Summary
Eksplantater fra midthjernen dopaminsystemet og striatum anvendes i en collagenmatrix assay for
Abstract
Midthjernen dopamin (mdDA) neuroner projekt via mediale forhjernen bundle mod flere områder i telencephalon, herunder striatum 1. Omvendt medium piggede neuroner i striatum, der giver anledning til striatonigral (direkte) pathway innerverer substantia nigra 2. Udviklingen af disse axon skrifter er afhængig af de kombinatoriske handlinger foretaget af en overflod af axon vækst og vejledning signaler, herunder molekyler, der frigives ved neurites eller (mellemliggende) målregioner 3,4. Disse opløselige faktorer kan studeres in vitro ved dyrkning mdDA og / eller striatale eksplantater i en collagenmatrix, der tilvejebringer en tredimensionel substrat for axoner efterligner ekstracellulære miljø. Desuden tillader kollagenmatrixen til dannelse af relativt stabile gradienter af proteiner frigivet af andre eksplantater eller celler er anbragt i nærheden (se f.eks referencer 5 og 6). Her beskriver vi metoder til purverifikationsprogrammet af rotte hale kollagen, mikrodissektion af dopaminerge og striatale eksplantaterne, deres kultur i kollagengeler og efterfølgende immunhistokemiske og kvantitativ analyse. Første hjernerne af E14.5 museembryoer er isolerede og dopaminerge og striatale eksplantater mikrodissekeres. Disse eksplantater derefter (co) dyrket i kollagengeler på dækglas i 48 til 72 timer in vitro. Efterfølgende aksonal fremskrivninger er visualiseret ved hjælp af neuronale markører (fx tyrosin hydroxylase, DARPP32 eller βIII tubulin) og axon vækst og tiltrækkende eller frastødende axon svar er kvantificerede. Dette neuronal forberedelse er et nyttigt værktøj for in vitro-undersøgelser af de cellulære og molekylære mekanismer mesostriatal og striatonigral axon vækst og vejledning under udvikling. Ved hjælp af dette assay, er det også muligt at vurdere andre (mellemprodukt) mål for dopaminerge og striatale axoner eller at teste specifikke molekylære signaler.
Protocol
1. Fremstillinq af rotte Tail Collagen
- Indsamle 6-10 voksne rotter haler (det er muligt at lagre halerne ved -20 ° C indtil anvendelse).
- Gennemvæde haler i 95% ethanol natten over ved stuetemperatur (RT).
Dissektion af rotte haler (i vævskultur hætte):
(Hold værktøjer i 70% ethanol når du ikke bruger dem, og sørg for, at alle løsninger, værktøjer og glasvarer, der anvendes i hele denne procedure er sterile)
- At indsamle sener fra halerne, skæres spidsen af halen. Hold store ende af halen med en tang. Brug en anden tang til at holde, bøje og knække halen tæt på de øvrige pincet. Trækkes fra hinanden, og sener bliver efterladt (figur 1A, B).
- Saml de sener i sterilt H 2 O, og efter at indsamle alle sener flytte dem til en ny petriskål med sterilt H 2 O.
- Tag 2-3 sener og makulere dem ved hjælp af 2 par forCEPS i en ny petriskål med sterilt H2O Fjerne ikke-sene væv, såsom vener (sene væv er skinnende og reflekterende; figur 1C). Efter fjernelse af alle ikke-sene væv, giver hver hale ca 100-150 mg af sener.
- Overfør sener til 300 ml sterilt 3% eddikesyre og omrøres langsomt natten over ved 4 ° C.
- Tilsættes yderligere 200 ml steril 3% eddikesyre og omrøres langsomt natten over ved 4 ° C.
- Centrifugeres eddikesyreopløsning indeholdende senerne ved ~ 2700 x g i 120 min ved 4 ° C for at pelletere ikke-opløste sener og ikke-senen væv.
- Under centrifugering fremstilling dialyserør:
- udskårne stykker på 40 cm
- koge i 500 uM EDTA i 5 minutter
- køligt i sterilt H 2 O
- Binde en knude i den ene ende af dialyserøret og fylde røret med supernatanten fra den centrifugerede senen opløsningen på is i vævskultur hætten ved hjælp af en automatisk pipette og en 25 ml pipette. Undgå at producere bobler. Knude den anden ende af røret og lagre rør på sterilt aluminiumfolie på is indtil alle stykker af rør er fyldt (figur 1D).
