Summary
Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren ein
Abstract
Die Säugetier-Innenohr hat 6 verschiedene Sinnesepithelien: 3 Cristae in den Ampullen der Bogengänge; Maculae im Utriculus und Sacculus, und das Corti-Organ in der Coiled Cochlea. Die Cristae und Maculae enthalten vestibulären Haarzellen, die mechanische Reize, um die besonderen Sinn für Ausgewogenheit dienstbar, während auditiven Haarzellen im Corti-Organ die primären Wandler für Hörgeräte sind ein transduzieren. Zellschicksals Spezifikation in diesen Sinnesepithelien und Morphogenese der Bogengänge und Hörschnecke finden während der zweiten Woche der Schwangerschaft in der Maus und sind weitgehend vor der Geburt 2,3 abgeschlossen. Entwicklungsstudien der Maus Innenohr werden routinemäßig von der Ernte transgenen Embryonen bei unterschiedlichen embryonalen oder postnatalen Stadien, um Einblick in die molekularen Grundlagen der zellulären und / oder morphologische Phänotypen gewinnen 4,5 durchgeführt. Wir vermuten, dass Gen-Transfer in die Entwicklungsländer Maus Innenohr in utero </ Em> im Rahmen der Gewinn-und Verlust-of-function-Studien stellt einen kostenlosen Zugang zur traditionellen Maus-Transgenese für die Abfrage der genetischen Mechanismen, die Säugetier-Innenohr Entwicklung 6.
Das experimentelle Paradigma zur Gen Fehlexpression Studien im sich entwickelnden Maus Innenohr führen demonstriert hier löst sich in drei Schritten: 1) ventrale Laparotomie; 2) transuterine Mikroinjektion, und 3) in vivo Elektroporation. Ventralen Laparotomie ist eine Maus Überleben chirurgische Technik, die Externalisierung der Gebärmutter ermöglicht, experimentelle Zugang zu den implantierten Embryonen 7 zu gewinnen. Transuterine Mikroinjektion ist die Verwendung von abgeschrägten, Glaskapillare Mikropipetten Expressionsplasmid in das Lumen des Ohr-Vesikel oder otocyst einzuführen. In-vivo-Elektroporation die Anwendung von Rechteckwellen, direkte Stromimpulse an Expressionsplasmid in Vorläuferzellen 8-10 anzutreiben.
11. Maus experimentellen embryologischen Techniken kann schwierig sein, von Prosa zu lernen und Standbilder allein. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, die 3 Schritte in der Gen-Transfer Verfahren. Die meisten kritisch, setzen wir digitale Video-Mikroskopie genau zeigen, wie man: 1) zu identifizieren Embryo Orientierung in utero, 2) neu zu orientieren Embryonen für die gezielte Injektionen an den otocyst; 3) microinject DNA mit Tracer-Farbstoff-Lösung in die otocyst gemischt an embryonalen Tag 11,5 und 12,5; 4) elektroporieren des eingespritzten otocyst und 5) Label elektroporiert Embryonen für postnatale Auswahl bei der Geburt. Wir bieten repräsentative Beispiele von erfolgreich transfizierten Innenohr; eine bildliche Anleitung zu den häufigsten Ursachen von otocyst Misstargeting; diskutieren, wie man gemeinsame methodische Fehler zu vermeiden; und Gegenwart Leitlinien für ein Schreiben in utero gEn-Transfer-Protokoll Tierpflege.
Protocol
1. Ventralen Laparotomie
- Anesthetize einen Damm, dessen Embryonen sind an embryonalen Tag 11,5 (E11.5; Uhr am Tag ein Vaginalpfropf erkannt wird ist Tag 0,5 der Embryonalentwicklung) durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital Narkose-Lösung (7,5 ul pro Gramm Körpergewicht). Arbeiten Anästhesielösung: 180 ul 50 mg / ml Pentobarbital-Natrium-Lösung; 100 L absolutem Ethanol; 320 ul von 65 mg / ml wässrige Magnesiumsulfat (moduliert Uterustonus) und 400 ul Propylenglykol (Fahrzeug mischbar mit wässrigen und organischen Komponenten).
- Beurteilen Sie die Vollständigkeit der Narkose durch die Durchführung Schmerzreize Tests: Squeeze Pfote; Schwanz Prise; und Blink-Reaktion auf die Wange und Tasthaare Touch. Bewerben sterile Augensalbe auf die Hornhaut.
- Rasieren Sie die Bauch-Fell auf dem suprapubischen Bereich um den Brustkorb mit einer Schere und einem feinen Sägeblatt (Oster # 40 Klinge). Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol, 10% Povidon-Iod (Betadine), eineRunde 70% Ethanol, sequentiell. Bewegen Sie die Maus Bauch nach unten auf einem sterilen Tuch und dann auf einem Heizkissen oder warme Platte (37 ° C) für 2-5 Minuten eingestellt.
