Summary
Een 3D cultuur voor hematopoiesis beschreven met menselijke navelstrengbloed en leukemische beenmergcellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van een poreuze kunststof polyurethaan scaffold bekleed met extracellulaire matrix. Deze steiger is aanpasbaar aan een groot aantal cellen te passen.
Abstract
Hematopoietische stamcellen dat er een unieke micro-omgeving om bloedcel vorming van een te ondersteunen; het beenmerg (BM) is een complexe driedimensionale (3D) weefsel waarin hematopoiese wordt geregeld met behulp van ruimtelijk georganiseerd cellulaire micro-omgevingen genoemd niches 2-4. De organisatie van de BM niches is van cruciaal belang voor de functie of disfunctie van normale of kwaadaardige BM 5. Daarom is een beter begrip van de in vivo micro-omgeving met behulp van een ex vivo mimicry zou ons helpen ophelderen van de moleculaire, cellulaire en microenvironmental determinanten van leukemogenese 6.
Op dit moment zijn hematopoietische cellen gekweekt in vitro in twee-dimensionale (2D) weefselkweekflessen / well-platen 7 tot hetzij co-cultuur met allogene of xenogene stromale cellen of toevoeging van exogene cytokines 8. Deze voorwaarden zijn kunstmatige en verschillen van de in vivo 9,10.
Hierin stellen we een nieuw 3D beenmerg teeltsysteem de simuleert in vivo 3D groeiomstandigheden en ondersteunt multilineaire hematopoiesis in afwezigheid van exogene groeifactoren. De sterk poreuze in dit systeem uit polyurethaan (PU) maakt een hoge dichtheid celgroei in een hoger specifiek oppervlak dan de conventionele monolaagkweek in 2D 11. De werk heeft aangetoond dat deze model de groei van menselijke navelstrengbloed (CB) mononucleaire cellen (MNC) 12 en primaire leukemische cellen in de afwezigheid van exogene cytokines ondersteund. Deze nieuwe 3D-mimicry biedt een levensvatbaar platform voor de ontwikkeling van een menselijk experimenteel model om hematopoiese te bestuderen en om nieuwe behandelingen voor leukemie te ontdekken.
Protocol
1. Steiger Fabricage en Bio-functionalisering van steigers
- Om PU steigers (poriegrootte 100-250 mm, porositeit 90-95%) fabriceren in de vorm van petrischaal schijven, met de thermisch geinduceerde fasescheiding 13 werkwijze bereid door een polymeer oplossing (5 gew% in dioxaan), gevolgd door bevriezing en vervolgens solvent sublimatie (figuur 1a).
- Snijd het schavot schijf in blokjes van 0,5 x 0,5 x 0,5 mm voorafgaand aan het coaten met ECM eiwitten (Figuur 1B).
- Pre-nat het steigers door het onderdompelen in ethanol (70%) gedurende 1 minuut en vervolgens over in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 minuten. Centrifugeer 10 min bij 3630 x g en voeg de eiwitoplossing.
- Centrifugeer de steigers in de eiwitoplossing op 1420 g gedurende 20 minuten.
- Om de oppervlakteporiën vrijgeven en laat de cellen uitgezet dieper door te dringen in de scaffold, gecentrifugeerd steigers een keer op 910 g gedurende 10 minin PBS.
- Steriliseren steigers een combinatie van 8 min blootstelling aan 230 V, 50 Hz, 0,14 A, UV lamp met onderdompeling gedurende 2 uur in ethanol (70%). Daarna tweemaal wassen steigers in PBS voor het toevoegen Iscove gemodificeerd Dulbecco Medium (IMDM) aangevuld met 30% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline en streptomycine (P / S). Plaats steigers in een bevochtigde incubator gedurende 3 dagen bij 37 ° C en 5% CO2 voor gebruik. Steriele steigers zijn geplaatst in een 24 wei-weefselkweek platen (scaffold per putje).
2. Mononucleaire Cell Isolatie en Steiger zaaien
- Uittreksel menselijke MNC uit navelstrengbloed of leukemische beenmergmonsters met Ficoll-Paque dichtheid gradiënt centrifugatie (35 min bij 1500 rpm) (figuur 1c).
