Summary
Vi har udviklet 3D cokultur modeller for live-cell imaging i real-tid interaktioner mellem bryst tumorceller og andre celler i deres mikromiljø, der påvirker progression til en invasiv fænotype. Disse modeller kan tjene som prækliniske skærme for lægemidler til at målrette paracrine-inducerede proteolytiske, chemokin / cytokin og kinase veje involveret i invasiv.
Abstract
Vi har udviklet 3D cokultur modeller, som vi kalder MAME (m ammary en rchitecture og m icroenvironment e ngineering), og brugte dem til live-cell imaging i real-tid celle: celle interaktioner. Vores overordnede mål var at udvikle modeller, der opsummere arkitektur preinvasive brystlæsioner at studere deres progression til en invasiv fænotype. Specifikt har vi udviklet modeller til at analysere interaktioner mellem præ-maligne brystepithelceller cellevarianterne og andre celletyper i tumormikromiljøet, som er blevet impliceret i at øge eller reducere progressionen af preinvasive brystepithelceller celler til invasive duktale carcinomer. Andre celletyper undersøgt til dato, er myoepitelcellerne, fibroblaster, makrofager og blod-og lymfekar mikrovaskulære endotelceller. Ud over de Mame modeller, der er udformet til at rekapitulere de cellulære interaktioner inden for brystet underudviklingen af kræft, har vi udviklet sammenlignelige modeller for udviklingen af prostatakræft.
Her viser vi de nærmere vilkår for oprettelse af 3D cokulturer sammen med brugen af live-cell imaging og et funktionelt proteolyse analyse til at følge overgang cokulturer af bryst duktalt carcinoma in situ (DCIS) celler og fibroblaster til en invasiv fænotype over tid, i dette tilfælde i tyve tre dage i kultur. Den MAME cokulturer består af flere lag. Fibroblaster er indlejret i det nederste lag af type I collagen. Den, der er placeret et lag af rekonstitueret basalmembran (rbM), som DCIS celler podes. En endelig øverste lag af 2% rbM er inkluderet, og efterfyldes med hver ændring af medier. At afbilde proteolyse forbundet med progression til en invasiv fænotype, anvender vi farvestof-bratkølede (DQ) fluorescerende matrixproteiner (dq, collagen I blandet med lag af kollagen I og DQ-collagen IV blandes med det midterste lag af rBM) og observere levende kulturer med konfokal mikroskopi. Optiske sektioner er fanget, behandlet og rekonstrueret i 3D med Volocity visualisering software. I løbet af 23 dage i MAME cokulturer, prolifererer DCIS cellerne og smelter sammen til store invasive strukturer. Fibroblaster migrere og bliver indarbejdet i disse invasive strukturer. Fluorescerende proteolytiske fragmenter af collagener findes i association med overfladen af DCIS strukturer intracellulært, og også dispergeret i den omgivende matrix. Lægemidler, der target proteolytisk, chemokin / cytokin og kinase pathways eller modifikationer i den cellulære sammensætning cokulturer kan reducere invasivitet, hvilket antyder, at Mame modeller kan anvendes som prækliniske skærme for nye terapeutiske metoder.
Protocol
1. Fremstille DQ-substrater
- Tillad lyofiliseret DQ-substrater til at opvarme til stuetemperatur, før åbning hætteglas, fremstilles stamopløsning af 1 mg / ml DQ-substrat i deioniseret vand, opdeles i 50 pi aliquoter og opbevares ved 4 ° C.
Det kan være nødvendigt at omrøre DQ-substrat i et ultrasonisk vandbad i ~ 5 minutter og opvarmes til 50 ° C for at lette dispergering.
- Tø rbM på is natten over ved 4 ° C; rbM skal håndteres på is hele tiden.
- At 10X phosphatbufret saltvand (PBS), opløses 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na2 HPO4 (1 M) og 2,4 g KH 2PO 4 (0,02 M) i 800 ml ultrarent vand. Justere pH af PBS-buffer-opløsning til 7,4 med 1,0 M HCI. Bring volumen til 1 liter, steriliseres ved filtrering.
- Fremstille collagen I-opløsningen på is: 8 dele afkølet kollagen I en del af kølet 10X PBS. PH-justeringaf blandingen til 7,2-7,6 ved hjælp af steril 0,1 M NaOH. PH kontrolleres med pH og justeres slutrumfanget til 10 dele med sterilt vand.