- Inzision der Bauchhaut in der ventralen Mittellinie mit Ball-bestückte Schere. Verlängern Sie die Inzision für 10-14 mm. Identifizieren Sie die Linea alba, eine avaskuläre, weiß Bindegewebe Band entlang der ventralen Mittellinie der Bauchwand. Inzision der Linea alba mit Kugel gekippt Schere und erweitern den Schnitt 10-14 mm. Unmittelbar bewässern den Bauch mit vorgewärmtem (37 ° C) Ringer-Laktat-Lösung.
- Externalisieren die beiden Hörner des Uterus mit Ring Zange ohne übermäßigen Druck auf den Nidationsstellen. Spülen Sie die ausgelagerten Uterushörner mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung.
2. Transuterine Mikroinjektion
- Fertigen Sie ein dickwandiges, Borosilikatglas Kapillare Mikroinjektion Pipette mit den folgenden Merkmalen: 12-16 μm Außendurchmesser und eine 20-Grad-Schräge. Auf einer Sutter P-97 Pipette Abzieher mit kleinen Kasten Filament, verwenden Sie das folgende Programm: Wärme = Rampe Test plus 3 Einheiten; Druck = 200; ziehen = 0; Geschwindigkeit = 46; Zeit = 100). Mit dem Sutter BV-10 Beveler, verwenden Sie den 104C (Gold) Schleifscheibe mit großem Durchmesser für Pipetten. Resuspendieren Expressionsplasmid bei 3-4 g / ul in Calcium-freier phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2-7,4). In kristallinen schnell grün zu dem konzentrierten DNA, vorsichtig vortexen für 30 Sekunden, und Spin bei 10.000 g für 10 Sekunden. Die minimale Menge an schnell grün erforderlich ist, um visuell verfolgen die Wirksamkeit der Injektion wird empirisch bestimmt. Verfüllen die abgeschrägte Pipette mit dem DNA / schnell grüne Lösung. Verbinden des geladenen Mikroinjektion Pipette auf die Pipettenhalter der Injektor (Picospritzer mit> 99% reinem Stickstoff als Quellengas).
- Durchleuchten die Gebärmutter mit geringer Intensität, Halogenlicht, um den Embryo in seinem Implantationsstelle zu visualisieren. Identifizieren Sie den BEATing Herz, Gehirn Vesikel, Gliedmaßenknospen, im Entstehen begriffenen 4. Ventrikel des Hinterhirn und Auge. Spülen des Uterus alle 2 Minuten mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung, um die Hydratisierung zu halten. Drücken Sie vorsichtig auf die Gebärmutter, um den Embryo neu zu orientieren und Identifizierung der anatomischen Landmarken oben erwähnt.
- Orient der Embryo, um den primären Kopf Vene, deren vordere und hintere Äste flankieren den mesenchymalen Gebiet, in dem die otocyst wohnt identifizieren. Die otocyst selbst kann nicht durch Durchleuchtung des Uterus werden. Die otocyst in der Mitte zwischen den vorderen und hinteren Äste der primären Kopf Vene, die, zusammen mit dem Hauptstamm der Vene, bilden die Form der Pfosten oder Torpfosten auf einem American-Football-Feld befindet. Die otocyst in der Mitte zwischen den Pfosten.
- Legen Sie die Injektionspipette durch die Gebärmutter in einer Bahn im Einklang mit dem mutmaßlichen Ort der otocyst. Impuls die Mikroinjektorkopfs einmal nach dem Durchlaufen der uteruns zur Visualisierung der Tracer-Farbstoff und die ungefähre die Position der Pipettenspitze. Schieben Sie die Pipette unter Mikrometer-Steuerung und Puls wieder in die Tiefe zu beurteilen. Weiter voranzutreiben Sie die Pipette in die seitliche Kopf Mesenchym und Puls wiederholt. Erfolgreiche otocyst Targeting wird zeigen, die sich verjüngende Form des Ductus endolymphaticus dorsal und der Jakobsmuschel-Form der Apsis. Lassen Sie den Druck auf die Gebärmutter, entfernen Sie die Pipette aus dem Embryo / Gebärmutter in einer Bewegung, und sofort bewässern die Gebärmutter mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung.
3. In vivo Elektroporation
- Spülen Sie die Gebärmutter mit Ringer-Laktat-Lösung. Frisch aufgetragen Ringer-Laktat-Lösung ist notwendig, um elektrisch zu koppeln, die Paddel-Stil Elektroden in die Gebärmutter. Befeuchten Sie die Wolfram-Oberflächen der Elektroden mit Ringer-Laktat. Zentrum des eingespritzten otocyst in dem Weg der Elektroden. Sanft komprimieren die Gebärmutter mit der Elektroporation paddles. Die Kathode ist in Kontakt mit der Uteruswand quer zur injiziert otocyst und die Anode in Kontakt mit der Uteruswand benachbart zu der injizierten otocyst. Lösen Sie eine Rechteckimpuls Zug mit dem Fußpedal-Schalter auf der Elektroporator. Die Elektroporation Parameter sind: 5, 50 ms Pulse bei 43 Volt pro Puls und einer 950 ms Zwischenpulsverzögerung. Unmittelbar bewässern die Gebärmutter nach der Impulsfolge wird ausgeliefert. Notieren Sie die aktuelle Lieferung an das Gewebe: 60-100 mAmps ist ausreichend, um epithelialen Vorläuferzellen otic transfizieren. Injizieren und elektroporieren 4-6, E11.5 Embryonen pro Muttertier.
