Summary
Мы разработали 3D-моделей coculture для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между опухолевых клетках молочной железы и других клеток в их микросреды, влияющих на прогрессирование инвазивного фенотипа. Эти модели могут служить в качестве экранов для доклинических наркотиков целевой паракринной вызванных протеолитических, хемокинов / цитокинов и киназы пути причастных к инвазии.
Protocol
1. Подготовить DQ-подложки
- Позвольте лиофилизированный DQ-подложки нагревали до комнатной температуры перед открытием флаконов, готовят маточный раствор 1 мг / мл DQ-подложки в деионизованной воды, разделить на 50 мкл аликвоты и хранят при температуре 4 ° C.
Это может быть необходимо, чтобы агитировать DQ-подложки в ультразвуковой ванне воды ~ 5 мин и тепла до 50 ° C для облегчения дисперсии.
- Оттепель УКР на льду в течение ночи при 4 ° С; УКР должны решаться на льду во все времена.
- Для того, чтобы 10 раз фосфатным буферным раствором (PBS), растворите 80 г NaCl (1,37 м), 2 г хлорида калия (0,027 М), 14,4 г Na 2 HPO 4 (1 м), и 2,4 г KH 2 PO 4 (0,02 М) в 800 мл воды высокой степени очистки. Отрегулируйте рН буферного раствора PBS до 7,4 с 1,0 М HCl. Довести объем до 1 литра, стерилизуют путем фильтрации.
- Подготовить коллагена I решения на льду: 8 частей охлажденной коллагена I и 1 часть охлажденного 10х PBS. Отрегулируйте рНсмеси на 7,2-7,6 стерильные 0,1 М NaOH. Проверьте рН с рН полосы и установить окончательный объем до 10 частей стерильной водой.
- Подготовить DQ-коллаген I: коллаген I матрицы путем разбавления DQ-коллаген I коллагена I решения в prechilled трубы до конечной концентрации 25 мкг / мл и 2,4 мг / мл, соответственно.
- Подготовить DQ-коллагена IV: восстановленный базальной мембраны (УКР) матрицы путем разбавления DQ-коллагена IV в УОР (Cultrex или Матригель) в prechilled трубы до конечной концентрации 25 мкг / мл и 12-15 мг / мл, соответственно. Смешать на льду с нежным пипетирования, чтобы избежать создания пузырей.
2. Подготовить MAME cocultures
См. Рисунок 1 Схема cocultures.
- Поместите два прямоугольных пластиковых покровные (стерилизуют в 70% спирте в течение 10 мин и сушат на воздухе) в 35-мм культуры блюдо или использовать IbiTreat 35-мм μ-блюдо. Проезд здесь для покровных и μ-блюда, которые мы используем для студентовумирает на прямой микроскоп. Для исследования на инвертированный микроскоп, мы используем только μ-блюда.
- Смешайте необходимое количество фибробластов с DQ-коллаген I: коллаген I матрицы. Для долгосрочных cocultures показано на рисунках 2 и 3, мы используем 500 фибробластов в 10 мкл среды плюс 60 мкл DQ-коллаген I: коллаген I матрицы.
- Использование 100-мкл micropipettor, тщательно пипетки и распространение 70 мкл фибробластов: DQ-коллаген I: коллаген I матрицы по всей поверхности каждого покровного и оставить на 37 ° C в увлажненном инкубаторе без CO 2 в течение 30 минут, чтобы затвердеть.
- Передача 35-мм блюд, содержащих покровные до 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 10 минут, чтобы уравновесить.
- Удалить из инкубатора и оставить 35-мм блюда под капотом, пока они не до комнатной температуры.
- Добавить 60 мкл DQ-коллагена IV: УКР матрица на вершине укрепили DQ-я коллагена: коллаген I матрица со встроенными фибробластов. С пипетки, околоrefully распространяться DQ-коллагена IV: УКР матрицы равномерно, избегая царапин фибробластов: DQ-я коллагена: коллаген I матрицы.
- Передача 35-мм блюд, содержащих покровные до 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 10 минут, чтобы затвердеть. В то время как DQ-коллагена IV: УКР матрицы твердеть, trypsinize и рассчитывать эпителиальных клеток.
- Место 50 мкл эпителиальных / опухолевых клеток на покровных подвески покрыты DQ-коллагена IV: УКР матрицы. Место 35-мм блюд, содержащих покровные в 37 ° C инкубатора. Позвольте от 40 до 60 минут клетки прикрепляются к DQ-коллагена IV: УКР матрицы. Для долгосрочных cocultures показано на рисунках 2 и 3, мы используем 2500 эпителиальных или опухолевые клетки.
- Добавить 2 мл культуральной среде, содержащей 2% УКР каждого 35-мм блюдо. Если делать любой лекарственной терапии, лекарства должны быть добавлены в это время.
