Summary
Musen indre øre er et placode-afledt sanseorgan, hvis udviklings-program er udarbejdet under svangerskabet. Vi definerer en
Abstract
Pattedyr indre øre har seks særskilte sensoriske epithel: 3 cristae i ampuller af de halvcirkulære kanaler, maculae i utricle og saccule og det cortiske organ i den opspolede cochlea. Den cristae og maculae indeholder vestibulære hårceller, som transducerer mekaniske stimuli til subserve den særlige følelse af balance, mens auditive hårceller i organet for Corti er de primære transducere for at høre 1. Cell skæbne specifikation i disse sensoriske epitel og morfogenese af de halvcirkelformede kanaler og cochlea finde sted i den anden uge af svangerskabet i musen og er stort set fuldført før fødslen 2,3. Udviklingsmæssige undersøgelser af mus indre øre rutinemæssigt udføres ved at høste transgene embryoner på forskellige embryoniske eller postnatal trin at få indsigt i den molekylære basis for cellulær og / eller morfologiske fænotyper 4,5. Vi hypotesen, at gen-overførsel til udviklingslandene musen indre øre in utero </ Em> i forbindelse med gevinst-og tab af funktion undersøgelser repræsenterer en gratis tilgang til traditionel mus transgenese for afhøringen af de genetiske mekanismer bag pattedyr indre øre udvikling 6.
Den eksperimentelle paradigme at gennemføre gen misexpression undersøgelser i udviklingslandene mus indre øre vist her opløser i tre generelle trin: 1) ventrale laparotomi, 2) transuterine mikroinjektion og 3) in vivo elektroporation. Ventrale laparotomi er en mus overlevelse kirurgisk teknik, der tillader udlægning af livmoderen for at få eksperimentelle adgang til de implanterede embryoer 7. Transuterine mikroinjektion er anvendelsen af affasede, glas kapillære mikropipetter til at indføre ekspressionsplasmid ind i lumen af otisk vesikel eller otocyst. In vivo elektroporation er anvendelsen af firkantbølge, direkte strømimpulser til at drive ekspression plasmid i progenitorceller 8-10.
11. Mus eksperimentelle embryologiske teknikker kan være svært at lære af prosa og stillbilleder alene. I det foreliggende arbejde, viser vi de 3 trin i gen-transfer. Mest kritisk, vi implementere digital video mikroskopi for at vise præcis, hvordan man: 1) at identificere embryo orientering i livmoderen, 2) drej embryoner til målretning injektioner til otocyst, 3) microinject DNA blandet med sporstof farvestof opløsningen i otocyst på embryonale dag 11.5 og 12,5; 4) elektroporere den injicerede otocyst og 5) label elektroporeret embryoner til postnatal valg ved fødslen. Vi leverer repræsentative eksempler på succes transficeret indre ører, en billedlig guide til de mest almindelige årsager til otocyst mistargeting, drøfte, hvordan man kan undgå fælles metodologiske fejl, og de nuværende retningslinjer for at skrive en in utero gØNØ overførsel dyrepleje protokol.
Protocol
1. Ventrale Laparotomi
- Bedøve en dæmning, hvis embryoner på embryonisk dag 11,5 (E11.5, middag den dag en vaginalprop detekteres er dage 0,5 embryonisk udvikling) ved intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital anæstetisk opløsning (7,5 pi per gram kropsvægt). Arbejder anæstetisk opløsning: 180 pi 50 mg / ml natriumpentobarbital opløsning, 100 uL absolut ethanol, 320 pi 65 mg / ml vandig magnesiumsulfat (modulerer uterin tone) og 400 pi af propylenglycol (køretøj blandbart med vandig og organisk komponenter).
- Vurdere fuldstændigheden af anæstesi ved at foretage skadelige stimuli test: Paw squeeze, hale knibe, og blink reaktion på kinden og vibrissae touch. Anvendes sterile oftalmiske salve til hornhinder.
- Barber den abdominale pels fra suprapubic området til brystkassen med saks og et fint blad (Oster # 40 klinge). Desinficere maven med 70% ethanol, 10% povidon-iod (Betadine), ennd 70% ethanol, sekventielt. Placer muse maven nedad på et sterilt forklæde og derefter indstille på en varmepude eller varm plade (37 ° C) i 2-5 min.
