Summary
Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D per live-cell imaging in tempo reale delle interazioni tra cellule tumorali del seno e altre cellule nel loro microambiente che hanno un impatto progressione verso un fenotipo invasivo. Questi modelli possono servire come schermi preclinici di farmaci per colpire paracrino indotte proteolitici, percorsi chemochine / citochine e chinasi implicati nella invasività.
Abstract
Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D, che noi chiamiamo MAME (m ammary uno rchitecture e m icroenvironment MBIENTALE e), e li hanno usati per la live-cell imaging in tempo reale di interazione fra cellule. Il nostro obiettivo generale era quello di sviluppare modelli che ricapitolano l'architettura delle lesioni mammarie preinvasive di studiare la loro progressione verso un fenotipo invasivo. Specificamente, abbiamo sviluppato modelli per analizzare interazioni tra pre-maligne varianti cellule epiteliali mammarie e altri tipi di cellule del microambiente tumorale che sono stati implicati nel migliorare o ridurre la progressione delle cellule epiteliali mammarie preinvasive a invasive carcinomi duttali. Altri tipi cellulari studiati fino ad oggi sono cellule mioepiteliali, fibroblasti, macrofagi e sangue e le cellule endoteliali microvascolari linfatici. Oltre ai modelli MAME, che sono progettati per ricapitolare le interazioni cellulari all'interno del seno duranteprogressione tumorale, abbiamo sviluppato modelli paragonabili per la progressione dei tumori della prostata.
Qui si illustrano le procedure per la definizione delle co-colture 3D insieme con l'uso di live-cellula imaging e un saggio funzionale proteolisi per seguire la transizione di co-colture di carcinoma mammario duttale in situ (DCIS) cellule e fibroblasti ad un fenotipo invasivo nel tempo, in questo caso più di venti-tre giorni di coltura. Il co-colture MAME costituiti da strati multipli. I fibroblasti sono incorporati nello strato di fondo di collagene di tipo I. Su che si trova uno strato di membrana basale ricostituita (meccanismi) su cui sono seminate cellule DCIS. Uno strato finale del 2% MLF è incluso e rifornito ad ogni cambio di media. Per proteolisi immagine associata con la progressione di un fenotipo invasivo, usiamo proteine fluorescenti colorante-temprate (DQ) della matrice (DQ-collagene I mescolato con lo strato di collagene I e DQ-collagene IV miscelato con lo strato intermedio di rBM) e osservare colture vive usando la microscopia confocale. Sezioni ottiche vengono acquisiti, elaborati e ricostruita in 3D con il software di visualizzazione Volocity. Nel corso di 23 giorni in co-colture MAME, le cellule proliferano DCIS e fondersi in grandi strutture invasive. I fibroblasti migrano e venire incorporato in queste strutture invasive. Fluorescenti frammenti proteolitici dei collageni si trovano in associazione con la superficie di strutture DCIS, intracellulare, e anche disperse in tutta la matrice circostante. Farmaci che percorsi proteolitica bersaglio, chemochine / citochine e chinasi o modifiche nella composizione del co-colture cellulari può ridurre l'invasività, suggerendo che i modelli MAME possono essere utilizzati come schermi preclinico per nuovi approcci terapeutici.
Protocol
1. Preparare DQ-substrati
- Consentire liofilizzato DQ-substrati a temperatura ambiente prima di fiale di apertura, preparare la soluzione stock di 1 mg / ml di DQ-substrato in acqua deionizzata, dividere in aliquote di 50 pl e conservare a 4 ° C.
Può essere necessario agitare DQ-substrato in un bagno d'acqua ultrasonico per ~ 5 minuti e si riscalda a 50 ° C per facilitare la dispersione.
- Scongelare RBM su ghiaccio notte a 4 ° C; meccanismi devono essere manipolati in ghiaccio in ogni momento.
- Per rendere fosfato 10X soluzione salina tamponata (PBS), sciogliere 80 g di NaCl (1,37 M), KCl 2 g (0,027 M), 14,4 g di Na 2 HPO 4 (1 M), e 2,4 g di KH 2 PO 4 (0,02 M) in 800 ml di acqua ultrapura. Regolare il pH della soluzione tampone PBS a 7,4 con 1,0 M HCl. Portare il volume ad 1 litro, sterilizzare mediante filtrazione.
- Preparare una soluzione di collagene I su ghiaccio: 8 parti di collagene refrigerato I 1 parte di 10X PBS freddo. Regolare il pHdi miscela a 7,2-7,6 usando sterile 0,1 M NaOH. Controllare il pH con le strisce pH e regolare il volume finale a 10 parti con acqua sterile.