- Durchführen einer zweiten, unabhängigen transuterine Mikroinjektion von wässrigen fluoreszierenden Dextran (Alexa Fluor 488, wenn der Ausdruck Plasmid codiert ein rot fluoreszierendes Protein oder Alex Fluor 594, wenn das Expressionsplasmid kodiert für ein grün fluoreszierendes Protein) in der 4. Ventrikels dieser Embryonen, deren innere Ohren genau gespritzt und mindestens 60 mAmps von Strom pro Puls war deangeliefert bei der Elektroporation. Das fluoreszierende Dextran wird bei der Geburt nachweisbar im Hinterhirn und ermöglichen die Auswahl der Jungtiere, deren innere Ohren wurden während der Embryogenese manipuliert (siehe 3.5).
- Spülen Sie die Uterushörner mit Ringer-Laktat. Setzen Sie die Uterushörner in die Bauchhöhle. Spülen Sie die Gebärmutterhöhle mit 2-4 ml vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung und damit der Überlauf abfließen aus dem Inzisionsstelle auf den sterilen Tuch. Ersetzen Sie die Drapierungen bei trockenen, sterilen Material. Nähen Sie die Bauchdecke mit einer nicht schneidenden Nadel und einem resorbierbaren Nahtmaterial 6-0. Wir bevorzugen eine Vorstich, Sperren jede zweite Masche, sowohl für die Bauchdecke und die Haut.
- Trocknen Sie die Dämme 'Fell und zu verwalten, eine nicht-steroidale Entzündungshemmer wie Meloxicam durch subkutane Injektion. Bringen Sie den Damm auf die vorgewärmten Erholung Käfig auf einem sterilen Tuch. Überwachen und Aufzeichnen der Dämme 'Atmung, Inzisionsstelle Durchgängigkeit und Vagina für blutigen Ausfluss. Blutungen sind rawieder, aber wenn vorhanden und unvermindert, einschläfern den Damm, während sie noch unter Narkose. Notieren Sie sich die Zeit, sie wieder zu sich und versucht, ambulate. Bringen Sie den Damm auf die Maus Kolonie, als sie Anzeichen für Essen und Trinken zeigt, und hat damit begonnen, Nest zu bauen. Normalerweise passiert dies innerhalb von 12 Stunden.
- Bei der Geburt (postnatalen Tag 0), setzen Sie das Flash-Hinterhirn Bereich jeder Welpe im Wurf, den fluoreszierenden Dextran mit einem stereofluorescence Binokular mit einem GFP-oder Texas Red-Filter erkennt nach Bedarf. Zurück zur säugenden Mutter nur jene Welpen, die Rautenhirn Kennzeichnung anzuzeigen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Elektroporation vermittelte Gentransfer in die Entwicklung von Cochlea. Die E11.5 otocyst wurde mit einem Expressionsplasmids Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und elektroporierten injiziert (Puls train-Parameter: fünf, 43-Volt-Impulsen bei 50 ms / 950 ms Puls-und Puls-Verzögerung). A) ein Vertreter des Innenohrs von einer postnatalen Tag 6 (P6), deren Welpen otocyst wurde injiziert und bei E11.5 elektroporiert demonstrieren EGFP-Expression von der Basis durch die Mitte Windung der Cochlea. Die laterale Wand der Cochlea wurde aus der Mitte und der Spitze wiederum nur entfernt. E11.5 Vorfahren, die Anlass zu der Spitze wurden nicht transfiziert. B) Immunfärbung Whole mount in der Cochlea (A) mit dem Haar-Zell-Marker, zeigt Myosin 7a (MYO7A), dass EGFP-Expression folgt die Flugbahn des Corti-Organ und wird grob an die Haarzelle tragenden Sinnesepithel lokalisiert. C) einem Vertreter des Innenohrs von einem Embryo, dessen E18.5 otocyst wurde injiziert und bei E11.5 elektroporiert. Die Laser-Projektion zeigt konfokale EGFP-Expression in MYO7A-positiven sensorischen Haarzellen. D) konfokalen Laser-Projektion des Cochlea-Sinnesepithel aus dem E18.5 Corti-Organ anzeigt EGFP expression in der inneren Haarzellen (IHC), äußeren Haarzellen (OHC), innere phalangial Zellen (IPC), Pfeiler-Zellen (PC) und Deiters 'Zellen (DC). Der Balken in (B) gilt für (A).
