Summary
一个
Abstract
器官的上皮筏子文化的发展提供了一个有效的研究人员在体外系统，忠实地概括上皮细胞分化。这个系统有许多用途。例如，增长角质细胞的三维器官筏文化的能力一直在研究人类乳头状瘤病毒（HPV）的1重要里程碑。人乳头状瘤病毒的生命周期是紧密相连的鳞状上皮分化2。器官的上皮筏子文化展示在这里重现整个乳头状瘤病毒的生命周期，包括病毒生产3,4,5。此外，这些竹筏文化表现不典型增生病变相似， 在体内与HPV感染后观察。因此，该系统也可用于研究上皮细胞癌，以及药物对一般的上皮细胞分化的影响。最初由Asselineau和Prunieras开发
Protocol
1。器官筏文化的制备
- 金属筏电网的先处理，以消除任何可能干扰与分化过程中的残留铬硫酸。一小时含硫酸的玻璃烧杯中浸泡的金属网格，然后用自来水不断冲洗过夜。筏电网隔夜冲洗后，应为3-5小时，在双蒸水冲洗。
- 提供支持排上，弯曲筏约0.5厘米的距离相等，彼此的三个方面。金属网格，然后进行高压灭菌。
- 准备加入2.2克NaHCO3和4.8ĞHEPES的10X重组缓冲区。溶解在100毫升0.05 M氢氧化钠。过滤消毒，并在5毫升分装保存在-20°C
- 准备不碳酸氢钠DMEM培养液的10倍。过滤消毒，并在5毫升分装保存在-20°C
- 准备小鼠表皮生长因子：溶解表皮生长因子100毫克和10毫克的BSA的每一个10毫升的去离子DDH 2 0。结合表皮生长因子和牛血清白蛋白和总容积为100毫升至80毫升的去离子DDH 2 0添加。过滤，消毒，分装（5毫升），并储存在-20°C为每公升电子介质中添加1 mg / ml的EGF（终浓度为5毫微克/毫升）5毫升。
2。胶原凝胶的制备
- 一个胶原蛋白凝胶是要求每个筏。胶原蛋白应保持在冰上，以防止它从巩固。每个胶原凝胶胶原蛋白组成的混合需要3毫升：2.4毫升冷鼠尾型胶原蛋白（终浓度为3-4毫克/毫升），0.3毫升的10X重组缓冲区，0.3毫升培养液10X AND1-2×10 6鼠标3T3 J2的成纤维细胞作为饲养层细胞。鼠尾胶原的高浓度的解决方案，在0.02 mol乙酸稀释，以达到正确的工作浓度。
- 胶原凝胶（筏）数量确定您需要，然后计算主结构的胶原蛋白的数量，10X reconstitution缓冲区，10X DMEM和J2的成纤维细胞。由于胶原蛋白的粘度为3-4额外的凝胶在每个主结构，包括足够的。
- 准备胶原蛋白凝胶，trypsinize J2的成纤维细胞和中等抵消。结合成纤维细胞和地方都在50毫升锥形瓶。计数细胞，以确定可以排上。同样，1-2X10 6成纤维细胞胶原蛋白凝胶要求每因而每筏。降速在低速的细胞。
- 在的10X重组缓冲区，10X DMEM和胶原蛋白的数量计算筏适量的中等颗粒和悬浮的成纤维细胞吸。添加胶原蛋白的最后固化太快，以防止凝胶。一旦添加胶原蛋白，迅速拌匀，但轻轻地防止引入气泡的凝胶。凝胶应该是一件橘红色，指示正确的pH值。如果凝胶的混合物是太黄，添加一个过滤灭菌1N滴情侣NaOH和混合轻轻地获得正确的颜色。
- 加入3毫升的胶原纤维母细胞混合井6孔培养皿。胶原蛋白的混合物，应吸管慢慢下来，每口井的一侧，以避免产生气泡。放置在37℃组织培养孵化器的板，并允许以巩固30分钟。
- 30分钟后，加入3毫升电子媒介与EGF凝固的胶原凝胶的顶部，并返回板的孵化器。凝胶应保持在37°C，至少一天，但在四天之内使用。最佳结果发生后2天的潜伏期。
3。准备角质分化
- 应通过角质细胞低增长约70％汇合。每个筏需要1-2X10 6角质。 Trypsinize角质和消除与E与表皮生长因子的培养基。计数细胞，以确定可以排上。降速低SPE细胞版。每个计算筏文化电子与表皮生长因子的培养基在1毫升悬浮颗粒。
- 胶原凝胶吸倾斜6孔板介质。每个凝胶与EGF加入2毫升的新鲜ê介质。对于每个凝胶，小心加入1毫升的再悬浮角质电子媒介以及在已存在的2毫升。轻轻吸管角质，加2毫升的媒体，然后让秋天下拉明智放回凝胶。震动或摇晃板，可能会导致细胞分布不均的胶原蛋白凝胶的一侧。放置在37℃培养箱板。
- 应细胞生长汇合，每天更换电子媒介。细胞汇合时，黄色的一天后，在介质的变化介质的变化。这通常需要2-4天。 4天如果介质没有改变，继续下一步。
4。使筏文化
- 用无菌镊子把无菌金属筏电网的，弯曲两侧向下，变成了10厘米的菜。吸的胶原蛋白凝胶的介质。放松以及双方的凝胶，凝胶的周长周围用无菌刮刀使用向上和向下运动。要删除的胶原蛋白凝胶，倾斜板稍微抬起放置铲下。奠定胶原蛋白凝胶的金属网格上，而不会产生气泡之间的网格和凝胶。每个格子可以放在两个凝胶。