- Fremstille DQ-kollagen I: kollagen I matrix ved fortynding DQ-kollagen I i kollagen I opløsning i en forafkølet rør til en slutkoncentration på 25 ug / ml og 2,4 mg / ml.
- Fremstille DQ-collagen IV: rekonstitueret basalmembran (rbM) matrix ved fortynding DQ-collagen IV rbM (Cultrex eller Matrigel) i en forafkølet rør til en slutkoncentration på 25 ug / ml og 12-15 mg / ml. Bland på is under anvendelse af forsigtig pipettering for at undgå at skabe bobler.
2. Forbered MAME cokulturer
Se figur 1 for et skematisk diagram af cokulturer.
- Place to rektangulære plast dækglas (steriliseret i 70% alkohol i 10 minutter og luft-tørret) i en 35-mm dyrkningsskål eller bruge en IbiTreat 35-mm μ-fad. Directions her er for begge dækglas og u-fade, som vi bruger til studerendedør på en opretstående mikroskop. Til undersøgelse af et inverteret mikroskop, bruger vi kun u-skåle.
- Blandes det ønskede antal af fibroblaster med DQ-collagen I: kollagen I matrix. For de langsigtede cokulturer illustreret i figur 2 og 3, anvender vi 500 fibroblaster i 10 ul medium plus 60 ul DQ-kollagen I: kollagen I matrix.
- Ved anvendelse af en 100-pi mikropipette, omhyggeligt pipette og spredning 70 pi fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen I matrix over hele overfladen af hvert dækglas og henstår ved 37 ° C i en befugtet inkubator uden CO 2 til 30 minutter for at størkne.
- Overførsel 35 mm skåle indeholdende dækglas til 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 10 minutter for at ækvilibrere.
- Fjern fra inkubator og lade de 35-mm-skåle under hætten, indtil de kommer til stuetemperatur.
- Tilsættes 60 ul DQ-collagen IV: rbM matrix på toppen af den størknede DQ-kollagen I: kollagen I matrix med indlejrede fibroblaster. Med pipette spids, carefully spredes DQ-collagen IV: rbM matrix jævnt at undgå ridsning af fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen I matrix.
- Overførsel 35 mm skåle indeholdende dækglas til 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 10 minutter for at størkne. Medens DQ-collagen IV: rbM matrix størkner, Trypsinisér og tælle epitelceller.
- Sted 50 ul af en epitelcelle / tumor cellesuspension på dækglas overtrukket med DQ-collagen IV: rbM matrix. Sted 35 mm skåle indeholdende dækglassene i en 37 ° C inkubator. Tillader 40-60 minutter for cellerne at fastgøre DQ-collagen IV: rbM matrix. For de langsigtede cokulturer illustreret i figur 2 og 3, anvender vi 2500 epitel-eller tumorceller.
- Tilsæt 2 ml dyrkningsmedium indeholdende 2% rbM til hver 35 mm skål. Hvis du laver nogle medicinsk behandling, bør lægemidlerne tilsættes på dette tidspunkt.
- Inkuber i den ønskede tidsperiode før billeddannelse. For langvarige kulturer bør mediet skiftes hver 3-4 dage. Cellerne kan opretholdesi deres normale dyrkningsmedium. For MAME cokulturer af brystcellelinier, bruger vi epithelial Basal Medium (MEBM-PRF) suppleret med MEGM SingleQuots.
3. Udfør 4D (3D + tid) scanning af levende MAME cokulturer ved konfokal mikroskopi
- For de proof-of-principle illustrerede studier, blev MAME cokulturer mærket med et fluorescerende cellesporing farvestof i henhold til vores offentliggjorte procedure 1. Efter vask med PBS blev cokulturer inkuberet med 5 uM CellTracker Orange MEGM medium i 45 minutter i et 37 ° C inkubator, vasket igen med PBS og inkuberet med forvarmet MEGMmedium i 30 minutter i 37 ° C med 5% CO2-inkubator, før billeddannelse .
- Billede MAME cokulturer lever i en lav forstørrelse (10X, vand dyppe linsen) på et Zeiss LSM-510 META konfokal mikroskop.
- Optiske sektioner er fanget med mellemrum i hele dybden af strukturerne. For vores undersøgelser, fange vi optiske sektioner ved 10um intervaller.