- Incise bughuden i ventrale midterlinjen med kugle-tippes saks. Udvid snit til 10-14 mm. Identificere linea alba, et avaskulært, hvid bindevæv bånd langs den ventrale midterlinie af den abdominale væg. Incise linea alba med bolden tippes saks og udvide incisionen 10-14 mm. Umiddelbart skylles abdomen med forvarmet (37 ° C) lakteret Ringers opløsning.
- Eksternalisere de to horn i livmoderen med ring pincet uden at bruge stort tryk på de implantationssteder. Overrisling af eksternaliserede uterine horn med forvarmet, lakteret Ringers opløsning.
2. Transuterine Mikroinjektion
- Fabrikere en tykvægget, borosilikatglas kapillær mikroinjektion pipette med følgende karakteristika: 12-16 μm udvendige diameter og en 20 graders hældning. På en Sutter P-97 pipette aftrækker med lille boks glødetråd, skal du bruge følgende program: varme = rampetest plus 3 enheder; tryk = 200; trække = 0; hastighed = 46; tid = 100). Med Sutter BV-10 beveler, skal du bruge 104C (guld) slibeskive for stor diameter pipetter. Resuspender ekspressionsplasmid ved 3-4 ug / ul i calciumfrit phosphatbufret saltvand (pH 7,2-7,4). Tilsættes krystallinsk fast green til den koncentrerede DNA, vortex forsigtigt i 30 sekunder, og spin ved 10.000 g i 10 sekunder. Den minimale mængde fast green kræves til visuelt spore effektiviteten af injektionen bestemmes empirisk. Efterfylde skrå pipetten med DNA / fast green opløsning. Forbinde den fyldte mikroinjektion pipetten pipetten indehaveren af trykket injektor (Picospritzer anvendelse> 99% rent nitrogen som kilde gas).
- Transilluminate livmoderen med lav intensitet, halogen lys for at visualisere embryo under dens implantationsstedet. Identificer beaTing hjerte, hjerne vesikler, lem-knopper og spirende 4. ventrikel i baghjerne, og øjet. Overrisle livmoderen hvert 2. minut med forvarmet, lakteret Ringers opløsning til at opretholde væskebalancen. Påfør blidt pres på livmoderen til at reorientere embryo og identificere de anatomiske landemærker nævnt ovenfor.
- Orient fosteret til at identificere den primære hovedet vene, hvis forreste og bageste grene flankerer mesenchymale område, hvor otocyst bopæl. Den otocyst passende ikke kan ses ved gennemlysning af livmoderen. Den otocyst ligger midtvejs mellem de forreste og bageste grene af de primære hovedet vene, som sammen med hovedstammen af venen, danner formen af stolperne eller målstænger på en amerikansk fodbold. Den otocyst er midtvejs mellem stolperne.
- Sæt injektionen pipetten gennem livmoderen i et forløb i overensstemmelse med den formodede placering af otocyst. Pulsere microinjector gang efter passage gennem uteros at visualisere sporstoffet farvestof og den omtrentlige placering af pipettespidsen. Før pipetten under mikrometer kontrol og pulsere igen for at vurdere dybde. Yderligere at fremme pipetten i den laterale hoved mesenkym og puls flere gange. Vellykket otocyst målretning vil afsløre den tilspidsede form endolymfatisk kanalen dorsalt, og muslingeskallen-form vestibulum. Slip pres på livmoderen, skal du fjerne pipetten fra embryo / livmoderen i en bevægelse, og straks skylle livmoderen med forvarmet, Ringer-lactat opløsning.
3. In vivo elektroporation
- Skyl livmoderen med Ringers laktat. Frisk anvendes lakteret Ringers opløsning er nødvendig for at elektrisk par skovlen-stil elektroder til livmoderen. Fugt wolfram overfladerne af elektroderne med Ringers laktat. Centrer injiceres otocyst i vejen for elektroderne. Forsigtigt komprimere livmoderen med elektroporering paddles. Katoden er i kontakt med livmodervæggen lateralt til den injicerede otocyst og anoden er i kontakt med livmodervæggen støder op til den ikke-injicerede otocyst. Udløse en firkantbølge pulstog med foden på pedalen på elektroporator. Elektroporering parametre er: 5, 50 msek pulser ved 43 volt per impuls, og en 950 ms interpulse forsinkelse. Umiddelbart skylles livmoderen efter pulstoget bliver leveret. Registrere strøm leveres til vævet: 60-100 mAmps er tilstrækkelig til at transficere otiske epitel progenitorer. Sprøjt og elektroporere 4-6, E11.5 embryoner pr dæmning.