- Resuspendeer MNC in IMDM met 30% FBS en 1% P / S.
- Zaad 100 ul van MNC suspensie (2 × 10 6 cellen / steiger) op de steigers met behulp van een micro-pipet.
- Incubeer de geënte steigers bij 37 ° C onder 5% CO2 gedurende 10 minuten om de cellen te regelen in de steigers.
- Vul elk putje met 1,5 ml IMDM met 30% FBS en 1% P / S en plaats putjes in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de duur van het experiment.
- De geplaatste steigers ondergaan dagelijks veranderen van alle media.
3 In situ celproliferatie en Morfologie:. MTS, SEM en Cytospins
- MTS assay: Verwijderen uit cultuur een niet-geplaatste en twee geplaatste steigers en doe dit in een schone nieuwe 24 mooie plaat. Voeg 1 ml medium en 200 ul van de MTS oplossing en incubeer 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Neem 8 x 100 pi monster van de supernatant, in een 96-well plaat en maatregel absorptie bij 490 nm met een microplaat lezer.
- Scanning elektron microscopie (SEM): Op verschillende tijdstippen van the cultuur, verwijder de steigers bezaaid met MNC uit de media, en bevestig deze met 2,5% PBS-gebufferde glutaaraldehyde oplossing gedurende 40 min bij 4 ° C, vervolgens twee keer wassen met PBS.
- Gedroogde de stellingen in een gegradeerde reeks van ethanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 en 100%), elk voor 10 min en drogen in een aseptische omgeving gedurende 4 uur.
- Sectie monsters en sputteren laag met goud in een argon atmosfeer gedurende 2 min voor SEM evaluatie gebruik van een versnellingsspanning van 20 kV.
- Cytospins: Verzamel 2,0 x 10 4 cellen / dia door opzuigen van de cellen van het schavot op verschillende tijdstippen in de cultuur.
- Centrifugeer de cellen op een glasplaatje gedurende 3 minuten bij 1500 rpm.
- Vlekken op de dia's met Wright-Giemsa vlek Gewijzigd en observeren met behulp van een optische microscoop. F-view Soft Imaging System kan worden gebruikt om foto's te maken.
- Was de dia's voorafgaand aan de microscoop observatie.
- M ultiphoton analyse: Fix steigers op verschillende tijdstippen met ethanol damp (70%) 's nachts en daarna droog en bewaar bij -20 ° C tot verdere analyse. Voorafgaand aan de visualisatie van de multifoton microscoop gedeelte van de steiger in 30 micrometer dikke dia's en nat met PBS.
- Blokkeren gezaaide steigers in PBS met 10% foetaal runderserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de steigers overnacht bij 4 ° C in het donker met een 1:50 verdunning van de primaire monoklonale antilichaam: muis anti menselijke CD71.
- Spoelmonsters driemaal in PBS en kleuren met het secundaire antilichaam: anti-muis Alexa Fluor 488 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Spoelmonsters drie keer met PBS en geobserveerd met een confocale microscoop met een water emissie x60 objectieflens.
- Fluorofoor Alexa Fluor 488 is enthousiast bij 488 nm door de pulserende lasers. Volocity 5.3.2 software kan worden gebruikt voor verdere beeldverwerking.
- Voordat cellulaire analyse in de flowcytometer (FC), het etiket van de cellen van belang met de bijbehorende immunofluorescentie antilichamen voor de detectie. Een aantal monsters bereid volgens de geselecteerde antilichamen voor detectie. Voor detectie MNC de volgende combinatie van antilichamen gebruikt: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Zuig de cellen van de steiger op verschillende tijdstippen en centrifuge. Los een celpellet van ongeveer 1x10 cellen 6 in 100 pi FC buffer (PBS + 0,1% natriumazide) en wordt 10 pi van elk antilichaam fluorescentie kleurstof. Incubeer de cellen 30 minuten bij 4 ° C, tweemaal gewassen met PBS en uiteindelijk resuspenderen in FC buffer.
- Laad het monster in de flowcytometer gekleurd met de isotype controle naar de "negativiteit" van het antilichaam uitdrukking te stellen en te kalibreren de detectie kanalen met de flowcytometer controle.