- Fremstilling af 10 l sterilt 0,1 x MEM, pH 4,0, i vævskultur hætten. Tilsættes flyderen til stykker af rør og tilføje disse til præ-afkølede 0,1 x MEM opløsning i en 10 liter bægerglas. Dialysere natten over ved 4 ° C under langsom omrøring. Dette dialyse fjerner overskydende syre, medens pH holdes lav.
- Udskift med nye forafkølet 10 l 0,1 x MEM og omrøres natten over ved 4 ° C.
- Gentag det forrige trin ved at erstatte med nye pre-afkølede 10 l 0,1 x MEM og røre natten over ved 4 ° C.
- Portion kollagenopløsning i sterile 50 ml rør. Detaljerede portioner ved 4 ° C. Hold 6-12 måneder, kun håndtere kollagen bestanden i vævskultur Hood.
- Det er vigtigt at teste, om oprenset kollagen skal fortyndes (i 0,1 X MEM) for at opnå optimale resultater i collagen Matr.ix assay. Derfor frembringe en collagen fortyndingsserie (ufortyndet collagen, 1:1, 1:2 og 1:05 fortyndet) og udføre collagenmatrix assays som beskrevet nedenfor for at bestemme den optimale collagen fortynding.
2. Dissektion af det dopaminerge midthjernen 7,8
- Dissekere E14.5 museembryoer fra livmoderen og holde L15 medium på is indtil de skal bruges.
Alle efterfølgende dissektion trin udføres i L15 medium på is.
- Dissekere ud af hjernen.
- Fjerne telencephalon ved at skære langs den mediale del af hver telencephalic vesikel (anvende telencephalic vesiklerne til striatale eksplantater).
- Fjerne meningeal hylsteret.
- Lav en dorsoventral snit blot rostralt af mesencephaliske bøjning.
- Gøre en anden dorsoventral snit lige kaudale af mesencephale bøjning.
- Lav en rostrocaudal snit langs ryggens midtlinie ved hjælp af en microdissection kniv for at blotlægge det underliggende ventrale midthjerne væv. Vær omhyggelig med ikke at ramme den ventrale midthjernen væv, da det indeholder de dopaminerge neuroner (Figur 2).
- Lave to rostrocaudal snit lateral og parallelt med den ventrale midterlinie for at fjerne dorsale midthjernen væv.
- Opdele det resterende ventrale midthjerne væv ind eksplantater med en mikrodissektion kniv.
- Opbevares eksplantaterne i L15-medium indeholdende 5% FBS på is indtil brug.
3. Dissektion af striatum
Alle dissektion trin udføres i L15 medium på is.
- Anvende telencephalic vesikler dissekeret under midthjernen dissektion.
- Fjerne thalamus ved at skære ind mellem thalamus og striatum med pincet.
- Lav en mediolateral rostralt til striatum at fjerne rostralt strukturer såsom lugtekolben. Gentag dette trin for væv placeret kaudalt til striatum.
- Positionden resterende skive for at opnå en koronal billede af striatum (figur 2).
- Striatum kan blive anerkendt som en lidt mindre tæt (mere gennemsigtig) del af væv. Dissekere ud striatum og skæres i eksplantaterne ved hjælp af en mikrodissektion kniv. Undgå lidt mørkere væv tæt på midterlinien, som indeholder migrerer neuroner i den laterale og mediale ganglie eminence.
- Opbevares eksplantaterne i L15-medium indeholdende 5% FBS på is indtil brug.
4. Assembly kollagenmatriks Analyser
Forberedelse af kollagen (alle trin på is, bruger afkølet pipettespidser)
- Bland 860 ul fortyndet collagen med 100 ul 10 x MEM og 40 ul 1 M natriumbicarbonat (NaHCO3) og holde på is. Hvis der på dette tidspunkt kollagen opvarmer det vil størkne.
- Tilsættes en dråbe af 20 ul (ca. 5 mm i diameter) af fremstillede collagen til et dækglas i en brønd af en 4-brønds Nunc skålog lad den henstå i en CO2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter (den omgivende O2 koncentration er tilstrækkelig). Under denne inkubation kollagen vil gelatinere.
Opsætning co-kultur i kollagengel
- Når collagen er gelatineret bruge en pipette med en 200 gl tip til at overføre en dopaminerg eller striatale eksplantering til kollagen.