- Udføre en anden, uafhængigt transuterine mikroinjektion af vandig fluorescerende dextran (Alexa Fluor 488, hvis ekspressionsplasmidet koder for et rødt fluorescerende protein eller Alex Fluor 594, hvis ekspressionsplasmidet koder for et grønt fluorescerende protein) i den 4. ventrikel i disse embryoer, hvis indre øre er præcist injiceres og mindst 60 mAmps af den nuværende pr puls var delivered under elektroporering. Den fluorescerende dextran vil kunne påvises ved fødslen i baghjerne og muliggøre udvælgelse af unger, hvis indre ører blev manipuleret under embryogenese (se 3,5).
- Overrisling af uterine horn med Ringers laktat. Indsætte de uterine horn i bughulen. Skylle livmoderkaviteten med 2-4 ml forvarmet, lakteret Ringers opløsning og lade overløb at løbe ud af indsnittet stedet på sterilt afdækningsstykke. Erstatte drapering med tørt, sterilt materiale. Suturere den abdominale væg med en ikke-skærende nål og en 6-0 resorberbar sutur. Vi foretrækker en kørende søm, låsende hver anden maske for både den abdominale væg og hud.
- Tørre dæmninger Pelsdyr og administrere et ikke-steroidt anti-inflammatorisk, såsom Meloxicam ved subkutan injektion. Retur dæmningen til forvarmet opsving buret på et sterilt forklæde. Overvåge og registrere dæmninger forb. respirations og incisionssted åbenhed, og vagina til blodig udledning. Blødning er rare men hvis til stede og usvækket, aflive dæmningen, mens hun stadig er under bedøvelse. Bemærk den tid, hun kommer til bevidsthed og forsøger at gå. Retur dæmningen til musen kolonien, når hun viser tegn på at spise og drikke og er begyndt at rede bygge. Typisk dette sker inden for 12 timer.
- Ved fødsel (postnatal dag 0), der flash baghjernen område af hver unger i kuldet at detektere fluorescerende dextran med en stereofluorescence dissektionsmikroskop med en GFP eller Texas Red-filter som passende. Retur til diegivende dæmningen kun de hvalpe, der viser baghjerne mærkning.
4. Repræsentative resultater
Figur 1. Elektroporering-medieret genoverførsel til udvikling cochlea. Den E11.5 otocyst blev injiceret med et ekspressionsplasmid kodende forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) og elektroporeret (puls TRAi parametre: fem 43 volt pulser ved 50 msek / puls og 950 msek interpulse forsinkelse). A) En repræsentativ indre øre fra postnatal dag 6 (P6) pup hvis otocyst blev injiceret, og elektroporeret ved E11.5 påvise EGFP ekspression fra bunden gennem midten drejning af sneglen. Den laterale væg af sneglen blev fjernet fra den midterste vinding og apex alene. E11.5 progenitorer, der giver anledning til toppunktet ikke transficeret. B) whole mount immunfarvning af sneglen i (A) med håret celle-markør, indikerer myosin 7a (Myo7a), at EGFP ekspression følger banen af det cortiske organ og er groft lokaliseret til håret celle-bærende sensorisk epithel. C) En repræsentativ indre øre fra en E18.5 embryo hvis otocyst blev injiceret, og elektroporeret ved E11.5. Laseren konfokal Fremskrivningen viser EGFP udtryk i Myo7a-positive sansehårceller. D) Laser konfokale projektion af den cochleære sensoriske epithel fra E18.5 cortiske organ angiver EGFP expression i de indre hårceller (IHC) ydre hårceller (OHC), indre phalangial celler (IPC), søjle celler (PC), og Deiters "celler (DC). Målestokken i (B) gælder (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genoverførsel til udviklingslandene musen indre øre: Musen indre øre udvikler sig fra øret placode løbet af den første uge af implantation udvikling 12,13. Ved embryonisk dag 9,5 (E9.5) har placode sammentrækningsorgan og forvandlet til en væskefyldt blære kaldet otocyst 2. Otisk forstadier i vesiklen giver anledning til de sensoriske og nonsensory celler i det modne indre øre, samt de neuroner, der innerverer mekanisk sensitive hårceller i det vestibulære og auditive sensoriske epithel. Ved slutningen af embryonale stadier, er komplekse, 3-dimensionelle morfologi membranøs labyrint i det indre øre etableret 3,12. Gain-og tab-af-funktion eksperimentelle metoder typisk udført med mus transgenese at få indsigt i den genetiske regulering af udviklingsmæssige processer, såsom celle skæbne specifikation og mønsterdannelse. Dynamisk genetisk manipulation af at udvikle musen indre øre iutero repræsenterer en gratis tilgang til mus transgenese at par genoverførsel teknikker med musen eksperimentel embryologi 6,11.