- Инкубировать требуемый период времени, прежде чем изображения. За многолетнюю культуру, средства массовой информации следует менять каждые 3-4 дней. Клетки могут быть сохраненыв нормальном культуральной среде. Для MAME cocultures линии груди клетки, мы используем эпителиальных базальных Средний (MEBM-PRF) с добавлением SingleQuots MEGM.
3. Выполните 4D (3D + время) изображения живых MAME cocultures по конфокальной микроскопии
- Для доказательства правового принципа исследования показано, MAME cocultures были помечены флуоресцентным красителем отслеживания ячейки в соответствии с нашей процедурой опубликован 1. После промывки PBS, cocultures инкубировали с 5 мкМ CellTracker оранжевой средней MEGM в течение 45 мин при 37 ° C инкубатора, промывают снова PBS и инкубировали с нагретого MEGMmedium в течение 30 минут в 37 ° C с 5% CO 2 инкубаторе до изображения .
- Изображение MAME cocultures жить в малом увеличении (10х, вода погружения линз) на Zeiss LSM-510 META конфокальной микроскопии.
- Оптический разделы захватили с интервалами на всю глубину структур. Для нашего исследования, мы фиксируем оптических срезов в 10мкм интервалами.
- Использование оптических разделы для восстановления изображений в 3D. Мы используем Volocity программное обеспечение для создания 3D-реконструкции.
- Сделать фильмы 3D реконструкции, так что структуры, клетки: клетка взаимодействия и взаимодействия с окружающими матрицы могут быть визуализированы. Мы сделали фильмы с QuikTime Player 7.
4. Представитель Результаты
MAME cocultures, который мы разработали являются послушными экспериментальная модель для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между различными сотовой избирателей, что составляет опухоли молочной железы и его микросреды. Здесь мы показываем возможности модели MAME резюмировать клетки: клетка взаимодействия во время кормления прогрессии рака и живых клеток изображений следовать этим взаимодействием с течением времени. Проиллюстрируем возможности изображения взаимодействия между преинвазивных MCF10.DCIS линии человеческих клеток рака молочной железы и рака молочной железы человека связанного линии фибробластов, WS-12ти болеев течение более трех недель в культуре. Cocultures были обследованы на 3, 16 и 23 дней. Оптический разделов через весь объем cocultures были реконструированы в 3D и характерные примеры приведены для каждого из трех моменты времени на рисунке 2. Красной флуоресценции на рисунке 2 представляет MCF10.DCIS и WS-12ти клеток. Чтобы различать два типа клеток и для долгосрочного cocultures можно трансфекции или трансдукции отдельных типов клеток с флуоресцентными белками до создания культуры. Coculture MAME из MCF10.DCIS и WS-12ти клеток, которые дифференциально помечены флуоресцентных белков для идентификации показано на рисунке 3.
Объединив субстратов, в этом случае DQ-коллагенов, в MAME cocultures, мы можем оценить и количественно меняется во времени в протеолиза связанные с переходом к инвазивным фенотипом. Мы создали методы количественной флуоресцентной продуктов расщепления, которые приводят кот DQ-деградации коллагена 2,3. Мы нормализации продукты распада по всей 3D-объем MAME cocultures в расчете на клетку маркировки и подсчета клеточных ядер. Кроме того, мы можем локализовать деградации внеклеточного и внутриклеточного отсеков и количественной оценки общего, внутри-и внеклеточных продуктов распада, как мы описали выше 2. Зеленая флуоресценция на рисунках 2 и 3 представлены продукты расщепления двух DQ-коллагеновых субстратов. В это время, дифференциально-меченных коллагена не доступны, которые позволили бы нам провести различие между деградации коллагена IV типа и деградации коллагена типа I.
Взаимодействия в MAME cocultures динамичны и могут меняться с течением времени. Для получения временной и динамической информации, то же самое поле зрения может в образ и оптических срезов, сделанные через весь образец объема неоднократно в течение периода времени от нескольких минут до нескольких недель,Таким образом сбор данных в 4-D. На рисунке 2 мы показываем довольно драматические изменения, которые происходят в течение 23 дней: изменение числа клеток, миграцию клеток и клеточных взаимодействий, структура объемы, структура формы, отклонения структуры от сферичности, инвазивные наросты и протеолиза. Кроме того, мы продемонстрировали общее изменение объема в связи с MAME cocultures унижающее достоинство окружающих их внеклеточного матрикса в течение этого периода времени. На три дня, как показано на рисунке 2А, объемом 110 000 мкм 3. С другой стороны, объем MAME cocultures на 16 и 23 дней только 46 250 мкм 3, как показано на рисунках 2В и C.