- Preparare DQ-collagene I: collagene I matrice diluendo DQ-collagene I collagene I in soluzione in un tubo prechilled ad una concentrazione finale di 25 pg / ml e 2,4 mg / ml, rispettivamente.
- Preparare DQ-collagene IV: membrana basale ricostituita (MLF) matrice diluendo DQ-collagene IV in RBM (Cultrex o Matrigel) in un tubo prechilled ad una concentrazione finale di 25 pg / ml e 12-15 mg / ml, rispettivamente. Miscelare sul ghiaccio usando pipettaggio delicato per evitare di creare bolle.
2. Preparare co-colture MAME
Vedi Figura 1 per un diagramma schematico di co-colture.
- Inserire due coprioggetti rettangolari di plastica (sterilizzato in alcool al 70% per 10 minuti e lasciarlo asciugare all'aria) in un 35 mm piatto di coltura o di utilizzare un ibiTreat 35 mm μ-Dish. Indicazioni qui, sono per entrambi coprioggetto e u-Piatti, che usiamo per la STUmuore su un microscopio verticale. Per gli studi su un microscopio invertito, usiamo solo u-Piatti.
- Mescolare il numero desiderato di fibroblasti con DQ-collagene I: I matrice di collagene. Per lungo termine co-colture illustrate nelle figure 2 e 3, si usa 500 fibroblasti in 10 pl di mezzi più 60 pl di DQ-collagene I: I matrice di collagene.
- Utilizzando un micropipettatore 100-pl, accuratamente pipetta e diffondere 70 pl di fibroblasti: DQ-collagene I: collagene I matrice su tutta la superficie di ciascun coprioggetto e lasciare a 37 ° C in un incubatore umidificato senza CO 2 per 30 minuti per solidificare.
- Transfer da 35 mm piatti contenenti coprioggetti a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 10 min per equilibrare.
- Togliere dal incubatore e lasciare i piatti da 35 mm sotto il cofano fino a che non raggiunga la temperatura ambiente.
- Aggiungere 60 pl di DQ-collagene IV: meccanismi matrice sopra l'solidificato DQ-collagene I: collagene I matrice con fibroblasti incorporati. Con la punta di pipetta, carefully diffondere DQ-collagene IV: RBM matrice in modo uniforme, evitando di graffiare il fibroblasti: DQ-collagene I: I matrice di collagene.
- Transfer da 35 mm piatti contenenti coprioggetti a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 10 min a solidificarsi. Mentre il DQ-collagene IV: RBM matrice solidificazione, Tripsinizzare e contare le cellule epiteliali.
- Luogo 50 microlitri di una sospensione di cellule epiteliali / tumore sul coprioggetto rivestito con DQ-collagene IV: RBM matrice. Luogo da 35 mm piatti contenenti i coprioggetti in un incubatore a 37 ° C. Lasciare 40 a 60 minuti per le cellule da allegare al DQ-collagene IV: RBM matrice. Per lungo termine co-colture illustrate nelle figure 2 e 3, si usa 2500 cellule epiteliali o tumore.
- Aggiungere 2 ml di terreno di coltura contenente 2% meccanismi per ogni 35 mm piatto. Se fare qualsiasi trattamenti farmacologici, i farmaci dovrebbero essere aggiunti in questo momento.
- Incubare per periodo desiderato di tempo prima di imaging. Per le colture a lungo termine, i media dovrebbe essere cambiato ogni 3-4 giorni. Le cellule possono essere mantenutenella loro mezzo di coltura normale. Per MAME co-colture di linee cellulari mammarie, usiamo epiteliale medio basale (MEBM-PRF) integrato con SingleQuots MEGM.
3. Eseguire 4D (3D + tempo), l'imaging di co-colture MAME dal vivo mediante microscopia confocale
- Per i proof-of-principio studi illustrati, co-colture MAME sono state marcate con un colorante fluorescente di monitoraggio delle cellule in base alla nostra procedura di pubblicazione 1. Dopo lavaggio con PBS, co-colture sono state incubate con 5 arancione CellTracker pM in mezzo MEGM per 45 min a 37 ° C incubatore, nuovamente lavate con PBS e incubate con MEGMmedium preriscaldato per 30 min a 37 ° C con 5% CO 2 incubatore prima di imaging .
- Immagine co-colture MAME vivere in un basso ingrandimento (10X, obiettivo acqua immersione) su un LSM-510 Zeiss META microscopio confocale.
- Sezioni ottici vengono acquisiti a intervalli durante l'intera profondità delle strutture. Per i nostri studi, abbiamo catturare sezioni ottiche a 10intervalli micron.