Virus-og elektroporering-medieret genoverførsel teknikker er blevet udviklet til at manipulere genekspression i udviklingslandene indre øre 6,11,14,15. Adeno-associerede virale (AAV)-vektorer inficere otiske progenitorer, der giver anledning til sensoriske og nonsensory celletyper og er blevet anvendt til at forespørge den molekylære basis for calcium-afhængig eksocytose i muse hårceller 16. AAV-vektorer producerer høje titre, der muliggør bred ekspression i det indre øre og forskellige virale serotyper vist unikke tropisme, som kan være fordelagtigt for forskellen cellulær ekspression. Ulemper indbefatter en fast fyld kapacitet, der begrænser størrelsen af genet, der kan misexpressed og kravet om virologiske ekspertise til at fremstille, oprense og titrere vira. Elektroporering-medieret gen transfer er blevet anvendt til at vurdere rollen af en basisk helix-loop-helix transkriptionsfaktor som specificerer sensorisk hår celleskæbnen in vivo 6. Ekspressionsplasmider tilpasset Gateway subkloning teknologi tillader hurtig og effektiv konstruktion af vektorer med unikke promotorer driver ekspressionen af et gen af interesse og en fluorescerende markør-protein fra en IRES-sekvens 17. Gener af interesse kan udtrykkes i otiske prækursorer i 24 timer ved elektroporering, og ekspression kan persistere i postnatale indre øre afhængigt af den anvendte promotor. Plasmid byggeri, rensning, opkoncentrering og kvantificering kræver kun standard molekylærbiologiske færdigheder. Ulemper omfatter nedsat in vivo transfektionseffektiviteten som plasmid størrelse stiger over ~ 8kb og en højere embryoletalitet forhold til de fleste virale vektorer. Både elektroporering-og virus-medieret genoverførsel teknikker kræver beherskelsen af muse eksperimentelle embryologisk techteknikker: overlevelse kirurgi, i livmoderen manipulation af embryoner, og transuterine mikroinjektion. Målet med dette manuskript er at løse sidstnævnte problem ved at vise hvert af de kritiske metodiske trin for digital video mikroskopi.
Metodologiske bemærkninger om videoen: Vi valgte bevidst ikke at drapere incisionssted med sterilt område, samtidig med at filme, så beskueren kan se placeringen af den ventrale midterlinjen i forhold til brutto-anatomi af dæmningen, dvs hovedet (bevidst sløret i de fleste rammer, men genkendelige), lemmer og hale. Draping incisionssted effektivt blokerer dette synspunkt, og kan forvirre bestræbelser på at værdsætte rumligt relevante anatomiske forhold under ventral laparotomi og en injektion sekvens. Vi anbefaler dog, drapering maven på dæmningen, så eksternaliseret Uterushornene hviler på et sterilt felt for at opretholde kirurgisk aseptik. Hertil kommer, bevidst vi ikke forsøge at dæmonertrerer suturering af de kirurgiske snit i bugvæggen og huden, fordi disse metoder skal læres af kyndig vejledning af en dyrlæge eller en kvalificeret kirurgisk tekniker. Dr. Marcel I. Perret-Gentil (University of Texas i San Antonio), præsenterer en udmærket diskussion om dette emne, komplet med billedlige fremstillinger, i sin handout, "Principles of Veterinary sutur." 18
Proceduremæssige anbefalinger: genoverførsel til udviklingslandene musen indre øre er teknisk udfordrende. Der er en række af bedste praksis, der vil fjerne en betydelig mængde variation og sikre vellykkede resultater. Vi laver specifikke anbefalinger nedenfor for at fremme læring denne eksperimenterende tilgang.
