הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

Summary

Abstract

פיתוח organotypic תרבויות רפסודות אפיתל סיפקה לחוקרים עם ויעיל במערכת במבחנה כי משחזר בנאמנות בידול אפיתל. ישנם שימושים רבים עבור מערכת זו. למשל, היכולת לגדול תלת ממדי תרבויות רפסודות organotypic של קרטינוציטים הייתה ציון דרך חשוב במחקר של וירוס הפפילומה האנושי (HPV) ^1. מחזור החיים של HPV הוא קשור קשר הדוק בידול של האפיתל הקשקשי ^2. Organotypic תרבויות רפסודות אפיתל כפי שתואר כאן לשחזר את כל מחזור החיים וירוס הפפילומה, כולל ייצור וירוס ^3,4,5. בנוסף, אלה תרבויות רפסודות התערוכה נגעים שומות דומות לאלה שנצפו על זיהום vivo עם HPV. לכן מערכת זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד סרטן תאים אפיתל, כמו גם את ההשפעה של תרופות על התמיינות תאים אפיתל בכלל. פותח במקור על ידי Asselineau ו Prunieras et al. ^7, התרבות organotypic אפיתל מערכת רפסודה התבגר לתוך המודל, בכלל התרבות קל יחסית, הכוללת את הצמיחה של תאים על קולגן המתחבר שמרו על הממשק אוויר נוזלי (איור 1 א). במשך 10-14 ימים, התאים לרבד להבדיל, ויצרו אפיתל בעובי מלא שמייצר בידול ספציפיים cytokeratins. רפסודות שנקטפו ניתן לבדוק בהיסטולוגיה, כמו גם על ידי שיטות מולקולריות ביוכימיים סטנדרטיים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה לייצור של תרבויות הרפסודה של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה. באותה טכניקה ניתן להשתמש שהוקמו שורות תאים אפיתל, והוא יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם רקמות אפיתל מ ביופסיות נורמלי או חולה ^8. וירוסים רבים היעד או אפיתל עורית או הרירית כחלק ממעגל החיים שלהם replicative. בשנים האחרונות, את הכדאיות של שימוש כת רפסודה organotypicures כשיטה של לימוד וירוסים המארחות אינטראקציות סלולריים הוכח על herpesviruses כמה, כמו גם adenoviruses, parvoviruses ו poxviruses ^9. תרבויות רפסודות Organotypic ולכן יכול להיות מותאם לבחון הפתוגנזה ויראלי, הם האמצעי היחיד לבחון סוכני נגיפים חדשים עבור אותם וירוסים שאינם לעיבוד של שורות תאים קבע.

Protocol

1. לקראת תרבויות רפסודות Organotypic

1. הרפסודה רשתות מתכת הרבה 1 להיות מטופלים עם חומצה גופרתית כרום כדי להסיר שאריות שעלולה להפריע לתהליך הבידול. רשתות מתכת לטבול בכוס כוס המכילה חומצה גופרתית למשך שעה אחת, ואז שטף ברציפות לילה עם מי ברז. לאחר לילה לשטוף, רשתות הרפסודה יש ​​לשטוף במשך 3-5 שעות במים מזוקקים פעמיים.
2. כדי לספק תמיכה רפסודות את, לכופף משלושה צדדים של הרפסודה על 0.5 ס"מ במרחק שווה זה מזה. רשתות המתכת אמור להיות autoclaved.
3. להכין את החיץ הכינון מחדש 10X ידי הוספת 2.2 גרם ו -4.8 NaHCO3 Hepes גרם. להמיס 100 מ"ל של NaOH M 0.05. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ"ל ב -20 aliquots ° C.
4. הכן DMEM 10X בלי סודה לשתייה. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ"ל ב -20 aliquots ° C.
5. הכן גורם אפידרמיס העכבר גידול: ממיסים 100 מ"ג של EGF ו 10 מ"ג של BSA כל 10 מ"ל deionized DDH ₂ 0. שלב EGF ו BSA ומוסיפים 80 מ"ל של deionized DDH ₂ 0 עבור נפח כולל של 100 מ"ל. סנן-לעקר, aliquot (5 מ"ל) ו חנות -20 ° C. עבור ליטר אחד של המדיום E להוסיף 5 מ"ל של EGF 1 מ"ג / מ"ל ​​(ריכוז סופי 5 ng / ml).

