Summary
Explants fra midbrain dopamin systemet og striatum brukes i en kollagen matrise analysen for
Abstract
Midbrain dopamin (mdDA) nevronene prosjektet via den mediale forebrain bunten mot flere områder i telencephalon, inkludert striatum en. Gjensidig, medium spiny nevroner i striatum som gir opphav til striatonigral (direkte) veien innervate substantia nigra 2. Utviklingen av disse axon traktater er avhengig av kombinatoriske handlingene til en overflod av axon vekst og veiledning pekepinner inkludert molekyler som er utgitt av neurites eller (middels) målrettingsregioner 3,4. Disse løselige faktorer kan studeres in vitro av dyrkning mdDA og / eller striatale banene explants i en kollagen matrise som gir en tredimensjonal substrat for axoner etterligne ekstracellulære miljøet. I tillegg gjør kollagen matrise for dannelsen av relativt stabile gradienter av proteiner utgitt av andre explants eller celler plassert i nærheten (f.eks se referanser 5 og 6). Her beskriver vi metoder for purification av rotte hale kollagen, mikrodisseksjon av dopaminerge og striatale banene explants, deres kultur i kollagen gel og påfølgende immunhistokjemisk og kvantitativ analyse. Først hjernen til E14.5 mus embryoer er isolert og dopaminerge og striatale banene explants er microdissected. Disse explants blir deretter (co) dyrket i kollagen gel på Dekkglass for 48 til 72 timer i vitro. Deretter aksonale anslag er visualisert ved hjelp av nevrale markører (f.eks tyrosin hydroksylase, DARPP32, eller βIII tubulin) og axon vekst og attraktive eller frastøtende axon respons kvantifiseres. Dette neuronal forberedelse er et nyttig verktøy for in vitro studier av cellulære og molekylære mekanismer for mesostriatal og striatonigral axon vekst og veiledning under utvikling. Ved hjelp av denne analysen, er det også mulig å vurdere andre (mellomliggende) mål for dopaminerge og striatale banene axons eller for å teste spesifikke molekylære signaler.
Protocol
1. Utarbeidelse av Rat Tail Collagen
- Samle 6-10 voksne rotter haler (det er mulig å lagre halene ved -20 ° C til bruk).
- Bløtlegg halene i 95% etanol over natten ved romtemperatur (RT).
Disseksjon av rotte haler (i vevskultur hette):
(Holde verktøy i 70% etanol når du ikke bruker dem, og sørge for at alle løsninger, verktøy og glass brukes i denne prosedyren er sterilt)
- For å samle sener fra halene, avskåret tuppen av halen. Hold store enden av halen med en pinsett. Bruk en annen pinsett til å holde, bøye og bryte halen nær de andre tang. Trekk fra hverandre og senene blir liggende igjen (Figur 1A, B).
- Samle sener i sterile H 2 O og etter samle alle sener flytte dem til en ny petridish med steril H 2 O.
- Ta 2-3 sener og makulere dem ved hjelp av 2 par forsteinsopp i en ny petridish med steril H 2 O. Fjern ikke-sene vev som blodårer (sene vev er skinnende og reflekterende, figur 1C). Etter fjerning av alle ikke-sene vev, gir hver hale ca 100-150 mg av senene.
- Overfør sener til 300 ml steril 3% eddiksyre og røre sakte over natten ved 4 ° C.
- Legg til en ekstra 200 ml steril 3% eddiksyre og røre sakte over natten ved 4 ° C.
- Sentrifuger eddiksyreløsning inneholder sener på ~ 2700 xg for 120 min ved 4 ° C til pelletskaminer ikke-oppløste sener og ikke-sene vev.
- Under sentrifugeringen forberede dialyse slange:
- skjære biter av 40 cm
- koke i 500 mM EDTA for 5 min
- kjølig i steril H 2 O
- Knyt en knute i den ene enden av dialyse slangen og fyll slangen med supernatanten av sentrifugert sene løsning på is i vevskultur hetten med en automatisk pipette og en 25 ml pipette. Unngå produsere bobler. Knot den andre enden av slangen og butikken tubing på sterile aluminiumsfolie på is til alle deler av slangen er fylt (figur 1D).
- Forbered 10 l av steril 0.1X MEM, pH 4,0, i vevskultur panseret. Legg floater til stykker av rør og legge disse til pre-avkjølte 0.1X MEM løsning i en 10 l begerglass. Dialyser natten ved 4 ° C, mens sakte omrøring. Dette dialyse fjerner overflødig syre samtidig holde pH lav.
- Erstatt med nye pre-avkjølte 10 l 0.1X MEM og røre over natten ved 4 ° C.
- Gjenta det forrige trinnet ved å erstatte med nye pre-avkjølte 10 l 0.1X MEM og røre over natten ved 4 ° C.
- Delmengde kollagen løsning i sterile 50 ml rør. Oppbevar alikvoter ved 4 ° C. Hold 6-12 måneder, bare håndtere kollagen lager i vevskultur panseret.
- Det er viktig å teste om renset kollagen må fortynnes (i 0.1x MEM) for å oppnå optimale resultater i kollagen matrix analysen. Derfor genererer en kollagen fortynning serie (ufortynnet kollagen, 01:01, 01:02 og 01:05 fortynnet) og utføre kollagen matrise analyser som beskrevet nedenfor for å finne den optimale kollagen fortynning.
