör, indikerar myosin 7a (MYO7A), som EGFP uttryck följer banan för Cortis organ och är grovt lokaliserade på håret cellbärande sensoriska epitelet. C) En representant innerörat från E18.5 embryo, vars otocyst injicerades, och elektroporerades vid E11.5. Lasern konfokala prognosen visar EGFP uttryck i MYO7A-positiva sensoriska hårceller. D) Laser konfokal projektionen av cochlea sensoriska epitelet från E18.5 Cortis organ visar EGFP expression i de inre hårcellerna (IHC), yttre hårceller (OHC) inre phalangial celler (IPC), pelaren celler (PC), och Deiters 'celler (DC). Skalstrecket i (B) omfattar (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genöverföring till utvecklingsländerna musen innerörat: Musen Innerörat utvecklas från örat placode under den första veckan av implantationen utvecklingen 12,13. Genom embryodag 9,5 (E9.5) har placode invaginerade och förvandlats till en vätskefylld blåsa kallas otocyst 2. Öron prekursorer i vesikeln ger upphov till sensoriska och nonsensory celler i mogna innerörat samt nervceller som innerverar mekaniskt känsliga hårceller i vestibulära och auditiva sensoriska epitel. Av sena embryonala stadier, är komplex, 3-dimensionella morfologi membranös labyrint innerörat etablerade 3,12. Gain-och förlust-of-funktion experimentella metoder vanligen utförs av musen transgenes att få insikt i den genetiska regleringen av utvecklingsprocesser såsom cell öde specifikation och mönster bildas. Dynamisk genetisk manipulation av att utveckla musen innerörat iutero är en gratis sätt att musen transgenes att par genöverföringstekniker med musen experimentell embryologi 6,11.
Virus-och elektroporering genöverföring har utvecklats för att manipulera genexpression i u innerörat 6,11,14,15. Adenoassocierade virala (AAV) vektorer infekterar otiska progenitorer som ger upphov till sensoriska och nonsensory celltyper och har använts för att avfråga den molekylära grunden för kalcium-beroende exocytos i musceller hår 16. AAV vektorer ger höga halter som möjliggör ett brett uttryck i innerörat och olika virala serotyper visa unika tropism som kan vara fördelaktiga för differentiell cellulär uttryck. Nackdelar innefattar en fast fyllning kapacitet som begränsar storleken av genen som kan misexpressed och kravet på virologiska expertis för att göra, rena och titrera virusen. Elektroporering-medierad gen transfer har använts för att utvärdera rollen av en basisk helix-sling-helix-transkriptionsfaktor att specificera sensorisk ödet hårcell in vivo 6. Expressionsplasmider anpassade för gateway subkloning teknik medger snabb och effektiv konstruktion av vektorer med unika promotorer som driver uttryck av en gen av intresse och en fluorescerande markör-protein från en IRES-sekvens 17. Gener av intresse kan uttryckas i öron prekursorer inom 24 timmar från elektroporation och uttryck kan kvarstå under den postnatala innerörat beroende på vilken promotorn. Plasmidkonstruktion, rening, koncentrering, och kvantifiering kräver endast vanliga molekylärbiologiska färdigheter. Nackdelar innefattar minskad in vivo transfektionseffektivitet som plasmid storlek ökar över ~ 8KB och en högre grad av embryonal dödlighet jämfört med de flesta virala vektorer. Både elektroporering-och virus-medierade gen tekniker överföring kräver behärskning av mus experimentell embryologisk Techniques: överlevnad kirurgi, in utero hantering av embryon och transuterine mikroinjektion. Målet med detta manuskript är att ta den senare frågan genom att visa varje kritisk metodologiska steg digital video mikroskopi.