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Discussion
Gentransfer in sich entwickelnden Maus Innenohr: Das Innenohr der Maus entwickelt sich aus der Ohrplakode während der ersten Woche der Einnistung Entwicklung 12,13. Von embryonalen Tag 9,5 (E9.5) hat die Plakode eingestülpt und verwandelte sich in einem mit Flüssigkeit gefüllten Vesikel genannt otocyst 2. Otic Vorstufen in der Blase führen zu den sensorischen und nichtsinnlichen Zellen innerhalb des reifen Innenohr sowie die Neuronen, die mechanisch empfindlichen Haarzellen innervieren im vestibulären und auditiven Sinnesepithelien. Am späten embryonalen Stadien wird der Komplex, 3-dimensionale Morphologie des häutigen Labyrinths des Innenohrs 3,12 etabliert. Gewinn-und Verlust-of-function experimentellen Modalitäten werden in der Regel mit der Maus Transgenese durchgeführt, um Einblicke in die genetische Regulation von Entwicklungsprozessen wie das Schicksal der Zelle Spezifikation und Musterbildung zu gewinnen. Dynamische genetische Manipulation des sich entwickelnden Maus Innenohr inutero stellt ein kostenloses Konzept für Maus Transgenese, dass Paare Gentransfer-Techniken mit der Maus experimentelle Embryologie 6,11.
Virus-und Elektroporation vermittelte Gentransfer Techniken wurden entwickelt, um die Genexpression in der entwickelnden Innenohr 6,11,14,15 manipulieren. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren infizieren otic Vorfahren, die Anlass zu sensorischen und nichtsinnlichen Zelltypen und wurden verwendet, um die molekulare Basis der Calcium-abhängigen Exozytose in Maus Haarzellen 16 verhören. AAV-Vektoren erzeugen hohe Titer, die breite Expression ermöglichen im Innenohr und verschiedenen viralen Serotypen zeigen einzigartige Tropismus von Vorteil sein, die für differentielle zelluläre Expression kann. Nachteile sind eine feste Füllung Kapazität, die die Größe des Gens, das misexpressed werden können und die Voraussetzung für die virologische Expertise zu machen, zu reinigen und den Titer der Viren begrenzt. Die Elektroporation vermittelte Gen transfer wurde verwendet, um die Rolle eines basischer Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor Angabe Sinneshaar Zellschicksals in vivo 6 bewerten. Expressionsplasmide für Gateway Subklonierung Technik angepasst ermöglichen eine schnelle und effiziente Konstruktion von Vektoren mit besonderen Promotoren die Expression eines Gen-von-Interesse und einem fluoreszierenden Marker-Protein aus einer IRES-Sequenz 17. Gene von Interesse können in otic Vorläufer innerhalb von 24 Stunden von Elektroporation und Ausdruck ausgedrückt werden kann in der postnatalen Innenohr in Abhängigkeit von der verwendeten Promotor fortbestehen. Plasmidkonstruktion, Reinigung, Konzentrierung und Quantifizierung erfordern nur Standardtechniken der Molekularbiologie Fähigkeiten. Nachteile sind verminderte in vivo Transfektionseffizienz als Plasmid zunehmender Größe oberhalb von ~ 8kb und einer höheren Rate von embryonalen Letalität im Vergleich zu den meisten viralen Vektoren. Sowohl Elektroporation-und Virus-vermittelte Gentransfer Techniken erfordern Beherrschung von Maus experimentellen embryologischen Tech-niken: Überleben Chirurgie, in der Gebärmutter eine Manipulation des Embryos, und transuterine Mikroinjektion. Das Ziel dieses Manuskriptes ist es, das letztere Problem durch den Nachweis jeden kritischen methodischen Schritt für digitale Video-Mikroskopie anzugehen.
Methodische Erläuterungen zum Video: Wir haben bewusst nicht um die Inzisionsstelle mit sterilen Bereich während der Dreharbeiten zu drapieren, so könnte der Betrachter die Position des ventralen Mittellinie in Bezug auf die makroskopischen Anatomie des Dammes, das heißt, der Kopf (in den meisten bewusst verschwommen sehen Frames, aber erkennbar), Gliedmaßen und Schwanz. Abdeckung des Inzisionsstelle wirkungsvoll blockiert diese Ansicht und können Bemühungen um eine räumlich relevanten anatomischen Verhältnisse während der ventralen Laparotomie und einer Injektion Folge schätzen verwechseln. Wir empfehlen jedoch, drapieren den Bauch des Dammes, so dass die ausgelagerten Uterushörner ruhen auf einem sterilen Bereich chirurgischer Asepsis zu halten. Darüber hinaus haben wir bewusst nicht an Dämonen versuchentrate Vernähen der chirurgische Schnitte in der Bauchdecke und der Haut, weil diese Methoden durch fachmännisch von einem Tierarzt oder einer qualifizierten chirurgischen Techniker gelernt werden muss. Dr. Marcel I. Perret-Gentil (University of Texas in San Antonio), eine ausgezeichnete Diskussion über dieses Thema, komplett mit bildlichen Darstellungen, in seinem Handout, "Principles of Veterinary Naht." 18
Procedural Empfehlungen: Gentransfer in die Entwicklungsländer Maus Innenohr ist eine technische Herausforderung. Es gibt eine Reihe von Best Practices, die eine erhebliche Menge an Variabilität zu beseitigen und sicherzustellen, werden erfolgreiche Ergebnisse. Wir machen konkrete Empfehlungen zur Erleichterung des Lernens unter diesen experimentellen Ansatz.