Рисунок 1. Схема MAME cocultures. Пластиковые покровное покрыта коллагена I, содержащие коллаген DQ-я и фибробластов (пурпурный). 2-й слой восстановленного базальной мембраны (УОР), содержащий DQ-колЛаген IV добавляется. Опухолевые клетки (красный) высевают на вершине, и 2% УКР в культуральной среде накладывается (белые точки) при каждом изменении информации. Зеленый флуоресцентный представляет продукты расщепления DQ-коллаген I и IV.
Рисунок 2. MAME cocultures из MCF10.DCIS человеческих клеток рака молочной железы и WS-12ти фибробластов человека груди. Фибробласты были внедрены в коллаген I / DQ-коллаген я и выложил с УКР содержащие DQ-коллагена IV. DCIS Затем клетки высевают на ОРУ и выложил в средах, содержащих 2% УКР. За 23 дней в coculture показано здесь, было пролиферации клеток, деградации DQ-коллагена IV и I (зеленый) и коллагена матрицы, как показано на сокращение объема cocultures. Клетки были локализованы на маркировке с оранжевой CellTracker на месте до изображения (красного цвета). То же самое живое cocultures наблюдались в течение 23 дней с изображений, сonfocal микроскопии на 3, 16 и 23 дней coculture. В результате оптический кусочки были реконструированы в 3D с Volocity программного обеспечения. Увеличение, 10Х.
Рисунок 3. MAME 16 дней cocultures из MCF10.DCIS человеческих клеток рака молочной железы и WS-12ти фибробластов человека груди, которые выражают RFP (красный) и YFP (белый), соответственно. Cocultures были созданы и проанализированы как показано на рисунке 2. Эти два типа клеток показано здесь был, однако, были обозначены, поэтому дифференциально чтобы их можно было отличить друг от друга. Чем больше увеличение изображения в этой фигуре, по сравнению с тем, на рисунке 2, показывают, протеолиз DQ-коллагена IV на поверхности клеток DCIS и диффузных протеолиза коллагена DQ-я в районах вблизи фибробластов. Увеличение, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как показано, MAME cocultures может быть использован для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между различными сотовой избирателей, что составляет опухоли молочной железы и его микросреды. В текущие исследования в нашей лаборатории, мы использовали MAME cocultures определить протеолитические пути связано с переходом от DCIS к инвазивным раком протоков, а также взаимодействия между протеолитическими путей и других путей, участвующих в этом переходе, таких как хемокинов / цитокинов / рост пути фактор . Кроме того, мы показали, что MAME модели могут быть использованы в качестве инструмента для скрининга эффект небольшой молекулы ингибиторов, блокирующих антител или shRNAs, которые модулируют протеолитических / хемокинов / цитокинов / фактора роста путей 3-5. MAME модели могут быть использованы для живых клеток визуализации опухоли, вторжения и протеолиз на временах от минут и часов, как мы ранее показали, 6,7, до нескольких недель, как показано ниже на рисунках 2 и 3.взаимодействие наблюдается находятся между клетками одного вида, т.е. опухолевые клетки человека и опухолеассоциированным клетки, а не между опухолевых клеток человека и мыши, стромальные клетки, как и в прижизненных изображений 8. MAME модели послушной системе. Молекулы интерес может быть подавленные с shRNAs в отдельных типов клеток до coculturing так что их вклад в этом типе клеток к деградации DQ-коллаген может быть отображены и количественно в 3D-2. Условные информации из моделей MAME можно попробовать измерить изменения в секреции протеазы, цитокины и др. Полученная информация обеспечивает экспериментальную базу для проверки эффектов малых молекулы ингибиторов, блокирующих антител и т.д.
Клеточного состава MAME cocultures можно легко манипулировать, чтобы можно было использовать их, чтобы оценить вклад других типов клеток, встречающихся в опухоль микросреде (например, миоэпителиальные клетки, моноциты, эндотелиальные клетки кровисосудов и лимфатических происхождения) к злокачественной прогрессии 6,7. Число различных типов клеток, семенами, отношение одного типа клеток в другой, и продолжительность времени, в области культуры будет зависеть от конкретного типа используемой базовой станции и экспериментальные вопросы. MAME модели могут быть расширены для оценки влияния изменений в окружающей микросреды опухолей молочной железы, например, рН, напряжение кислорода. Например, мы показали, что при MAME культур поддерживается на слегка кислой рН, то есть, рН 6,8, то увеличение протеолиза и инвазивность. Кроме того, мы также показали, что мы можем использовать подобный cocultures для моделирования других видов рака, как рак предстательной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана, в частности, от Национального института здоровья R01 CA131990 (BFS и RRM). Онлайн-клеток изображений проводили в основной микроскопии и обработки изображений цитометрии ресурсов поддерживается, в частности, по гранту Центра NIH P30 CA22453 к Karmanos института рака, Wayne State University и отделения перинатологии исследований Национального института детского здоровья и развития , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