Metodanmärkningar på videon: Vi valde medvetet att inte drapera snittet platsen med sterila området under inspelningen så att betraktaren kan se positionen av den ventrala mittlinjen i förhållande till brutto anatomi dammen, dvs huvudet (avsiktligt otydlig i de flesta ramar, men igenkännbara), lemmar och svans. Drapering snittet sidan effektivt blockerar denna syn och kan förbrylla försök att uppskatta rumsligt relevanta anatomiska förhållanden under ventrala laparotomi och en injektion sekvens. Vi rekommenderar dock drapering buken av dammen så att externaliserats livmoderhornen vilar på ett sterilt område för att upprätthålla kirurgisk aseptik. Dessutom har vi medvetet inte försöka demonertrate suturering av kirurgiska snitt i bukväggen och huden eftersom dessa metoder måste läras genom sakkunnig ledning av en veterinär eller kvalificerad kirurgisk tekniker. Dr Marcel I. Perret-Gentil (University of Texas at San Antonio) presenterar en utmärkt diskussion av detta ämne, komplett med bildframställningar i sin handout "Principles of Veterinary suturering." 18
Processuella rekommendationer: genöverföring till utvecklingsländerna musen innerörat är tekniskt utmanande. Det finns en rad av de bästa metoder som kommer att eliminera en stor mängd variationer och säkerställa ett lyckat resultat. Vi gör särskilda rekommendationer nedan för att underlätta inlärning denna experimentella strategi.
Konsultera veterinär personal för att utveckla musen överlevnad operationen protokollet djurvård: Den djurvård protokollet för däggdjur överlevnad kirurgi kräver att tillverka, eftersomanestesi, analgesi och perioperativ vård måste definieras och samordnas. En detaljerad diskussion av djurvård protokollet utveckling, inklusive språk som kan bilda kärnan i en sökandes protokoll, finns som kompletterande information (se " Animal Care Protocol Development "). Dessutom kommer ditt hem institutionernas Animal Care and Use Committee (lACUC) och veterinärpersonal ger utan tvekan ytterligare vägledning om utformningen av ett lämpligt protokoll på begäran.
Upprätta en särskild mus område överlevnad operation i livmodern genöverföring: Ventral laparotomi är klassificerad som en större operation, eftersom det äventyrar en kroppshålighet. De flesta IACUCs kommer inte att kräva en steril, klass 100 miljö för större musen överlevnad operation. Snarare finns en särskild område som korrekt belysning, ventilationning, kompletterande uppvärmning och hårt, kommer icke-porös, desinficerbara virus ytor sannolikt att krävas. Vi föredrar att bedriva vår överlevnad kirurgi i ett horisontellt laminärt flöde huva som skyddar musen från smitta, minskar fysiologisk stress, och därmed lokaler postoperativ återhämtning. Vi har definierat ett antal egna ändringar en oscillation-dämpad, horisontellt laminärt flöde (Envirco LF 630) som inkluderar riktad, låg effekt belysning halogen spår; utökad elektriska kretsar för att driva genöverföring utrustning, och infällda eluttag med stansning bänkskiva för passagehålighet för en sladd. Ett detaljerat schema av dessa modifieringar ges som kompletterande information (se " Hood laminärt flöde i Utero Gene Transfer "). Kontakta din lACUC när du utvecklar din protokollet djuromsorg för att definiera en lämplig plats som är avsedd enbart till mus survival kirurgi.
Väg dammen till närmaste 0,1 gram före administrering natriumpentobarbitalanestesi: Natrium pentobarbital är ett effektivt bedövningsmedel och kommer att ge minst 105 minuter arbetstid när den rekommenderade doseringen schemat följs. Bestäm ett exakt kroppsvikt för varje damm vid beräkningen av den dos av bedövningsmedlet blandningen till injicera. Aldrig uppskattar vikten dammen kropp. Använd Allergi sprutnålen fack och spruta från Becton Dikison: den mänskliga intradermala avfasningen är idealisk för atraumatic intraperitoneala injektioner i dräktiga möss. Dessutom har denna spruta en extremt låg dödvolym volym och är kalibrerad för intervallet anestetiska volymer typiskt krävs för dammar vars embryon vid E11.5 eller E12.5.
Distribuera profylaktisk analgesi för att stödja överlevnad av embryo: Administrera en bedövningssalva på suturen linjen, till exempelBupivicaine och en systemisk, icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, såsom Meloxicam, innan placering av dammen i återhämtningen buren så att analgetika finns ombord vid tidpunkten dammen återhämtar sig från anestesi. Att minska obehag i dammen underlättar postoperativ återhämtning och underhåll av en hälsosam graviditet.