- Utilizzare sezioni ottiche di ricostruire le immagini in 3D. Usiamo software Volocity per generare ricostruzioni 3D.
- Realizzare filmati delle ricostruzioni 3D, in modo che le strutture, l'interazione fra cellule e le interazioni con le matrici circostanti possono essere visualizzati. Abbiamo fatto i film con QuikTime Player 7.
4. Risultati rappresentativi
La co-colture MAME che abbiamo sviluppato è un modello sperimentale per trattabile live-cella immagini in tempo reale delle interazioni tra i vari costituenti cellulari che compongono un tumore del seno ed il suo microambiente. Qui si dimostra la capacità dei modelli di MAME per ricapitolare l'interazione fra cellule durante la progressione del cancro della mammella e del live-cell imaging per seguire queste interazioni nel corso del tempo. Illustriamo la possibilità di interazioni tra una immagine preinvasive linea cellulare umana MCF10.DCIS al seno e un seno umano cancro-associata linea di fibroblasti, WS-12TI, oltreun periodo di più di tre settimane in coltura. Il co-colture sono stati ripresi a 3, 16 e 23 giorni. Sezioni ottiche attraverso l'intero volume della co-colture sono state ricostruite in 3D e esempi rappresentativi sono mostrati per ciascuno dei tre punti temporali in figura 2. La fluorescenza rossa in figura 2 rappresenta il MCF10.DCIS e WS-12TI cellule. Per discriminare tra i due tipi di cellule e di lungo termine co-colture, si può transfettare o trasdurre tipi cellulari individuali con proteine fluorescenti prima di stabilire le culture. Una co-coltura di cellule MAME MCF10.DCIS e WS-12TI che sono differenzialmente etichettati con proteine fluorescenti per l'identificazione è illustrato in Figura 3.
Per substrati contenenti, in questo caso DQ-collageni, nella co-colture MAME, si può valutare e quantificare i cambiamenti nel tempo in proteolisi associato transizione ad un fenotipo invasivo. Abbiamo stabilito metodi per quantificare i prodotti di scissione fluorescenti che risultatoda DQ-collagene degradazione 2,3. Abbiamo normalizzare prodotti di degradazione nell'intero volume 3D della co-colture MAME su una base per cellula di etichettatura e contando nuclei delle cellule. Inoltre, siamo in grado di localizzare il degrado a compartimenti extracellulari e intracellulari e quantificare i totali, prodotti di degradazione intracellulari ed extracellulari, come abbiamo descritto in precedenza 2. La fluorescenza verde nelle figure 2 e 3 rappresenta prodotti di scissione delle due DQ-collagene substrati. In questo momento, collageni differenzialmente marcati non sono disponibili che permetta di distinguere tra degradazione del collagene di tipo IV e degradazione del collagene di tipo I.
Le interazioni in co-colture MAME sono dinamici e possono cambiare nel tempo. Per ottenere informazioni temporali e dinamica, lo stesso campo di vista può essere sezioni immaginati e ottiche adottate attraverso l'intero campione del volume più volte in un periodo di tempo da alcuni minuti a settimana,quindi raccogliendo dati 4-D. Nella figura 2, si illustrano i cambiamenti piuttosto drammatici che si verificano più di 23 giorni: cambiamenti nel numero di cellule, la migrazione cellulare e le interazioni cellulari, volumi, forme struttura la struttura, le deviazioni delle strutture di sfericità, escrescenze invasive e proteolisi. Inoltre, abbiamo anche dimostrato un cambiamento generale di volume a causa della co-colture MAME comprometterne la matrice extracellulare che circonda in questo periodo di tempo. A tre giorni come illustrato in Figura 2A, il volume è 110.000 um 3. Al contrario, il volume del co-colture MAME a 16 e 23 giorni è solo 46.250 um 3, come illustrato nelle figure 2B e C.
Figura 1. Schema di co-colture MAME. Vetrino in plastica è rivestita con il collagene I, contenente DQ-collagene I e fibroblasti (magenta). Un 2 ° strato della membrana basale ricostituita (RBM) contenente DQ-collagen IV viene aggiunto. Le cellule tumorali (rosso) sono rivestiti in alto e il 2% RBM nella cultura media è sovrapposto (puntini bianchi) ad ogni cambio di media. Il verde rappresenta i prodotti di scissione fluorescenti di DQ-collagene I e IV.