- Bevæge eksplantater i umiddelbar nærhed af hinanden ved hjælp af en kanyle. Holde dem adskilt i en afstand af ca diameteren af en eksplantatet (ca. 200-300 um) (figur 2).
- Fjerne overskydende medium, og der tilsættes 20 ul fremstillede collagen på toppen af eksplantater. Dette vil ofte medføre, at eksplantaterne at bevæge sig rundt. Repositionere eksplantaterne ved anvendelse af en nål, som beskrevet i 4.4.
- Lad collagen størkne i 15 minutter ved RT, efterfulgt af 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når collagen er sat, tilsættes 400 ul explant medium og vokse i 2-3 dage i en CO2-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
5. Analyse ved immunohistokemi og Kvantificering
Immunhistokemi
- At fastsætte eksplantater, forsigtigt tilsættes 400 pi af 8% paraformaldehyd (PFA) i PBS til 400 pi medium (hvorved fortynding af PFA til 4%) og lad henstå i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskes 3x 15 min i PBS ved stuetemperatur.
- Inkuber i blokeringsbuffer (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) i 2 timer.
- Inkuber natten over med primært antistof i BB ved 4 ° C. For dopaminerge axoner anvende anti-tyrosin-hydroxylase-antistoffer (1:1000) 7, for striatale axoner anti-DARPP32 antistoffer (1:500) 9 og til visualisering af alle axoner anti-βIII tubulin (1:3000) 7.
- Vask 5x 1 time i PBS ved stuetemperatur.
- Inkuberes med sekundært antistof konjugeret til en passende fluorophor (1:500) i BB natten over ved 4° C. Fra dette trin på at minimere udsættelse af eksplantater for lys (f.eks dække dem med aluminiumfolie).
- Vask natten over i PBS ved 4 ° C efterfulgt af flere vaskninger i løbet af dagen.
- Monter explanter på objektglas med Forlæng antiblegemiddel reagens montering medium. Tilsættes en dråbe ~ 10 pi på et mikroskopobjektglas. Tag dækglasset og forsigtigt placere den på den dråbe montering medium med eksplantatet nedad. Undgå at fange nogen luft under de dækglasset ved meget forsigtigt at sænke det på dråbe montering medium.
Kvantificering ved at beregne P / D-forhold
- Erhverve digitale billeder af eksplantaterne med et epifluorescensmikroskop (figur 3).
- Under anvendelse af disse billeder, hvert eksplantat opdele i kvadranter til at generere en proximal kvadrant (dvs. en del af eksplantatet nærmest tilstødende eksplantat) og en distal kvadrant (en del af eksplantatet længst væk fra den hosliggende forklaringnt) (fig. 2, 4).
- Måle længden af 20 længste neuritter nye fra eksplantatet både de proximale og distale kvadranter.
- Anvende den gennemsnitlige længde af de 20 ældste neuritter at beregne P / D-forholdet for hver enkelt eksplantat. AP / D-forhold> 1 indikerer Axon attraktion, mens en ratio <1 angiver Axon frastødning.
- I nogle tilfælde forhindrer tæt vækst af neuritter vurdering af individuelle neurit længde. I disse situationer kan kvantificering udføres ved at måle afstanden mellem kanten af eksplantatet og den forreste foran axon vækst i den proximale og distale kvadranter.
6. Repræsentative billeder
Efter vellykket dyrkning af dopaminerge og striatale eksplantater et stort antal af axoner er synlige med lysfeltmikroskopi eller visualiseres ved anti-βIII tubulin immuncytokemi (ikke vist). En undergruppe af disse axoner er dopaminerge eller S triatal axoner som visualiseret under anvendelse af immuncytokemi (figur 3). Ved at dividere de eksplantater i kvadranter, som beskrevet og bestemmelse P / D-forhold, kan en formodet axon tiltrækkende eller frastødende virkning kvantificeres (fig. 3E).