Sneda mikroinjektion pipetter och tätt begränsar den yttre diameter: Den enskilt vanligaste orsaken till embryonal dödlighet är vävnad och / eller vaskulär skada från dåligt konstruerade mikroinjektion pipetter. Transuterine mikroinjektion i E11.5 musen otocyst bär olika begränsningar än injektion i större organ hos äldre embryon (dvs. hjärnan blåsor, ögon, hälsa, etc.). Unbeveled, dåligt avfasade eller felaktigt stora yttre diameter pipetter kommer att orsaka blödning från fartyg i livmodern, den viscerala gulesäcken kärlsystemet, och / eller embryonal vid E11.5, vilket kommer att minska embryo överlevnad. Det är möjligtatt för hand bryta varaktiga pipetter med liten diameter som bär en lämplig fasning, men det är svårt att göra så rutinmässigt. Den E11.5 musembryo, vars lilla otocyst är målet, kommer att vara oförsonliga. Konsultera P-1000 P-97 Pipettera Cookbook 2011 från Sutter Instrument för en hel diskurs om pipett design och tillverkning 19. Parametrarna för pipetterna användes i detta arbete är som angivits ovan och deras framställning har fullständigt beskrivits tidigare 11. De processuella anteckningar i ägarens manual för Sutter Instrument BV-10 beveler är också en utmärkt resurs.
Förstå varför mistargeting den otocyst med transuterine mikroinjektion inträffar: Videon en idealisk utfallet för transuterine mikroinjektion i E11.5 och E12.5 otocyst. Mistargeting i otocyst oftast resulterar från att injicera för ytligt, för djupt, eller från otillräckligt påhittade pipetter. Figur 2 visar dessa betingelser. PanelA visar en sidovy av den vänstra sidan av en E12.5 embryon förses med bild genom genomlysning efter framgångsrik transuterine mikroinjektion av snabb grön lösning in i otocyst. Bakhjäman (Hb) visas som en kil-formad skåra dorsala till otocyst. Ögat (e) har en ring av pigment längs dess periferi och den vänstra frambenet är framträdande. Huvudstammen av den primära huvudet ven (PHV) är precis under otocyst. Den otocyst är fylld med snabba gröna som visas svart: ryggstycket kan endolymfatisk kanal (ED) och vestibul av otocyst (OC) urskiljas. Framgångsrik inriktning av E11.5-12.5 otocyst kommer alltid presentera ett tydligt urskiljbar endolymfatisk kanal och absid. Panel A "visar samma bild som i A utan den vita märkningen för att underlätta kritisk granskning av den injicerade otocyst.
Figur 2. En illustration guide till mistargeting den otocyst genom transuterine microinjecning. Alla paneler visar den vänstra lateral vy av en E12.5 embryon med mitthjärnan upp och framhjärnan vänster, med undantag panel H, som är en dorsal vy av bakhjäman-mitthjärnan regionen. Paneler i varje rad representerar bilder av samma embryo. Se diskussionen för en detaljerad förklaring av orsakerna till otocyst mistargeting. Förkortningar: e, vänster öga, ED, endolymfatisk kanal, fg, snabb grön, HB, bakhjäman, LB, lemanlag, oc, otocyst, ot, öron territorium, p, pipett, PHV, primär huvudet ven, pt, pipett.
Ytlig injektion är en vanlig orsak till mistargeting. Panelerna visar en ytlig injektion i E12.5 befruktade ägg. Den bakhjäman (hb) hack och öron territorium (ot, cirkel) är uppenbara i denna vänster lateral vy. Den mikroinjektion pipett (p) är i förgrunden. Fast Green (fg) börjar mata ut från pipettspetsen (B), och med efterföljande pulser från trycket injektor (CD), färgämnet diffunderar in i en oval-form. Fördelningen av the färgämne föreslår att det infördes mellan livmoderväggen och viscerala gulesäcken, ett extraembryonic membran som omsluter exocoelomic kaviteten. Försöksledaren ska inte försöka på nytt rikta otocyst i detta embryo men bör gå vidare till nästa embryot. Flera injektioner korrelerar med minskad överlevnad av embryo, en effekt som är mer akut i E11.5 än E12.5.