- 为了使气 - 液界面，无需添加表皮生长因子é中等慢慢盘底部，使筏电网接触媒体，但胶原蛋白凝胶是不。媒体不应该通过在网格的孔。慢慢添加介质，以避免产生气泡，根据电网，因为这将防止统一分化。在37°C孵育筏和改变介质隔日维持气 - 液界面。收获后14天的救生筏。
5。代表结果
当t他协议正确执行主角质，此过程将导致在分化良好的上皮细胞，在不同层次的皮肤是很明显的。实现这一目标染色苏木精伊红（H＆E）在图1B所示，筏文化节，通过组织学检查。 H＆E染色也非常有用，检查排筏，病毒或抗病毒药物效果的分层和分化能力的细胞形态。例如，从HPV-永生主的人角质形成细胞（HFK-31）的筏尤其是较厚的相比，从正常人包皮角质细胞（HFK）筏增殖率增加，反映了人乳头状瘤病毒蛋白质的能力，以维持分化细胞活跃在细胞周期（图1B）10。这个结果在保留整个上皮细胞的细胞核，而正常角质细胞分化的细胞周期退出后，在击穿核膜。更密切地审查分化，免疫组化可以进行检查特定的分化，包括角蛋白，以及外皮，聚角蛋白微丝蛋白。不同的细胞角蛋白表达在分化的特定阶段7。细胞角蛋白10（K10的），如图2所示，是不是表示在基底层，只发现在基底层层次逐步分化的细胞组成的。在HPV阳性筏，K10的表达比正常角质细胞，再次反映了人乳头状瘤病毒蛋白，角质形成细胞分化的影响，推迟。免疫组化也可以用来研究病毒基因的表达谱。图3所示是一个有代表性的染色检查的人乳头状瘤病毒蛋白素E1 ^ E4类，这是一个迟到的蛋白，其表达仅限于上皮至上层的表达。正如预期的那样，没有染色观察正常呼玛筏文化n个包皮角质。
图1）大纲的方法准备从小学角质细胞或上皮细胞株的器官筏文化。乙）苏木精和曙红染色稳定维持HPV-31（HFK-31）episomes，或从人体正常包皮角质细胞（HFK）从人类包皮角质生成的器官筏文化。确定个人的上皮细胞层，以及胶原插头。
图2角蛋白10（K10）的表达仅限于上皮的基底层层。免疫组化HFK-31细胞，以及正常使用的抗体到K10 HFKs器官筏文化的横截面。细胞DNA被用DAPI counterstained。被抓获的图像使用的conf嗓音的荧光显微镜。箭头表示上皮的基底层。
图3。人乳头状瘤病毒的E1 ^ E4类蛋白在病毒生命周期的生产阶段后期制作。免疫组化HFK-31细胞，以及正常使用抗体来E1E4 HFKs器官筏文化的横截面。细胞DNA被用DAPI counterstained。使用共聚焦荧光显微镜图像被抓获。箭头表示上皮的基底层。
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Discussion
我们在这里介绍一个可以用来研究一般上皮细胞分化的方法，但也可以很容易地适应研究病毒的发病机制，以及潜在疗法的疗效。许多病毒的目标上皮细胞感染的主站点，在人乳头状瘤病毒的情况下，或在一些点在病毒的生命周期，与疱疹病毒。虽然越来越多器官筏文化是费时，忠实地在体内的上皮细胞分化概括提供了一个非常有用的方法来检查病毒：宿主细胞相互作用的能力。成功地培育出一个完全分化的上皮有一些必须承认的关键步骤。为了留住区分筏文化的能力，一个人必须有足够数量的成纤维细胞馈线在胶原蛋白凝胶，维持角质细胞单层。筏文化的贫富分化，也可以是由于角质细胞的密度太低胶原蛋白的成纤维细胞的凝胶，筏施工不当，或未能改变媒体日常。一个额外的参数，必须考虑，以确保质量的上皮细胞分化的成纤维细胞用于馈线的类型。对于这里描述的步骤，使用鼠标3T3 J2的成纤维细胞。而其它的成纤维细胞可以用来作为馈线，建议，成纤维细胞快速分裂，或可能迁移到真皮表面是used7。虽然该协议要求后14天收获排上，排筏在这个时间点之前，以及之后可以收获。然而，经过14天的救生筏将逐步变得更薄。除了切片免疫组织化学分析筏文化，筏也可以有所收获的RNA和DNA，以及病毒的生产。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢萨莉·罗伯茨（英国伯明翰大学，英国伯明翰）的那种的E1E4抗体的礼物。这项工作是由国家癌症研究所（4R00CA137160-03）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| E medium11 | |||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
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