2. הכנת ג'ל קולגן

1. אחת ג'ל קולגן נדרש כל רפסודה. קולגן יש לשמור על הקרח כדי למנוע לחיזוק. כל ג'ל קולגן דורשת 3 מ"ל של תערובת קולגן המכיל: 2.4 מ"ל של סוג עכברוש זנב קר קולגן אני (הריכוז הסופי 3-4 מ"ג / מ"ל), 0.3 חיץ מ"ל הכינון מחדש 10X, 0.3 מ"ל DMEM 10X and1-2 X 10 ⁶ העכבר 3T3 J2 fibroblasts כתאים מזין. פתרונות ריכוז גבוה של קולגן זנב חולדה, לדלל חומצה אצטית 0.02 מ 'כדי להשיג את הריכוז בעבודה נכונה.
2. לקבוע את מספר ג'ל קולגן (רפסודות) תצטרך ולאחר מכן לחשב שילוב אב בסכום של קולגן, reconstit 10Xמאגר ution, DMEM 10X ו J2 fibroblasts הנדרש. כלול מספיק לערבב כל אב ג'ל נוספות 3-4 בשל צמיגות של קולגן.
3. כדי להכין ג'ל קולגן, trypsinize את J2 fibroblasts ולנטרל עם המדיום. מערבבים את כל fibroblasts ומכניסים בקבוקון 50 מ"ל חרוטית. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. שוב, 1-2x10 ⁶ fibroblasts נדרשים לכל ג'ל קולגן ולכן לכל רפסודה. לסובב את התאים במהירות נמוכה.
4. Aspirate בינוני של פיברובלסטים גלולה ו resuspend בסכום המתאים של חיץ הכינון מחדש 10X, 10X ו DMEM קולגן עבור מספר רפסודות מחושבים. הוסף קולגן האחרון למנוע את הג'ל לחיזוק מהר מדי. לאחר קולגן נוסף, מערבבים במהירות, אך בעדינות כדי למנוע את כניסתה של בועות לתוך הג'ל. ג 'ל צריך להיות צבע כתום אדמדם, מעיד על ה-pH הנכון. אם התערובת ג'ל צהוב מדי, מוסיפים כמה טיפות של פילטר עיקור 1NNaOH ומערבבים בעדינות כדי לקבל את הצבע הנכון.
5. הוסף 3 מ"ל של קולגן: תערובת פיברובלסטים כדי הבארות של המנה תרבות 6 היטב. תערובת קולגן יש pipetted לאט בצד גם כדי למנוע כל יצירת בועות. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס רקמת התרבות החממה ולאפשר לגבש במשך 30 דקות.
6. אחרי 30 דקות, להוסיף 3 מ"ל של מדיום E עם EGF לחלק העליון של ג'ל קולגן הקרושה ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. ג'ל יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס לפחות יום אחד, אבל להשתמש בתוך ארבעה ימים. תוצאות אופטימליות מתרחשים לאחר שני ימי דגירה.