Djup injektion är en vanligare orsak till mistargeting. Paneler FH visa en injektion bana som passerar genom örat territoriet i bakhjäman. Den primära huvud ven (Phv), vänster öga (E), och pipetten (p) är uppenbara i denna vy från sidan av en E12.5 embryon. Den initiala utstötning av snabb grönt (fg) förskjuts dorsalt i förhållande till den primära huvud venen / otisk område. Med efterföljande pulser, var det kilformade bakhjäman (Hb) är helt fylld med snabb grönt (panel G). En 90 graders rotation av den injicerade embryon tillåter detektering av snabb grönt inom hindbrai håligheten från den dorsala vy (panel H). Både ytlig och djup injektioner resultat av oförmågan att uppfatta djupet hos mikroinjektion pipetten efter den kommer i kontakt med livmodern. En praktisk metod som fungerar bra är att främja pipetten genom livmodern och sedan omedelbart puls en gång för att leta efter en puff av snabb green: plats för puff visar det ungefärliga läget av pipettspetsen. Justera djup baserat på detta område-fynd puls.
Otillräckligt tillverkade pipetter är den vanligaste orsaken till mistargeting. Injektionen försöket visas i paneler IK utfördes med en pipett spets som manuellt bröts, men inte skev. Den sidovy av E12.5 embryon visar bakhjäman (Hb), vänster öga (E), och den mikroinjektion pipett (p). Notera att pipettspetsen (PT) är kraftigt böjd och har misslyckats med att penetrera livmodern (panel I). Applicering av ytterligare kraft skjuvar spetsen av pipetten (panel J, pil), som lämnar pipette spets inbäddad i livmodern. En liten mängd fast green (fg) sköts ut från den brutna pipett och har upptäckt ytan av livmodern. Den inbyggda pipettspetsen (Panel K) måste avlägsnas med fina, steril pincett och kasseras som vassa föremål avfall. Om pipettspetsen inte kan lokaliseras eller tagits bort, euthanize dammen under anestesi.
Dokumentera processuella synpunkter på en mus överlevnad operation datablad: En avgörande faktor för att lära sig dessa metoder är att dokumentera observationer och gör justeringar baserat på dessa synpunkter. Producera en mus överlevnad operation datablad och notera preoperativ, operativ och postoperativ information. Preoperativa uppgifter omfattar dammen vikt, dos av bedövningsmedlet levererade, plasmid injicerade, etc. Operativa uppgifter inkluderar embryot injicerade (dvs R2 är den andra embryot från äggstocken i rätt livmoderhom), kvaliteten på injektionen (dvs ingen endolymfatisk kanal upptäcks färg i 4
Använd aktuell levereras per puls för att optimera transfektionseffektiviteten: Den fyrkantpuls tåg består av 5, 43volt och 50 ms pulser med en 950msec blandpulsfördröjning. Den 5mm platina, paddla stil elektroder se till att hela örat territoriet finns i det elektriska fältet. Liknande transfektionseffektivitet kan uppnås med 3 mm paddlar, även om de är svårare att exakt positionera. Pulsen paradigmet optimerades genom att utvärdera den aktuella överförda till embryot under den slutliga puls, inte genom att svepa genom spänningar och bedömning transfektionseffektivitet. Den logiska grunden är att strömmen som levereras per puls varierar med konstant spänning beroende på öppenheten hos elektrisk koppling mellan livmodern och elektroderna platina. Förutsatt att livmodern nyligen bevattnas med laktat Ringers lösning omedelbart före placera paddlar och laddningsbärare är närvarande i överskott, är den främste varierande mängden "koppling" tryck appliceras på livmodern med paddlar. Lätt tryck på 43volts resulterar i <60mAmps av aktuell leverans och sporadiska transfektion i bästa fall. Måttligt tryck på 43volts resulterar i 60-100mAmps levereras och den mest effektiva transfektion. Hårt tryck på 43volts resultat i> 100mAmps levereras och korrelerar med ihållande förändras hjärtfrekvens och ökad embryonal dödlighet. Övertryck spräcker den viscerala gulesäcken (ett "pop" kan kännas genom paddlar) och orsakar embryonal dödlighet. Det är troligt att den variabla tryck som appliceras förändrar impedansen mellan elektroderna som påverkar den aktuella levererade. Pulsen frekvens av 1 Hz (en 50 millisekunders puls per sekund) definierades som den minst söndrande till embryots hjärtcykeln, som är en positiv korrelation för embryo-överlevnad. Vi drar slutsatsen att den mest avgörande parameter för att övervaka att etablera en effektiv in vivo elektroporering paradigm är strömmen som levereras per puls. Ändring av någon puls paradigm bör omfatta noggrann övervakning av det aktuella levereras per puls.