Consult tierärztlichen Personals, um die Maus Überleben Chirurgie Tierpflege-Protokoll zu entwickeln: Die Tierpflege-Protokoll für das Überleben von Säugetieren Operation ist anspruchsvoll zu produzieren seitAnästhesie, Analgesie, und perioperativen Bereich müssen definiert und koordiniert werden. Eine ausführliche Diskussion der Tierpflege Protokoll Entwicklung, einschließlich der Sprache, die den Kern der Bewerberin oder des Protokolls bilden kann, wird als ergänzende Information (siehe "zur Verfügung gestellt Animal Care-Protokoll-Entwicklung "). Darüber hinaus wird Ihr Zuhause Institutionen 'Animal Care und Use Committee (IACUC) und tierärztlichen Personals zweifellos mehr Orientierungshilfe bei der Formulierung eines geeigneten Protokolls auf Anfrage.
Einen zweckgebundenen, das Überleben der Mäuse OP-Bereich für die in utero Gentransfer: Ventrale Laparotomie ist ein klassifiziertes als große Operation, weil es eine Körperhöhle beeinträchtigt. Die meisten IACUCs wird nicht verlangen, eine sterile, Klasse 100 für die großen Umwelt-Maus Überleben Chirurgie. Vielmehr enthält einen eigenen Bereich, dass angemessene Beleuchtung, Lüftungnung, Zusatzheizung, und hart, wird nicht porös, desinfizierbar Oberflächen aufweisen, die erforderlich sein. Wir bevorzugen es, unser Überleben Operation in einer horizontalen Laminarströmungshaube, das die Maus vor einer Infektion schützt, reduziert die physiologischen Stress führen und damit Einrichtungen postoperative Genesung. Erweiterten elektrischen Schaltungen an die Macht Gentransfer Ausrüstung;; Wir haben eine Reihe von kundenspezifischen Modifikationen zu einer Schwingung-gedämpft, horizontale Laminarströmungshaube (Envirco LF 630), die Richtungs-, niedrige Wattzahl Halogen-Beleuchtung gehören Spur definiert und versenkte Steckdosen mit Tischgerät Ausschnitte für Korddurchganges. Eine detaillierte schematische dieser Modifikationen wird als ergänzende Information (siehe "zur Verfügung gestellt Laminar Flow Hood In Utero Gentransfer "). Konsultieren Sie Ihren IACUC, wie Sie Ihren Tierpflege-Protokoll, einen geeigneten Standort, der ausschließlich auf Maus su gewidmet definieren entwickelnrvival Chirurgie.
Wiegen Sie den Damm auf 0,1 Gramm Natrium-Pentobarbital vor der Verabreichung von Anästhesie: Natrium-Pentobarbital ist ein wirksames Anästhetikum und wird mindestens 105 Minuten Arbeitszeit bieten, wenn das empfohlene Dosierungsschema befolgt wird. Bestimmen Sie ein genaues Körpergewicht für jeden Damm vor der Berechnung der Dosis des Anästhetikums Mischung zu injizieren. Nie schätzen Damm Körpergewicht. Verwenden Sie den Allergie-Spritzentablett Nadeln und Spritzen von Becton Dikison: die menschliche intradermale Fase ist ideal für atraumatische intraperitoneale Injektionen in trächtigen Mäusen. Darüber hinaus hat diese Spritze einen extrem niedrigen Totraumvolumen und wird für den Bereich des Anästhetikums Volumen typischerweise für Dämme, deren Embryonen sind E11.5 oder E12.5 erforderlich kalibriert.
Bereitstellen prophylaktische Analgesie zur Überlebensrate der Embryonen zu unterstützen: Verwalten einer Lokalanästhetikum auf die Nahtlinie, wie z. B.Bupivacain, und eine systemische, nicht-steroidale Entzündungshemmer, wie Meloxicam, vor dem Platzieren der Damm in die stabile Seitenlage Käfig, so dass Analgetika an Bord sind von der Zeit der Damm wieder aus der Narkose. Reduzierung der Beschwerden in der Damm erleichtert postoperativen Erholung und Erhaltung einer gesunden Schwangerschaft.
Bevel die Mikroinjektion Pipetten und eng begrenzen den Außendurchmesser: Die häufigste Ursache für embryonale Letalität ist Gewebe und / oder Gefäßschäden von schlecht konstruierten Mikroinjektion Pipetten. Transuterine Mikroinjektion in den E11.5-Maus trägt otocyst anderen Zwängen als Injektion in größeren Orgeln in älteren Embryonen (dh Gehirn Vesikel, Augen, Körper, etc.). Unbeveled, schlecht abgeschrägt oder unangemessen große Außendurchmesser Pipetten führt zu Blutungen aus Gefäßen in der Gebärmutter, dem viszeralen Dottersack Gefäßsystem und / oder des Embryos an E11.5, die Überlebensrate der Embryonen abnehmen wird. Es ist möglich,zu verteilen-brechen dauerhaften Pipetten mit kleinem Durchmesser, die eine entsprechende Abschrägung tragen, aber es ist schwierig, so routinemäßig tun. Die E11.5 Maus-Embryo, dessen winzige otocyst ist das Ziel, wird unversöhnlich. Fragen Sie den P-1000 P-97 Pipette Kochbuch 2011 von Sutter Instruments für eine volle Pipette Diskurs über Konstruktion und Fertigung 19. Die Parameter für die Pipetten in dieser Arbeit verwendet werden oben und stellte fest, ihre Herstellung wurde komplett vorher diskutiert 11. Die verfahrenstechnischen Hinweise in der Bedienungsanleitung für die Sutter Instruments BV-10 Beveler sind auch eine hervorragende Ressource.