3. קרטינוציטים הכנת התמיינות

1. קרטינוציטים מעבר נמוכים יש גדל בכ 70% confluency. הרפסודה כל דורש 1-2x10 ⁶ קרטינוציטים. Trypsinize את קרטינוציטים ולנטרל עם המדיום E עם EGF. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. לסובב את התאים ב SPE נמוכהאד. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום E עם EGF עבור כל תרבות רפסודה מחושב.
2. Aspirate בינוני מן ג'ל קולגן על ידי צלחת הטיה 6 היטב. הוסף 2 מ"ל של מדיום E טרי עם EGF כדי ג'ל זה. עבור כל ג'ל, בזהירות להוסיף 1 מ"ל של קרטינוציטים resuspended ל 2 מ"ל של מדיום E הנוכחי כבר טוב. בעדינות pipet את קרטינוציטים בתוספת 2 מ"ל של התקשורת ולאחר מכן אפשר נפתח חכם נפילה לאחור על ג'ל. רעד או נדנדה צלחת עלול לגרום חלוקה לא שווה של תאים בצד אחד של ג'ל קולגן. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה.
3. התאים צריך להיות מבוגר כדי confluency, החלפת בינוני E מדי יום. התאים confluent כאשר השינויים בינוני עד שיום אחד צהוב לאחר השינוי במדיום. זה בדרך כלל לוקח 2-4 ימים. אם המדיום לא השתנה מיום ליום 4, המשך לשלב הבא.

4. מה שהופך את התרבויות הרפסודה

1. השתמש מלקחיים סטריליות להציב רשת סטרילית רפסודה מתכת, כפוף הצדדים את, לתוך צלחת 10 ס"מ. Aspirate בינוני של ג'ל קולגן. כדי לשחרר את הג'ל מצידי גם, עבור סביב היקף של ג'ל עם מרית סטרילי באמצעות תנועה למעלה ולמטה. כדי להסיר את ג'ל קולגן, להטות את הצלחת מעט להרים את ידי הצבת מתחת מרית. הנח את ג'ל קולגן על רשת מתכת מבלי ליצור בועות בין הרשת לבין ג'ל. שני ג'לים ניתן למקם על רשת כל אחד.
2. על מנת להפוך את ממשק אוויר נוזלי, מוסיפים בינוני דואר ללא EGF לאט אל החלק התחתון של המנה כל כך את הרשת רפסודה נוגע לתקשורת אבל ג'ל קולגן הוא לא. התקשורת לא צריכה לבוא דרך החורים ברשת. הוסף בינוני לאט, כדי למנוע יצירת בועות תחת הרשת, זה ימנע בידול אחיד. דגירה על רפסודות על 37 מעלות צלזיוס, לשנות את המדיום פעם ביומיים שמירה על ממשק אוויר נוזלי. למסוק את רפסודות לאחר 14 יום.

5. נציג תוצאות

כאשר לאהוא פרוטוקול מבוצע כהלכה עם קרטינוציטים ראשוניים, הליך זה יביא האפיתל היטב מובחן שבו שכבות שונות של עור ניכרים. זה יושג באמצעות בדיקה היסטולוגית של מכתים קטעי תרבויות רפסודות עבור hematoxylin ו eosin (H & E), כפי שמוצג באיור 1 ב. צביעת H & E שימושית גם לבחון את המורפולוגיה של רפסודות ועל ההשפעה של וירוסים או תרכובות אנטי על היכולת של התאים לרבד ולהבחין. לדוגמה, רפסודות עשויות-HPV הנציח קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה (HFK-31) הם בעיקר בהשוואה עבה יותר כדי רפסודות עשויות רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK), המשקף שיעור מוגבר של שגשוג היכולת של חלבונים-HPV לשמור על התאים המבדילים פעיל במחזור התא (איור 1 ב) ^10. התוצאה היא שימור של גרעיני ברחבי האפיתל, ואילו קרטינוציטים רגילים יציאה מחזור התא על בידול, והתוצאה היא התמוטטות שלגרעיני המעטפה. כדי לבחון מקרוב יותר בידול, אימונוהיסטוכימיה ניתן לבצע כדי לבדוק סמנים ספציפיים, כולל בידול cytokeratins, כמו גם involucrin ו filaggrin. Cytokeratins שונים באים לידי ביטוי בשלבים מסוימים של בידול ^7. כפי שניתן לראות בתרשים 2, cytokeratin 10 (K10) לא באה לידי ביטוי ברובד הבסיסי, והוא נמצא רק בשכבות suprabasal המורכבות של תאים בהדרגה המבדילים. ב-HPV רפסודות חיוביים, ביטוי של K10 מתעכב בהשוואה לזו של קרטינוציטים רגילים, שוב המשקפות את השפעת חלבונים-HPV על בידול keratinocyte. אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש גם כדי לבחון את פרופיל הביטוי של גנים נגיפיים. שמוצג באיור 3 הוא מכתים נציג לבחון את הביטוי של חלבון E1 HPV ^ E4, שהוא חלבון ז"ל אשר הביטוי מוגבל בשכבות העליונות של האפיתל. כצפוי, לא מכתים הוא ציין בתרבויות רפסודות מן הומא רגילעכ קרטינוציטים העורלה.