Consult veterinære personale til at udvikle musen overleve operationen dyrepleje-protokollen: Den dyrepleje Protokollen for pattedyr overlevelse kirurgi er krævende at producere sidenanæstesi, analgesi, og perioperativ pleje skal defineres og koordineres. En detaljeret diskussion af dyrs pasning protokol udvikling, herunder sprog, som kan danne kernen i en ansøgers protokol, er tilvejebragt som supplerende oplysninger (se " Animal Care protokollen Development "). Hertil kommer, vil dine hjem institutionernes Animal Care og Use Committee (IACUC) og veterinære personale uden tvivl give yderligere vejledning om formuleringen af en egnet protokol efter anmodning.
Etablere en dedikeret mus overlevelse operation område i livmoderen genoverførsel: Ventral laparotomi er en klassificeret som en større operation, fordi det kompromitterer et organ hulrum. De fleste IACUCs vil ikke kræve et sterilt, klasse 100 miljø for større mus overlevelse operation. Snarere et dedikeret område, der omfatter ordentlig belysning, ventilationning, supplerende opvarmning og hårde, vil ikke-porøse, desinficeres overflader vil være påkrævet. Vi foretrækker at udføre vores overlevelse operation i en vandret laminær strømning, der beskytter mus mod infektion, reducerer fysiologisk stress, og dermed faciliteter postoperative opsving. Vi har defineret en række brugerdefinerede ændringer til en oscillation-dæmpet, horisontal laminar flow hætte (Envirco LF 630), der omfatter retningsbestemt, lavt watt halogen spor belysning; udvidet elektriske kredsløb til magten genoverførsel udstyr og forsænkede stikkontakter med bænk bedste udskæringer til ledning passage. En detaljeret skematisk af disse ændringer er tilvejebragt som supplerende oplysninger (se " Laminar Flow Hood In Utero Gene Transfer "). Kontakt din IACUC efterhånden som du udvikler dit dyr pleje-protokollen til at definere et egnet sted, der er dedikeret udelukkende til musen survival kirurgi.
Afvej dæmningen til nærmeste 0,1 gram før indgivelse bedøvelse med natriumpentobarbital: natriumpentobarbital er en effektiv anæstetikum og vil tilvejebringe mindst 105 minutter arbejdstid, når den anbefalede dosering følges. Bestemme en nøjagtig legemsvægt for hver dæmning før beregning af dosis af den anæstetiske blandingen injiceres. Anslå aldrig dæmning legemsvægt. Brug Allergi Syringe bakke nål og sprøjte fra Becton Dikison: den menneskelige intradermal facet er ideel til atraumatisk intraperitoneale injektioner i drægtige mus. Desuden er denne sprøjte har en ekstremt lav dødt rum volumen og er kalibreret til forskellige bedøvelsesmidler mængder typisk nødvendige for dæmninger, hvis embryoner ved E11.5 eller E12.5.
Anvende profylaktisk analgesi at understøtte fostrenes overlevelse: indgivelse af et topisk anæstetikum på suturlinien, såsomBupivicaine, og en systemisk, ikke-steroidt anti-inflammatorisk lægemiddel, såsom meloxicam, før anbringelse af dæmningen i genopretning buret så analgetika er ombord på tidspunktet for dæmningen genvinder fra anæstesien. Reduktion ubehag i dæmningen letter postoperative genopretning og vedligeholdelse af en sund graviditet.