Figura 2. MAME co-colture di cellule del seno MCF10.DCIS umane e WS-12TI fibroblasti materno. I fibroblasti sono stati incorporati in collagene I / DQ-collagene I e sovrapposti, con DQ-RBM contenente collagene IV. Le cellule di carcinoma duttale in situ sono state poi seminate sul RBM e ricoperto con supporti contenenti 2% RBM. Nel corso dei 23 giorni in co-coltura qui illustrati, c'era la proliferazione cellulare, la degradazione del collagene IV-DQ e I (verde) e matrici di collagene, come indicato dalla riduzione in volume del co-colture. Le cellule sono state localizzate, etichettando con Orange CellTracker in situ prima della creazione dell'immagine (rosso). Le co-colture stesse dal vivo sono state osservate nel corso dei 23 giorni con le immagini catturate da cmicroscopia onfocal a 3, 16 e 23 giorni di co-coltura. Le fette risultanti ottici sono stati ricostruiti in 3D con il software Volocity. Ingrandimento, 10X.
Figura 3. MAME 16 al giorno co-colture di cellule del seno MCF10.DCIS umane e WS-12TI fibroblasti umani della mammella che esprimono RFP (rosso) e YFP (bianco), rispettivamente. Co-colture sono state stabilite e analizzate come in Figura 2. I due tipi di cellule era mostrato qui, tuttavia, sono differenzialmente etichettati in modo che possano essere distinti l'uno dall'altro. Le immagini ingrandimento maggiore in questa figura, rispetto a quelli in figura 2, illustrano DQ-proteolisi di collagene IV sulla superficie delle cellule DCIS e proteolisi diffusa di DQ-collagene I in zona dei fibroblasti. Ingrandimento, 20X.
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Discussion
Come dimostrato, la co-colture MAME può essere utilizzato per live-cella di imaging in tempo reale delle interazioni tra i vari costituenti cellulari che compongono un tumore del seno ed il suo microambiente. In studi in corso nel nostro laboratorio, abbiamo usato co-colture MAME quello di individuare percorsi proteolitici associati con la transizione da carcinoma duttale in situ di carcinoma duttale invasivo, nonché le interazioni tra i sentieri e percorsi proteolitici coinvolti in questa transizione, come chemochine / citochine / fattori di crescita percorsi . Abbiamo inoltre dimostrato che i modelli MAME potrebbe essere utilizzato come strumento per lo screening degli effetti degli inibitori di piccole molecole, bloccando anticorpi o shRNAs che modulano proteolitica / chemiochina / citochina / fattore di crescita percorsi 3-5. I modelli MAME può essere utilizzata per l'imaging live-cellula della crescita tumorale, invasione e proteolisi su tempi che vanno dai minuti e ore, come abbiamo precedentemente dimostrato 6,7, alla settimana come illustrato nelle figure 2 e 3. Ilinterazioni di essere osservati sono tra le cellule di una specie, cioè, cellule tumorali umane e associati al tumore delle cellule, piuttosto che tra le cellule tumorali e cellule umane stromali del mouse come in intravitale immagini 8. I modelli MAME sono un sistema trattabile. Molecole di interesse possono essere inibiti con shRNAs in tipi di cellule individuali prima di coculturing in modo che il loro contributo in quel tipo di cellula degrado del DQ-collagene possono essere esposte e quantificati in 3D 2. Mezzi di coltura condizionati dai modelli MAME si possono degustare per misurare le variazioni nella secrezione di proteasi, citochine, ecc Le informazioni ottenute fornisce una base sperimentale per testare gli effetti degli inibitori di piccole molecole, bloccando gli anticorpi, ecc
La composizione cellulare del co-colture MAME può essere facilmente manipolato in modo che si possono utilizzare per valutare il contributo di altri tipi di cellule trovato nel microambiente tumorale (ad esempio, cellule mioepiteliali, monociti, le cellule endoteliali di sanguenave e di origine linfatica) alla progressione maligna 6,7. Il numero dei vari tipi di cellule seminate, il rapporto di un tipo di cellula all'altro e la durata del tempo di coltura dipenderà dai tipi cellulari specifici utilizzati e questione sperimentale. Modelli MAME può essere esteso anche per valutare gli effetti delle variazioni del microambiente che circondano i tumori della mammella, ad esempio, pH, tensione di ossigeno. Ad esempio, abbiamo dimostrato che quando colture MAME si mantengono ad un pH leggermente acido, cioè, pH 6,8, vi è un aumento di proteolisi e invasività. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che possiamo usare co-colture simili a modellare altri tipi di tumore come il cancro alla prostata.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato, in parte, dal National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS e RRM). Live-cell di imaging è stata effettuata nel Nucleo Microscopia, Imaging e Citometria Risorse sostenuta, in parte, NIH Centro concessione P30 CA22453 il Karmanos Cancer Institute, Wayne State University e dal Perinatologia Research Branch del National Institute of Child Health e Sviluppo , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
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