Verstehen, warum die Misstargeting otocyst durch transuterine Mikroinjektion auftritt: Das Video präsentiert das ideale Ergebnis für transuterine Mikroinjektion in der E11.5 und E12.5 otocyst. Misstargeting die otocyst resultiert normalerweise aus injizieren zu oberflächlich, zu tief, oder nur unzureichend hergestellt aus Pipetten. Abbildung 2 zeigt diese Bedingungen. TafelA zeigt eine seitliche Ansicht der linken Seite eines E12.5 Embryos durch Durchleuchtung nach erfolgreicher transuterine Mikroinjektion von Fast Green Lösung in die otocyst abgebildet. Die Rautenhirn (hb) sich von einer keilförmigen Einschnitt dorsal der otocyst. Das Auge (E) eine Ring von Pigment entlang seines Umfangs und der linken Vorderbein im Vordergrund steht. Der Hauptstamm des primären Kopf Vene (PHV) ist direkt unter der otocyst. Die otocyst wird mit schnellen Grüns, schwarz gefüllt erscheint: die Rücken-, Ductus endolymphaticus (ED) und die Vorhalle des otocyst (OC) zu verzeichnen ist. Erfolgreiche Ausrichtung des E11.5-12.5 otocyst wird stets eine klar erkennbare Ductus endolymphaticus und Vorraum. Panel A 'zeigt das gleiche Bild wie in A ohne das White Labeling, um die kritische Durchsicht des injizierten otocyst erleichtern.
Abbildung 2. Eine bildliche Anleitung zur Misstargeting die otocyst durch transuterine microinjection. Alle Paneele zeigen die linke Seitenansicht eines E12.5 Embryos mit Mittelhirn und Vorderhirn links, mit Ausnahme Panel-H, die eine dorsale Ansicht des Hinterhirn-Mittelhirn Region ist. Panels in jeder Zeile repräsentieren Bilder von der gleichen Embryos. Siehe die Diskussion für eine detaillierte Erklärung der Ursachen von otocyst Misstargeting. Abkürzungen: e, linkes Auge, ed, Ductus endolymphaticus, fg, schnell grün, HB, Hinterhirn, lb, Extremitätenknospe; oc, otocyst; ot, Ohr-Gebiet; p, Pipette, PHV, primäre Kopf Vene; pt, Pipettenspitze.
Oberflächliche Injektion ist eine häufige Ursache von Misstargeting. Panels WERDEN zeigen eine oberflächliche Injektion in die E12.5 Konzeptus. Das Rautenhirn (HB) und die Kerbe otic Gebiet (OT, Kreis) sind offensichtlich in dieser linken, seitlichen Ansicht. Die Mikroinjektion Pipette (p) steht im Vordergrund. Fast Green (fg) beginnt, sich von der Pipettenspitze (B) auszuwerfen, und mit anschließender Impulse von dem Injektor (CD), die Farbstoff diffundiert in einer ovalen-Form. Die Verteilung von the Farbstoff legt nahe, dass es zwischen der Gebärmutterwand und die viszerale Dottersack, eine Membran, die die extraembryonale exocoelomic Hohlraum umgibt eingeführt. Der Versuchsleiter sollte nicht versuchen, wieder gezielt die otocyst in dieser Embryo sollte aber gehen Sie zum nächsten Embryo. Mehrere Injektionen korrelieren mit einer verminderten Überlebensrate der Embryonen, ein Effekt, der noch akuter bei E11.5 E12.5 ist als.
Verpressung ist eine weitere häufige Ursache für Misstargeting. FH Panels zeigen eine Injektion Flugbahn, die durch die otic Gebiet in den Rautenhirn passiert. Der primäre Kopf Vene (PHV), sind linke Auge (E), und Pipette (P) in dieser Seitenansicht eines E12.5 Embryos offensichtlich. Der anfängliche Ausstoß schnell grün (fg) wird dorsal in Bezug auf den primären Kopf Vene / otic Gebiet verdrängt. Mit nachfolgenden Pulse, wurde die keilförmige Rautenhirn (hb) vollständig mit Fast Green (Panel G) gefüllt ist. Eine 90-Grad-Drehung des Embryos injiziert erlaubt die Detektion von Fast Green im hindbraim Hohlraum von der dorsalen Ansicht (Panel-H). Sowohl oberflächliche und tiefe Injektionen ergeben sich aus der Unfähigkeit, die Tiefe der Mikroinjektion Pipette wahrzunehmen nach Kontakt mit der Gebärmutter ist. Ein praktischer Ansatz, die gut funktioniert ist, um die Pipette durch die Gebärmutter zu fördern und dann sofort wieder zu pulsieren, um für einen Hauch von schnell grün aussehen: die Lage des Blätterteig gibt die ungefähre Position der Pipettenspitze. Passen Sie ausführlich über dieses Bereichs-Befund Puls basiert.