Figur 1. Billeder illustrerer fremstillingen af kollagen fra rotte hale sener. A) trækning fra hinanden rotte halen blotlægger sener. B) Sener er synlige som reb-lignende bundter. C) sener er lette at skelne fra vener ved deres skinnende hvidt udseende. D) Efter opløsning senerne i eddikesyre, opløsningen overføres til dialyserør. For at holde den opløste kollagen kolde, er rørene placeret på steril aluminiumfolie på is.
e 2 "src =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematisk angivelse af de forskellige trin i proceduren. Passende hjerneregioner er dissekeret og skåret til frembringelse eksplantater. En enkelt midthjernen og striatale eksplantat er placeret i tæt nærhed i en collagenmatrix og efterladt til at vokse i 48-72 timer ved 37 ° C. Axoner visualiseres ved fluorescens immunohistokemi og P / D-forhold er beregnet til at kvantificere chemotropic responser.
Figur 3. Repræsentative resultater viser axon vækst i en collagenmatrix kultur. A) midthjernen eksplantatet farvet med anti-tyrosinhydroxylase-antistof afslørede axon udvækst. Stiplet linje angiver tilstødende eksplantation. B) forstørrelse af en viser individuelle neuritter og vækstkegler (pile). C) Striatal eksplantatet farvet med anti-DARPP32. D) Forstørrelse C viser individuelle neuritter. E) Eksempel påP / D-forholdet kvantificering. Eksplantater er opdelt i lige store kvadranter. Den proximale kvadrant vender den tilstødende eksplantatet, medens den distale kvadrant vender væk fra det. Målestoksforhold angiver 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollagenmatrixen assayet beskrevet her er blevet anvendt, og forbedret af mange forskellige laboratorier i de sidste årtier til at undersøge en række axon vejledning molekyler og neuronale systemer (se f.eks referencer 5-8). Disse undersøgelser har vist, at dette assay er et stærkt værktøj til at studere virkningerne og regulering af axon vejledning molekyler, der udskilles af forskellige (mellemprodukt) målvæv.
Imidlertid bør det bemærkes, at kollagenmatrixen er en erstatning for det ekstracellulære miljø (ECM), men det er klart mangler mange proteiner, der normalt er til stede i ECM. Bestanddele af ECM er kendt for at påvirke virkningerne af axon vejledning molekyler 10. Ikke desto mindre kollagenmatrixen assayet er særlig anvendelig til undersøgelse af grundlæggende molekylære mekanismer in vitro og i kombination med andre vævskulturplader fremgangsmåder (f.eks organotypiske skivekulturer 11) eller analyse af genetisk manipulerede dyremodeller. Flere faktorer er afgørende for succes collagen matrix analysen. Første størrelsen af eksplantaterne er afgørende for optimal axon vækst. Store dopaminerge og striatale eksplantaterne ofte vise begrænset Axon vækst, mens små eksplantaterne viser uregelmæssig og fasciculated udgroning. Endvidere er afstanden mellem de enkelte eksplantaterne stor indflydelse på effekten et secerneret molekyle kan udøve på tilstødende eksplantater. Hvis eksplantater er for langt fra hinanden, vil diffunderbare molekyler ikke når de eksplantater. Omvendt, når afstanden er for små axoner kan vokse ind i de tilstødende eksplantaterne, hvilket gør det vanskeligt at kvalitativt og kvantitativt vurdere axon vækst og vejledning. Endelig er kvaliteten af rotte halen collagen er vigtig og er direkte korreleret med udvækst af axoner og overlevelse af eksplantater.
Analysen beskrevet her kan modificeres på forskellige måder at løse specifikke forskningsspørgsmål. For eksempel kan tilsætning afFunktionen blokerende antistoffer til vækstmediet tillader funktionel inhibering af (kandidat) molekyler. Derudover kan eksplantater kombineres med celleaggregater udskiller specifik axon vækst og vejledning faktorer. Endelig kunne eksplantaterne fås fra GFP reporter mus, i hvilke specifikke neuronale populationer og deres axoner er mærket. Med dette setup, kan axoner følges i løbet af collagen matrix analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Kollagenmatrix'en analysen er blevet udviklet og forbedret af arbejdet i mange forskellige forskergrupper i løbet af de seneste to til tre årtier. De beskrevne fremgangsmåder her for dopaminerge og striatale eksplantaterne stor gavn af disse undersøgelser. Desuden ville forfatterne gerne takke Asheeta Prasad for hendes hjælp til opsætning striatale eksplantatkulturer. Arbejde i laboratoriet blev finansieret af Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Nederlandene Organization of Health Research og udvikling (ZonMW-VIDI og ZonMW-TOP), den Europanian Union (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (til RJP), og Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (TopTalent, at ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J.
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J.
- Chilton, J. K.
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