איור 1. מתאר) של שיטה להכנת תרבויות רפסודות organotypic קרטינוציטים מן ראשוניים או שורות תאים אפיתל. ב) Hematoxylin ו eosin מכתים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר קרטינוציטים העורלה האדם ביציבות שמירה על HPV-31 (HFK-31) episomes, או רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK). שכבות אפיתל בודדים מזוהים, כמו גם התוספת קולגן.

איור 2. Cytokeratin 10 (K10) הביטוי מוגבל שכבות suprabasal של האפיתל. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים ל-K10. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות confמיקרוסקופ פלואורסצנטי ocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל.

איור 3. E1 HPV ^ E4 חלבון המיוצר בשלב מאוחר היצרני של מחזור החיים של נגיפי. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים E1E4. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל.

Discussion

המתואר כאן שיטה, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול אפיתל בכלל, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות ללמוד הפתוגנזה ויראלי, כמו גם את היעילות של הרפוי פוטנציאליים. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל או כאתר העיקרי של זיהום, כמו במקרה של HPV, או בשלב מסוים במחזור החיים ויראלי, כמו herpesviruses. למרות גידול תרבויות רפסודות organotypic זמן רב, היכולת לשחזר בנאמנות על בידול אפיתל vivo מספק שיטה יעילה מאוד לבחון וירוס: תא אינטראקציות המארחות. בהצלחה לגדול האפיתל הבדיל באופן מלא יש כמה שלבים קריטיים כי יש להכיר. על מנת לשמר את היכולת להבדיל בתרבויות הרפסודה, יש לנו מספר מספיק של מתקני האכלה פיברובלסטים ב ג'ל קולגן לשמור monolayer keratinocyte. בידול עניים בתרבויות הרפסודה יכול להיות גם בגלל צפיפות נמוכה מדי של קרטינוציטיםעל קולגן: ג'ל פיברובלסטים, בניית רפסודה לא תקין, או אי שינוי בתקשורת כל יום. פרמטר אחד נוסף, כי יש לקחת בחשבון על מנת להבטיח את איכות בידול האפיתל הוא סוג של מזין פיברובלסטים בשימוש. ההליך המתואר כאן, העכבר 3T3 J2 fibroblasts היו בשימוש. בעוד fibroblasts אחרים יכולים לשמש מתקני האכלה, מומלץ fibroblasts המתחלקים במהירות, או שעלולים לנדוד אל פני השטח עורי לא להיות used7. אף על פי פרוטוקול זה מחייב איסוף של רפסודות לאחר 14 יום, רפסודות ניתן לקצור לפני בנקודה זו בזמן, כמו גם לאחר מכן. עם זאת, לאחר 14 יום את רפסודות יהיה בהדרגה להיות דק יותר. בנוסף חתך התרבויות רפסודות לניתוח immunohistochemical, רפסודות ניתן לקצור עבור RNA ו-DNA, כמו גם ייצור הנגיף.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010