Unzureichend hergestellt Pipetten sind die häufigste Ursache von Misstargeting. Die Injektion Versuch in Panels gezeigt IK wurde mit einer Pipettenspitze, die manuell gebrochen wurde, aber nicht abgeschrägt durchgeführt. Die Seitenansicht des E12.5 Embryos zeigt die Rautenhirn (hb), linkes Auge (E), und die Mikroinjektion Pipette (p). Beachten Sie, dass die Pipettenspitze (pt) ist scharf gebogen und hat es versäumt, die Gebärmutter eindringen (Tafel I). Die Anwendung der zusätzlichen Kraft schert die Spitze der Pipette (Panel J, Pfeil), so dass die pipette Spitze in der Gebärmutter verankert. Eine kleine Menge Fast Green (fg) wurde von der zerbrochenen Pipette ausgestoßen und hat entdeckt die Oberfläche des Uterus. Der Embedded-Pipettenspitze (Systemsteuerung K) muss mit feinen, sterilen Pinzette entfernt und entsorgt als spitze oder scharfe Gegenstände Abfälle. Wenn die Pipettenspitze nicht gefunden werden kann oder erfolgreich entfernt, einschläfern den Damm unter Narkose.
Dokumentieren Sie prozedurale Beobachtungen auf einer Maus Überleben Chirurgie konsultieren: Ein entscheidendes Element, um das Erlernen dieser Methoden besteht darin, Beobachtungen zu dokumentieren und Anpassungen vornehmen zu diesen Beobachtungen. Produzieren Sie eine Maus Überleben Chirurgie Datenblatt und beachten Sie präoperativen, operativen und postoperativen Angaben. Präoperative Daten gehören Damm Gewicht, Dosis des Anästhetikums geliefert, Plasmid-injizierten, etc. Operative Daten umfassen den Embryo injiziert (dh R2 ist der zweite Embryo vom Eierstock in die richtige Uterushorn), die Qualität der Injektion (dh keine endolymphatischen Kanal detektiert, Farbstoff in 4
Verwenden Sie aktuelle pro Impuls geliefert, um die Transfektionseffizienz zu optimieren: Der Rechteckimpuls Zug besteht aus 5, 43volt, 50msec Pulse mit einer 950msec unterImpulsverzögerung. Die 5mm Platin, sicherzustellen paddelartige Elektroden, dass das gesamte Gebiet otic innerhalb des elektrischen Feldes enthalten ist. Ähnliche Transfektionseffizienzen mit 3mm Schaufeln erreicht werden, wenn sie schwieriger genau zu positionieren sind. Der Puls Paradigma durch Auswertung des übertragenen Stroms zu dem Embryo während der letzte Puls optimiert, nicht durch Abtasten durch Spannungen und die Beurteilung der Transfektionseffizienz. Der Grund ist, dass der Strom pro Impuls abgegeben bei einer konstanten Spannung in Abhängigkeit von der Durchlässigkeit der elektrischen Kopplung zwischen der Gebärmutter und der Platin-Elektroden variiert. Vorausgesetzt, dass die Gebärmutter frisch ist mit Ringer-Laktat-Lösung unmittelbar vor der Platzierung der Paddles und Ladungsträger im Überschuss vorhanden ist bewässert, ist der Chef Variable die Menge der "Kopplung" Druck auf die Gebärmutter mit den Paddeln. Sanfter Druck auf 43volts Ergebnisse in <60mAmps von Strom geliefert und sporadischen Transfektion am besten. Moderate Druck bei 43VOLTS Ergebnisse in 60-100mAmps geliefert und die beste Transfektionseffizienz. Starker Druck auf 43volts Ergebnisse in> 100mAmps geliefert und korreliert mit anhaltend verändert Herzfrequenz und erhöhte embryonale Letalität. Übermäßiger Druck zerreißt den viszeralen Dottersack (a "Pop" kann durch den Paddeln zu spüren) und bewirkt, dass embryonale Letalität. Es ist wahrscheinlich, dass die Variable ausgeübte Druck die Impedanz zwischen den Elektroden, welche die gelieferten Strom wirkt verändert. Die Pulsfrequenz von 1 Hz (50 ms ein Impuls pro Sekunde) wurde als das am wenigsten störend des Embryos Herzzyklus, die eine positive Korrelation zur Überlebensrate der Embryonen ist definiert. Wir schlussfolgern, dass der wichtigste Parameter, um beim Aufbau eines effizienten In-vivo-Elektroporation Paradigma überwachen der Strom pro Impuls geliefert wird. Änderung einer Puls-Paradigma sollte eine sorgfältige Überwachung des Stromes pro Impuls geliefert.