- Lees het monster gekleurd w et de drie verschillende antilichamen en tenslotte vormen de gegevens in met de WinList software.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van hematopoïetische cellen groeikinetiek zonder toevoeging van exogene groeifactoren is weergegeven in figuur 2. Als gevolg van de heterogene aard van hematopoiese, twee verschillende cellen: normale en abnormale hematopoietische cellen worden geïllustreerd. In figuur 2A cellulaire proliferatie van humane CBMNC blijkt na 28 dagen kweek. Figuur 2B toont de groeikinetiek van de nabootsing met humane primaire leukemische cellen. Cellulaire proliferatie wordt beoordeeld op basis van de MTS assay die cellulaire metabole activiteit in relatie tot absorptie meet. In beide gevallen de cellen toegenomen en die in het model. Verschillen in groei kinetiek in acht worden genomen; normale hematopoietische cellen bepalen de cultuur sneller dan de leukemische cellen.
_content "> De morfologie van de geoogste cellen zelfs na 28 dagen kweek bij afwezigheid van exogene groeifactoren is typisch normale hematopoïetische cellen (Figuur 3A) en leukemische cellen (Figuur 3B). centrale delen van de steigers geanalyseerd door SEM na de stellingen werden verwijderd uit de cultuur heeft het verspreiden van de gezaaide cellen in de scaffold, vestiging in clusters en "nis-achtige" structuren (Figuur 3A 'en B'). figuur C toont de poriegrootte en distributie in een unseeded steiger gebruikt als controle. multiphoton microscopie na 28 dagen werd gebruikt om de verdeling van de cellen in de 3D scaffold in situ te markeren en toonde de aanwezigheid van erythroid eilanden centrale delen van de stelling (figuur 4) door de expressie van het merker CD71 die positief is in erytroblasten. Dit bewijst het belang van volwassen en volwassen cellen during erytropoëse. Tenslotte flowcytometrie grafieken van de cellen vóór het zaaien wordt het verschil in het fenotype van hematopoïetische cellen, waarbij figuur 5A van normale hematopoïetische cellen menselijke CBMNCs en figuur 5B illustreert abnormale hematopoïetische cellen: primaire leukemische cellen. Niveaus van CD235a + en CD45 + overeenkomt met erythrocyten en leukocyten respectievelijk hoger in de normale monster dan in de leukemische gewezen op de hemoblastic aard van de leukemie.
Figuur 1. Illustratie van de processen die betrokken zijn bij PU steiger productie en bio-functionalisering. A) PU wordt opgelost in dioxan (5 gew%) en de thermisch geinduceerde fasescheiding en de daaropvolgende oplosmiddel sublimatie de steiger wordt geproduceerd, zoals beschreven door Safinia et al. 13. B) De steiger schijf wordt vervolgens gesneden into blokjes van 0,5 x 0,5 x 0,5 mm en vervolgens bekleed door centrifugeren met extracellulaire matrix (ECM) eiwitten. C) MNC worden gewonnen uit menselijke navelstreng CB of bij BM aspiratie met behulp van dichtheidsgradiënt centrifugeren en gezaaid (2x10 6 cellen / steiger) in de PU steigers met een micropipet.
. Figuur 2 cellulaire proliferatie gemeten met behulp van de MTS-test: A) met behulp van menselijke navelstrengbloed MNC's, B) met behulp van menselijke primaire leukemische cellen. De kolommen laten de groei van cellen in de tijd indien uitgezet in de PU steigers zonder de toevoeging van exogene cytokines.
Figuur 3: Cel morfologie en verdeling rond de steigers met behulp van cytospins, scanning electronenmicroscoop. (AB) Representatieve Wright-Giemsa gekleurd cytospins van A) navelstrengbloed mononucleaire cellen verzameld uit PU steigers na 28 dagen van cultuur, en B) bot aangezogen leukemische cellen verzameld uit PU steigers na 14 dagen van de cultuur. Beide experimenten werden uitgevoerd in cytokine vrije toestand. (A'-B ') Representatieve centrale delen van de PU steiger SEM microfoto van A') geplaatste navelstrengbloed multinationals en B ') leukemiecellen na gekweekt gedurende 28 dagen, en C) controle steiger met geen cellen.