Koniske mikroinjektion pipetter og tæt begrænser den udvendige diameter: Den mest almindelige årsag til embryonisk letalitet er væv og / eller vaskulær beskadigelse fra dårligt konstrueret mikroinjektion pipetter. Transuterine mikroinjektion i E11.5 musen otocyst bærer andre begrænsninger end injektion i større organer i ældre embryoner (dvs. hjerne vesikler, øjne, lemmer osv.). Unbeveled, dårligt skrå eller uhensigtsmæssigt store ydre diameter pipetter vil forårsage blødninger fra fartøjer i livmoderen, den viscerale blommesækken kar, og / eller den embryonale på E11.5, som vil falde embryo-overlevelse. Er det muligttil håndbremsernes holdbare pipetter med lille diameter, som bærer en passende konisk, men det er vanskeligt at gøre det rutinemæssigt. Den E11.5 mus embryo, hvis lille otocyst er målet, vil være nådesløs. Kontakt P-1000 P-97 Pipette Kogebog 2011 fra Sutter Instruments for en fuld diskurs om pipetten design og fabrikation 19. Parametrene for pipetterne anvendt i dette arbejde er angivet ovenfor, og deres fremstilling er blevet fuldt beskrevet tidligere 11. PROCEDUREMÆSSIGE NOTATER i instruktionsbogen for Sutter Instrumenter BV-10 beveler er også en fremragende ressource.
Forstå hvorfor mistargeting den otocyst ved transuterine mikroinjektion opstår: Videoen præsenterer den ideelle resultat for transuterine mikroinjektion i E11.5 og E12.5 otocyst. Mistargeting den otocyst skyldes sædvanligvis at injicere for overfladisk, for dybt, eller utilstrækkeligt fremstillet pipetter. Figur 2 viser disse betingelser. PanelA viser et sidebillede af den venstre side af en E12.5 embryo afbildes ved gennemlysning efter vellykket transuterine mikroinjektion af fast green opløsning i otocyst. Baghjernen (Hb) viser sig som en kile-formet kærv dorsal til otocyst. Øjet (E) har en ring af pigment langs sin periferi og venstre forben er fremtrædende. Hovedstammen af den primære hovedet vene (PHV) er lige under otocyst. Den otocyst er fyldt med fast green der vises sort: den dorsale, kan endolymfatiske kanal (ED) og forhal af otocyst (OC) kan skelnes. Vellykket målretning af E11.5-12,5 otocyst vil altid præsentere en klar og tydelig endolymfatiske kanal og forhal. Panel A viser det samme billede som i A uden den hvide mærkning for at lette kritisk gennemgang af den injicerede otocyst.
Figur 2. En billedlig vejledning til mistargeting den otocyst ved transuterine microinjection. Alle paneler viser den venstre sidebillede af en E12.5 embryo med midterhjernen op og forhjernen venstre, bortset Panel H, som er en dorsal billede af baghjerne-midthjernen region. Paneler i hver række repræsenterer billeder af den samme embryo. Se diskussionen for en detaljeret forklaring af årsagerne til otocyst mistargeting. Forkortelser: e, venstre øje, red, endolymfatiske kanalen fg, fast green, HB, baghjerne, lb, knopskydninger, oc, otocyst, OT, otiske territorium, p, pipette, PHV, primære hoved vene, pt, pipettespidsen.
Overfladisk injektion er en almindelig årsag til mistargeting. Panelerne demonstrere en overfladisk injektion i E12.5 conceptus. Den baghjerne (hb), hak og otiske område (OT, cirkel) er tydelig i denne venstre, set fra siden. Den mikroinjektion pipette (p) er i forgrunden. Fast green (fg) begynder at skubbe fra pipettespidsen (B), og med efterfølgende impulser fra trykket injektor (CD), farvestoffet diffunderer ind i en oval-form. Fordelingen af the farvestof antyder, at det blev indført mellem livmodervæggen og visceral blommesækken, en extraembryonic membran, der omgiver exocoelomic hulrummet. Eksperimentatoren bør ikke forsøge at re-målrette otocyst i denne embryo, men bør gå videre til næste embryo. Flere injektioner korrelerer med nedsat embryo-overlevelse, en effekt, der er mere akut i E11.5 end E12.5.
Deep injektion er en mere almindelig årsag til mistargeting. Panelerne FH viser en injektion bane, der passerer gennem otisk område i baghjerne. Den primære hoved vene (PHV), venstre øje (e), og pipetten (p) er åbenbar i dette sidebillede af en E12.5 embryo. Den indledende udsprøjtning af fast green (fg) forskydes dorsalt i forhold til den primære hovedet vene / otisk område. Med efterfølgende impulser blev kileformede baghjerne (Hb) fuldstændigt fyldt med fast green (Panel G). En 90 graders drejning af den injicerede embryon tillader påvisning af fast green i hindbrai hulrummet fra den dorsale henblik (Panel H). Både overfladiske og dybe injektioner skyldes den manglende evne til at opfatte dybde mikroinjektion pipetten efter det kommer i kontakt med uterus. En praktisk tilgang, der fungerer godt, er at fremme pipetten gennem livmoderen og derefter straks pulsere gang for at lede efter et pust af fast green: placeringen af pust angiver omtrentlige position pipettespidsen. Juster dybden baseret på denne række-fund puls.