Anta en modulbaserad metod att lära the teknik: Modul 1: Öva en bluff kirurgi med livmodern utläggning, men inte injicera eller elektroporera. Dammar klarar ventral laparotomi mycket bra och bör aldrig uppleva postkirurgiska komplikationer i samband med kirurgisk teknik. Mus överlevnad kirurgiska färdigheter utan tvekan bosatta i hemmet företag så bedriva adekvat utbildning. Uppnå behärskning av kirurgisk kompetens innan du fortsätter. Modul 2: Öva transuterine mikroinjektion i otocyst på en sövd damm utan förväntningar slutföra överlevnad kirurgi: euthanize dammen under narkos, isolera injicerade embryona, och utvärdera kvaliteten på de otocyst injektionerna. Modul 3: Rikta bara 2 otocysts i 2 olika embryon med snabb grön, inte elektroporera, fyll i kirurgi, och validera nedströms embryonala överlevnad. Modul 4: Rikta bara 2 embryon med DNA / snabb grön lösning, elektroporera, validera nedströms överlevnad av embryo, och fastställa transfektionen eftivitet. Modul 5: Rikta bara 2 embryon med DNA / snabb grön lösning, elektroporera, injicera Alexa Fluor i 4: e ventrikeln att märka manipulerade embryot, välj märkta embryon vid P0, och fastställa transfektionseffektiviteten.
Processrätt inlärningskurva: behärskning av kirurgi mus överlevnadsteknik, med lämplig vägledning från veterinär och kirurgisk personal en hem institution, är ganska snabb och enda som bör krävas 3-5 dammar ett värde av praxis för nybörjare att få expertis. Transuterine mikroinjektion och in vivo elektroporering att generera nytta transfekterade inre öron kommer att kräva 10-50 dammar-värde av ansträngning, förutsatt att det finns 6 fungerande embryon per graviditet och det modulära tillvägagångssättet följs. De studenter som tycker aktiviteter som kräver finmotorik (dvs. spela ett musikinstrument, sömnad, modell-making, eller konkurrerande friidrott) har kortare utbildning perioder än thosig som inte gör det. De kritiska korrelat för framgångsrik behärskning av dessa metoder är noggrann uppmärksamhet på detaljer (dvs. mikroinjektion pipett tillverkning, vaskulär anatomi, explicit anteckningar) och en någorlunda lugn väsen.
Arbetsflöde: När expertis som gjorts, kan man förutse injicera och elektroporera 4-6 embryon per dammen, 3-5 embryon kommer att överleva, och 2-4 embryon kommer att ha nytta transfekterade inre öron för analys. Den bakhjäman Alexa Fluor märkning teknik för att märka embryon för sortering vid födseln kräver ytterligare bakhjäman injektion i varje elektroporerades embryo, men detta tolereras väl och inte negativt påverkar förfaranden effektivitet. Således jämför återvinningsgraden av fördel transfekterade inre öron från in vivo elektroporering positivt till återvinningsgraden av homozygota muterade mössen från en heterogygous avel paradigm. Med erfarenhet, är 2-3 dammar per försöksledaren per dag en rimlig arbeteflöde: 1,5 timmar per dammen för kirurgi och totalt 1,5-2 timmar för postoperativ övervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Humana Press om tillstånd att publicera mikroinjektion siffran pipetten tillverkning som ursprungligen fanns på sidan 130 av referens 11, Larry Dlugas och Steven Wong, OHSU Institutionen för beteendevetenskapliga meddelanden, Videografi, Larry Dlugas för video design och redigering, Adam M. O "Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco för att utforma våra kunder horisontellt huven laminärt flöde och Les Goldsmith för att tillhandahålla tekniska schematiska, Victor Monterroso, MV, MS, PhD och Tom Chatkupt, DVM, OHSU Institutionen för jämförande medicin, för vägledning med vår djuromsorg protokoll, kirurgiska tekniker, och profylaktiska analgesi regim, Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, för att dela hans handout om veterinära suturering teknik, Edward Porsov, MS, för att utforma våra Adobe Premiere Pro video arbetsstation mikroskopi dator, och Leah Vit och jonas Hinckley av LNS textning (Portland, OR). Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute on Dövhet och Other Kommunikationsproblem: DC R01 008.595 och DC R01 008.595-04S2 (till JB) och P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Kärna Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