Adoptieren Sie einen modularen Ansatz für das Lernen thE-Technik: Modul 1: Üben Sie einen Schein-Operation mit Uterus-Externalisierung, aber nicht injizieren oder elektroporieren. Dams tolerieren ventralen Laparotomie sehr gut und sollte nie erfahren postoperativen Komplikationen im Zusammenhang mit chirurgischen Technik. Die Überlebensrate der Mäuse chirurgischen Fähigkeiten sind zweifellos mit Wohnsitz in der Heimathochschule so verfolgen, eine angemessene Ausbildung. Erreiche Beherrschung der chirurgischen Fertigkeiten, bevor Sie fortfahren. Modul 2: Praxis transuterine Mikroinjektion in der otocyst auf einer narkotisierten Damm ohne die Erwartung der Fertigstellung des Überlebens Chirurgie: einschläfern den Damm unter Narkose, isolieren die injizierten Embryonen, und bewerten die Qualität der otocyst Injektionen. Modul 3: Target nur 2 otocysts in 2 verschiedenen Embryonen mit schneller grün, nicht elektroporieren, vervollständigen die Chirurgie, und zu validieren nachgelagerten embryonale Überleben. Modul 4: Target nur 2 Embryonen mit DNA / schnell grüne Lösung, elektroporieren, validieren nachgelagerten Überlebensrate der Embryonen, und festzustellen, die Transfektion efenz. Modul 5: Target nur 2 Embryonen mit DNA / schnell grüne Lösung, elektroporieren, spritzen Alexa Fluor in der 4. Ventrikel, um die manipulierten Embryonen zu kennzeichnen, wählen beschriftet Embryonen bei P0 und ermitteln, die Transfektionseffizienz.
Procedural Lernkurve: Beherrschung der Maus Überleben OP-Techniken, mit entsprechender Anleitung durch den Veterinär-und OP-Personal der eigenen Heimathochschule, ist ziemlich schnell und sollte nur verlangen, 05.03 Dämme-wert der Praxis für den Anfänger zum Know-how zu gewinnen. Transuterine Mikroinjektion und in vivo Elektroporation transfiziert, um sinnvoll Innenohr generieren 10-50 Dämme-Wert von Aufwand erfordern, vorausgesetzt, es gibt 6 praktikable Embryonen pro Schwangerschaft und der modulare Ansatz verfolgt wird. Diejenigen Studenten, die Aktivitäten, die Feinmotorik erfordern genießen (dh, ein Musikinstrument zu spielen, Nähen, Modellbau, oder Leistungssport) haben kürzere Ausbildungszeiten als those, die dies nicht tun. Die kritischen Korrelate für die erfolgreiche Meisterung dieser Methoden sind größter Liebe zum Detail (dh, die Mikroinjektion Pipette Fertigung, Gefäßanatomie, explizite mitschreiben) und einer einigermaßen ruhiges Verhalten.
Workflow: Einmal gewonnene Know-how wird, kann man erwarten, Injektion und Elektroporation von 4-6 Embryonen pro Muttertier; 3-5 Embryonen überleben wird; und 2-4 Embryonen wird sinnvollerweise transfiziert wurden Innenohr für die Analyse. Das Hinterhirn Alexa Fluor Labeling Verfahrens zur Kennzeichnung von Embryonen für die Sortierung bei der Geburt erfordert die zusätzliche Injektion Hinterhirn in jedem elektroporierte Embryo, aber das ist gut verträglich und nicht beeinträchtigt Prozessökonomie. So vergleicht der Recovery Rate von sinnvollerweise transfiziert Innenohr aus In-vivo-Elektroporation positiv auf die Recovery Rate von homozygoten mutierten Mäusen aus einer Zucht heterogygous Paradigma. Mit Erfahrung, ist 2-3 Dämme pro Experimentator pro Tag eine vernünftige ArbeitFlow: 1,5 Std. pro Muttertier für Chirurgie und eine Gesamtmenge von 1,5 bis 2 Stunden für die postoperative Überwachung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Humana Press für die Erlaubnis, die Mikroinjektion Pipette Herstellung Figur, die ursprünglich auf Seite 130 der Verweis 11 erschienen zu veröffentlichen; Larry Dlugas und Steven Wong, OHSU Abteilung Pädagogische Kommunikation, für die Videografie; Larry Dlugas für Video-Design und-Bearbeitung; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco für die Gestaltung unserer kundenspezifischen horizontale Laminarströmungshaube und Les Goldsmith für die Bereitstellung der technischen schematische; Monterroso Victor, MW, MS, PhD und Tom Chatkupt, DVM, OHSU Abteilung für Vergleichende Medizin, zur Orientierung mit unseren Tierpflege-Protokoll, chirurgische Techniken, und eine prophylaktische Therapie Analgesie; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, für die gemeinsame Nutzung seiner Handzettel auf tierärztliche Nahttechniken; Edward Porsov, MS, für die Gestaltung unserer Adobe Premiere Pro Video-Mikroskopie Computer-Arbeitsplatz, und Leah und Weiß Jonas Hinckley von LNS Captioning (Portland, OR). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute on Taubheit und anderen, unterstütztr Communication Disorders: DC-und DC-008595 R01 R01 008.595-04S2 (JB) und P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core-Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
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