Utilstrækkeligt fremstillede pipetter er den mest almindelige årsag til mistargeting. Injektion forsøg er vist i panelerne IK blev udført med en pipettespids, der blev manuelt brudt, men ikke affaset. Den sidebillede af E12.5 embryo viser baghjerne (Hb), venstre øje (e) og mikroinjektion pipetten (p). Bemærk, at pipettespidsen (PT) er kraftigt bøjede og har ikke trænge livmoderen (panel I). Anvendelsen af yderligere kraft sakse spidsen af pipetten (Panel J, pil), der forlader pipEtte spids indlejret i livmoderen. En lille mængde fast green (fg) blev udstødt fra den brudte pipette og har opdaget overfladen af livmoderen. Den integrerede pipettespids (Panel K) skal fjernes med fine, sterile pincetter og kasseres som klid affald. Hvis pipettespidsen ikke kan lokaliseres eller blev fjernet, aflive dæmningen under anæstesi.
Dokumentere proceduremæssige bemærkninger om en mus overlevelse operation datablad: Et afgørende element til at lære disse metoder er at dokumentere observationer og foretage justeringer baseret på disse bemærkninger. Udarbejde en mus overlevelse operation datablad og bemærk præoperative, operative og postoperativ information. Præoperative data omfatter dæmningen vægt dosis af bedøvelsesmiddel leveret plasmid injiceres, etc. operative data omfatter embryo injicerede (dvs. R2 er andet embryo fra ovariet i højre uterine horn), kvaliteten af injektion (dvs. ingen endolymfatisk Kanalen detekteres farvestof i 4
Brug aktuel leveret pr puls for at optimere transfektionseffektiviteten: Pladsen bølgefrekvens tog består af 5, 43volt og 50msec pulser med en 950msec bl.a.puls forsinkelse. Den 5mm platin, paddle stil elektroder sikre, at hele otisk område er indeholdt i det elektriske felt. Lignende transfektionseffektiviteter kan opnås med 3mm skovle, selvom de er mere vanskeligt nøjagtigt at positionere. Puls paradigme blev optimeret ved at evaluere den aktuelle overført til embryoer under den afsluttende impuls, ikke ved at feje gennem spændinger og vurdering transfektionseffektivitet. Rationalet er, at den afgivne strøm per impuls varierer med konstant spænding afhængigt af åbenheden af elektrisk kobling mellem uterus og platinelektroder. Antages det, at livmoderen frisk kunstvandes med Ringers laktat umiddelbart før placere padler og ladningsbærere er til stede i overskud, chefen variable er mængden af "kobling", tryk på livmoderen med padler. Skånsom tryk på 43volts resulterer i <60mAmps af strøm leveret og sporadisk transfektion i bedste fald. Moderat tryk på 43volts resulterer i 60 100mAmps leveret og mest effektiv transfektion. Heavy pres på 43volts resulterer i> 100mAmps leveret og korrelerer med vedvarende ændret hjertefrekvens og øget embryoletalitet. Overdreven tryk sprænger visceral blommesækken (et "pop" kan mærkes gennem paddles) og forårsager embryonale dødelighed. Det er sandsynligt, at den variable påførte tryk ændrer impedans mellem elektroderne, som påvirker den leverede strøm. Pulsfrekvensen af 1Hz (en 50 msek puls pr sekund) blev defineret som den mindst nedbrydende til fosterets hjertecyklussen, der er en positiv korrelation for fostrenes overlevelse. Vi konkluderer, at den vigtigste parameter at overvåge etablere en effektiv in vivo elektroporation paradigme er den afgivne strøm per impuls. Ændring af enhver puls paradigme bør omfatte nøje overvågning af nuværende leverede per impuls.