- Brug optiske sektioner til at rekonstruere billeder i 3D. Vi anvender Volocity software til at generere 3D rekonstruktioner.
- Lav film i 3D rekonstruktioner, så strukturer, celle: celle interaktioner og vekselvirkninger med det omgivende matricer kan visualiseres. Vi lavede film med QuikTime Player 7.
4. Repræsentative resultater
Den MAME cokulturer vi udviklet er en medgørlige eksperimentel model for levende celler billeddannelse i realtid af interaktioner mellem de forskellige cellulære bestanddele, der omfatter en brysttumor og mikromiljø. Her har vi demonstrere evne til Mame modeller at rekapitulere celle: celle-interaktioner i løbet af brystkræft progression og live-cell imaging at følge disse interaktioner over tid. Vi illustrerer evnen til at afbilde interaktioner mellem en preinvasive MCF10.DCIS human bryst-cellelinie og en human brystcancer-associeret fibroblast linie, WS-12Ti overen periode på mere end tre uger i kultur. Den cokulturer blev afbildet på 3, 16 og 23 dage. Optiske sektioner gennem hele rumfanget af cokulturer blev rekonstrueret i 3D og repræsentative eksempler er vist for hver af de tre tidspunkter i figur 2. Den røde fluorescens i figur 2 repræsenterer MCF10.DCIS og WS-12Ti celler. For at skelne mellem de to celletyper og for langsigtede cokulturer, kan en transfektion eller transducerer enkelte celletyper med fluorescerende proteiner forud for etableringen af kulturer. En MAME cokultur af MCF10.DCIS og WS-12Ti celler, som er differentielt mærket med fluorescerende proteiner til identifikation er illustreret i figur 3.
Ved inkorporering substrater, i dette tilfælde DQ-collagener i MAME cokulturer, kan vi vurdere og kvantificere ændringer over tid i proteolyse er forbundet med overgangen til en invasiv fænotype. Vi har etableret fremgangsmåder til kvantificering af fluorescerende spaltningsprodukter som følgefra DQ-collagen nedbrydning 2,3. Vi normalisere nedbrydningsprodukter hele 3D-volumen MAME cokulturer på en per celle basis af mærkning og tælle cellekerner. Desuden kan vi lokalisere nedbrydning til ekstracellulære og intracellulære rum og kvantificere den samlede, intracellulære og ekstracellulære nedbrydningsprodukter, som vi har beskrevet tidligere 2. Den grønne fluorescens i figur 2 og 3 repræsenterer spaltningsprodukter af de to DQ-collagensubstrater. På dette tidspunkt er differentielt mærkede collagener ikke tilgængelige, som ville gøre det muligt at skelne mellem nedbrydning af type IV collagen og nedbrydning af type I collagen.
Samspillet i MAME cokulturer er dynamiske og kan ændre sig over tid. Til opnåelse af tidsmæssige og dynamisk information, kan den samme synsfelt, der skal afbildes, og optiske snit taget gennem hele prøven af volumenet gentagne gange over et tidsrum fra minutter til uger,således at indsamle data i 4-D. I figur 2, viser vi hellere dramatiske ændringer, der sker i løbet af 23 dage: ændringer i celle nummer, cellemigration og celle-interaktioner struktur mængder, struktur former, afvigelser i de strukturer fra kugleform, invasive udvækster og proteolyse. Desuden har vi også vise en generel ændring i volumen på grund af MAME cokulturer nedværdigende deres omgivende ekstracellulære matrix i løbet af denne periode. Efter tre dage som vist i figur 2A, er volumenet 110 tusind um 3. I modsætning hertil er mængden af MAME cokulturer ved 16 og 23 dage kun 46.250 um 3, som vist i figur 2B og C.
Figur 1. Skematisk diagram over MAME cokulturer. Plastic dækglas overtrukket med kollagen I, indeholdende DQ-kollagen I og fibroblaster (magenta). En 2. lag af rekonstitueret basalmembran (RBM) med DQ-collagen IV indsættes. Tumorceller (rød) udplades på toppen og 2% rbM i dyrkningsmedier, er overlejret (hvide prikker) med hver ændring af medier. Grøn repræsenterer fluorescerende spaltningsprodukterne fra DQ-kollagen I og IV.