Figuur 4. Multifoton microfoto van een PU steiger bezaaid met navelstrengbloed multinationals na 28 d in cultuur en gekleurd met de erytroïde marker CD71.
Figuur 5. Flowcytometrie 3D dot-plots gekleurd voor CD45, CD71 en CD235a oppervlakte-expressie merkers. Het verkregen isotypecontrole ook ter vergelijking van de relatieve fluorescentie intensiteit. Paneel A toont menselijk navelstrengbloed mononucleaire cellen positief voor bovengenoemde markers, Paneel B toont humane primaire leukemische cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ex vivo 3D-cultuur systeem hier gepresenteerde stelt ons in staat om een 3D-biomimicry van hematopoiese dat recapituleert de originele BM architectuur en cellulaire fenotype onafhankelijk van exogene cytokines. De 3D-model biedt de structuur en de micro waarmee normale en abnormale hematopoïetische cellen prolifereren omstandigheden vergelijkbaar met die aangetroffen in vivo.
De selectie van het polymère steigermateriaal betekende een belangrijke stap in de biomimicry ontwerp. Belangrijke voordelen in biomaterialen hebben geleid tot een toenemende belangstelling voor polymeren die het na te bootsen in vivo omgeving door het verstrekken van de benodigde architectuur, structurele eigenschappen en de nodige biosignalen. De polymeren moeten voldoen aan de minimumvereisten essentieel voor toepassing in medische biologie want ze zijn in direct contact met levende cellen die gevoelig zijn voor de omgeving. In het algemeen een iveel steiger moet biocompatibel zijn, poreuze, voldoende mechanische sterkte om een gedefinieerde 3D-structuur, hoog specifiek oppervlak per volume-verhouding en reproduceerbare fabricage handhaven. PU omvat alle eigenschappen samen hoewel de hoge porositeit en mechanische sterkte kan worden aangepast en veranderd afhankelijk van de temperatuur tijdens het blussen TIPS proces. Hierdoor kan deze biomimicry worden aangepast aan andere cellen door verhoging of verlaging van de porositeit en poriegrootte nodig.
De steiger van dit experiment wordt bedekt met de ECM collageen type I, dit eiwit samen met andere ECM eiwitten eerder getest met onze 3D model 11. Hieruit bleek dat collageen type I versneld celadhesie en geselecteerd om die reden. De coating kan worden gewijzigd door verschillende ECM eiwitten afhankelijk van het type cellen die onderzocht. Het voordeel aan de ECM eiwitten te nemen aan de synthetische steigers is niet alleen zij de celbindende sequentie voor celhechting, maar ook secundaire interacties met andere proteïnen ECM interacties met groeifactoren die de binding van de cellen aldus de celadhesie, wat resulteert in betere celgroei en maturatie te stabiliseren.
Talrijke studies hebben gedaan naar ex vivo hematopoiese met behulp van zowel 2D-en 3D-systemen, en ze allemaal omvatten de toevoeging van abnormaal hoge concentraties van exogene cytokines. Deze studies hebben bijgedragen tot de moleculaire determinanten van hematopoiese toe te lichten, maar de cellulaire en microenvironmental elementen integraal onderdeel van dit proces zijn moeilijk te ontcijferen op basis van de beperkingen van deze zelfde technieken.
De hier beschreven methode een biomimicry de BM gemaakt van een zeer poreuze polymère scaffold gekoppeld ECM coating optimaal is voor het handhaven en stabiliseren van de groei van normale en abnormale hematopoiese zonderde noodzaak van toevoegen van cytokines. De mimiek ondersteunt multi-lineaire hematopoiese waardoor het systeem geschikt voor gebruik als een platform voor drug discovery en wetenschappelijk onderzoek naar mechanismen van normale en abnormale hematopoiese ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Richard Thomas Leukemie Fonds, de Vrouwe Tata Memorial Trust, het Northwick Park Hospital Leukemie Research Trust Fund en het National Institute of Health Research (NIHR), Verenigd Koninkrijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N. Methods in Cell Biology. Prescott, D. 14, Academic Press Inc. New York. 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