Vedtage en modulær tilgang til læring the teknik: Modul 1: Øv en simuleret operation med uterin eksternalisering, men ikke injicere eller elektroporere. Dæmninger tolerere ventral laparotomi særdeles godt og bør aldrig opleve postkirurgiske komplikationer relateret til kirurgisk teknik. Mus overlevelse kirurgiske færdigheder er utvivlsomt bosat i hjeminstitutionen, så forfølge den nødvendige uddannelse. Opnå beherskelse af kirurgiske færdigheder, før du fortsætter. Modul 2: Praksis transuterine mikroinjektion i otocyst på en bedøvet dæmning uden forventning om at gennemføre overleve operationen: aflive dæmningen under anæstesi, isolere de injicerede embryoner, og vurdere kvaliteten af de otocyst injektioner. Modul 3: Target kun 2 otocysts i 2 forskellige fostre med fast green, ikke elektroporere, gennemføre operationen, og validere nedstrøms embryo-overlevelse. Modul 4: Target kun 2 fostre med DNA / hurtig grøn løsning, elektroporere, validere nedstrøms embryo-overlevelse, og fastslå den transfektion eftet. Modul 5: Target kun 2 fostre med DNA / hurtig grøn løsning, elektroporere, injicere Alexa Fluor i 4 th ventriklen at mærke manipuleret embryo, skal du vælge mærkede embryoner i P0, og fastslå transfektionseffektiviteten.
Proceduremæssig indlæringskurve: Beherskelse af mus overlevelse kirurgiske teknikker, med passende rådgivning fra det veterinære og kirurgiske personale ens hjem institution, er rimelig hurtig, og bør kun kræver 3-5 Dams-værdi af praksis for nybegyndere at få ekspertise. Transuterine mikroinjektion og in vivo elektroporation til at generere nyttig transficeret indre ører vil kræve 10-50 dæmninger-værdi af indsatsen, forudsat der er 6 brugbare embryoner pr graviditet og den modulære tilgang følges. De studerende, som har aktiviteter, der kræver finmotorik (dvs., at spille et musikinstrument, syning, modelbygning, eller konkurrerende atletik) har kortere uddannelse perioder end ThoSE der ikke gør. De kritiske korrelater for en vellykket beherskelse af disse metoder er samvittighedsfulde opmærksomhed på detaljer (dvs., mikroinjektion pipette fabrikation, vaskulær anatomi, udtrykkelige notatskrivning) og en rimelig rolig opførsel.
Workflow: Når viden er opnået, kan man forudse injektion og elektroporere 4-6 embryoner pr dæmning; 3-5 embryoner vil overleve, og 2-4 embryoner vil have fordel transfekteres indre ører til analyse. Den baghjerne Alexa Fluor mærkning teknik til at mærke embryoner for sortering ved fødslen kræver yderligere baghjerne injektion i hver elektroporerede embryo, men dette er veltolereret, og ikke påvirker effektiviteten i sagsbehandlingen. Således genfindingsprocenten for fordel transficeret indre ører fra in vivo elektroporation sammenligner positivt genfindingsprocenten for homozygote mutantmus fra en heterogygous opdræt paradigme. Med erfaring, er 2-3 dæmninger pr forsøgslederen per dag et rimeligt arbejdeflow: 1,5 timer pr dæmning for kirurgi og i alt 1,5-2 timer for postoperativ overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Humana Press om tilladelse til at offentliggøre mikroinjektion pipette fabrikation tal, der oprindeligt blev vist på side 130 reference 11, Larry Dlugas og Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, for videography, Larry Dlugas til video design og redigering; Adam M. O "Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco for at designe vores kunder horisontal laminar flow hætte og Les Goldsmith til at yde teknisk skematiske, Victor Monterroso, MV, MS, ph.d. og Tom Chatkupt, DVM, OHSU Institut for Sammenlignende Medicin, vejledning med vores dyrepleje protokol, kirurgiske teknikker, og profylaktisk analgesi regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, for at dele sine handout om veterinære sutureringsteknikker, Edward Porsov, MS, for at designe vores Adobe Premiere Pro video mikroskopi computerarbejdsplads og Leah White og jonas Hinckley af LMS Captioning (Portland, OR). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute on Døvhed og other Communication Disorders: DC R01 008595 og DC R01 008.595-04S2 (til JB) og P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