Figur 2. MAME cokulturer af MCF10.DCIS humane brystceller og WS-12Ti humane bryst fibroblaster. Fibroblasterne blev indlejret i kollagen I / DQ-kollagen I og overlejret med rbM indeholdende DQ-collagen IV. DCIS Cellerne blev derefter udsået på rbM og overlejret med medium indeholdende 2% rbM. Over 23 dage i cokultur illustreret her, var der celleproliferation, nedbrydning af DQ-collagen IV og I (grøn) og collagenmatricer som indikeret ved reduktionen i volumen cokulturer. Cellerne blev lokaliseret ved mærkning med CellTracker orange in situ før billeddannelse (rød). De samme levende cokulturer blev observeret i løbet af de 23 dage med billeder taget af confocal mikroskopi på 3, 16 og 23 dages cokultur. De resulterende optiske skiver blev rekonstrueret i 3D med Volocity software. Forstørrelse 10X.
Figur 3. Mame 16 dages cokulturer af MCF10.DCIS humane brystceller og WS-12Ti humane bryst-fibroblaster, der udtrykker RFP (rød) og YFP (hvid), henholdsvis. Cokulturer blev etableret og analyseret som i figur 2. De to celletyper er vist her var imidlertid blevet differentielt mærket, således at de kan skelnes fra hinanden. De højere forstørrelse billeder i denne figur, sammenlignet med dem i figur 2, illustrerer proteolyse af DQ-collagen IV på overfladen af DCIS celler og diffus proteolyse af DQ-kollagen I i områder nær fibroblasterne. Forstørrelse 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vist kan MAME cokulturer anvendes til levende celler billeddannelse i realtid af interaktioner mellem de forskellige cellulære bestanddele, der omfatter en brysttumor og mikromiljø. I igangværende undersøgelser i vores laboratorium, har vi brugt MAME cokulturer til at identificere proteolytiske veje er forbundet med overgangen fra DCIS til invasive duktalt karcinom, samt samspillet mellem proteolytiske veje og andre stier, der er involveret i denne overgang som kemokin / cytokin / vækstfaktor veje . Vi viste desuden, at Mame modeller kan anvendes som et redskab til screening af virkningerne af inhibitorer med små molekyler, blokerende antistoffer eller shRNAs der modulerer proteolytisk / chemokin / cytokin / vækstfaktor veje 3-5. De Mame modeller kan anvendes til direkte-celle billeddannelse af tumorvækst, invasion og proteolyse end tider fra minutter og timer, som vi tidligere har vist 6,7 til uge som illustreret her i figur 2 og 3. Deninteraktioner er observeret, er mellem celler af en art, dvs humane tumorceller og tumor-associerede celler snarere end mellem humane tumorceller og muse stromaceller som intravital billeddannelse 8. De Mame modeller er en medgørlige system. Molekyler af interesse kan være nedreguleret med shRNAs i individuelle celletyper inden coculturing således at deres bidrag i denne celletype på nedbrydning af DQ-collagener kan afbildes og kvantificeres i 3D 2. Konditionerede medier fra Mame modeller kan udtages til måling af ændringer i sekretion af proteaser og cytokiner, etc. Den opnåede information tilvejebringer en eksperimentel basis til afprøvning af virkningen af inhibitorer med små molekyler, blokerende antistoffer, etc.
Den cellulære sammensætning MAME cokulturer let kan manipuleres, så at man kan anvende dem til at vurdere bidraget af andre celletyper fundet i tumormikromiljøet (f.eks myoepitelcellerne, monocytter, endotelceller af blodfartøj og lymfe oprindelse) til malign progression 6,7. Antallet af forskellige celletyper podet, forholdet af en celle til en anden og længden af tid i kultur vil afhænge af de specifikke celle anvendte type og den eksperimentelle spørgsmål. Mame modeller kan også udvides til at vurdere effekten af ændringer i mikromiljø omkring de brysttumorer, f.eks pH, ilt spændinger. For eksempel har vi vist, at når Mame kulturer holdes på en let sur pH, dvs pH 6,8, er der en stigning i proteolyse og invasivitet. Desuden har vi også vist, at vi kan bruge lignende cokulturer at modellere andre kræftformer som prostatakræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet, delvist af National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS og RRM). Live-cell imaging blev udført i Mikroskopi, Imaging og Cytometry Ressourcer støttet Core, dels ved NIH center tilskud P30 CA22453 til Karmanos Cancer Institute, Wayne State University og den Perinatology Research Branch of the National Institutes of Child Health og Udvikling , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