2. Disseksjon av dopaminerg midbrain 7,8
- Dissekere E14.5 mus embryoer fra livmor av moren og holde i L15 medium på is inntil nødvendig.
Alle etterfølgende disseksjon trinnene utføres i L15 medium på is.
- Dissekere ut hjernen.
- Fjern telencephalon ved å kutte langs den mediale delen av hver telencephalic vesikkel (bruk telencephalic vesikler for striatale banene explants).
- Fjern meningeal sliren.
- Lag en dorsoventral kutt like rostral av mesencephalic flexure.
- Lag en annen dorsoventral kutt like kaudal av mesencephalic flexure.
- Lag en rostrocaudal kutt langs dorsal midtlinjen med en microdissection kniv for å avsløre den underliggende ventrale midbrain vev. Vær forsiktig så du ikke treffer ventrale midbrain vev som det inneholder dopaminerge nevroner (figur 2).
- Lag to rostrocaudal kutt lateral og parallelt med det ventrale midtlinjen for å fjerne dorsal midbrain vev.
- Fordel resten av ventrale midbrain vevet inn explants hjelp av en mikrodisseksjon kniv.
- Oppbevar explants i L15 medium som inneholder 5% FBS på is inntil bruk.
3. Disseksjon av striatum
Alle disseksjon trinnene utføres i L15 medium på is.
- Bruk telencephalic blemmer dissekert under midbrain disseksjon.
- Fjern thalamus ved å kutte i mellom thalamus og striatum med tang.
- Lag en mediolateral kutt rostral til striatum for å fjerne rostral strukturer som luktelappen. Gjenta dette trinnet for vev ligger caudally til striatum.
- Posisjongjenværende Slice å få en coronal visning av striatum (figur 2).
- Striatum kan bli anerkjent som en litt mindre tett (mer gjennomsiktig) del av vev. Dissekere ut striatum og skjær i explants hjelp av en mikrodisseksjon kniv. Unngå den litt mørkere vevet nær midtlinjen, som inneholder trekkende neurons av laterale og mediale ganglionic Eminence.
- Oppbevar explants i L15 medium som inneholder 5% FBS på is inntil bruk.
4. Assembly kollagen matrise Analyser
Klargjøring av kollagen (alle trinn på isen, bruker avkjølt pipettespisser)
- Bland 860 mL fortynnet kollagen med 100 mL av 10x MEM og 40 mL av 1M natriumbikarbonat (NaHCO 3) og holde på is. Dersom du på dette punktet kollagen varmer opp den stivner.
- Tilsett en dråpe 20 mL (ca 5 mm i diameter) med preparerte kollagen til en dekkglass i en brønn på en 4-brønn Nunc parabolenog la det stå i en CO 2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i 30 min (ambient O 2-konsentrasjonen er tilstrekkelig). I løpet av denne rugingen kollagen vil gelatinize.
Oppsett co-kulturen i kollagen gel
- Etter at kollagen har gelatinized, bruke en pipette med en 200 mL tips å overføre en dopaminerg eller striatale banene eksplantering til kollagen.
- Flytt explants i umiddelbar nærhet til hverandre ved hjelp av en nål. Holde dem fra hverandre i en avstand på ca diameteren på en eksplantering (~~~HEAD=NNS 200-300 mikrometer) (figur 2).
- Fjern overflødig medium og tilsett 20 mL preparerte kollagen oppå explants. Dette vil ofte føre til at explants å flytte rundt. Reposisjonere explants ved hjelp av en nål som beskrevet i 4.4.
- La kollagen stivne i 15 min ved RT etterfulgt av 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Etter at kollagen har satt, tilsett 400 mL av explant medium og vokse i 2-3 dager i en CO 2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2.
5. Analyse av Immunhistokjemi og kvantifisering
Immunhistokjemi
- For å fikse explants, tilsett 400 mL av 8% paraformaldehyde (PFA) i PBS til 400 mL av medium (og derved fortynne PFA til 4%) og la stå i 1 time ved RT.
- Vask 3x 15 min i PBS ved RT.
- Inkuber i blokkering buffer (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) i 2 timer.
- Inkuber over natten med primær antistoff i BB ved 4 ° C. For dopaminerge axoner bruke anti-tyrosin hydroksylase antistoffer (1:1000) 7, for striatale banene axoner anti-DARPP32 antistoffer (1:500) 9 og for å visualisere alle axoner anti-βIII tubulin (1:3000) 7.
- Vask 5x 1 time i PBS ved RT.
- Inkuber med sekundært antistoff konjugert til riktig fluoroforen (1:500) i BB overnatting på 4° C. Fra dette trinnet på minimalisere eksponeringen av explants til lys (f.eks dekke dem med aluminiumsfolie).
- Vask over natten i PBS ved 4 ° C etterfulgt av flere vasker i løpet av neste dag.
- Monter explants på objektglass hjelp Forleng Antifade reagens montering medium. Tilsett en dråpe ~ 10 mL på et glass objektglass. Ta dekkglass og forsiktig plassere den på slipp av montering medium med eksplantering siden vendt ned. Unngå fangst noe luft under de dekkglass av svært forsiktig senke den på dråpe montering medium.
Kvantifisering ved å beregne P / D ratio
- Tilegne digitale bilder av explants med en epifluorescence mikroskop (figur 3).
- Ved hjelp av disse bildene, del hver eksplantering inn kvadranter for å generere en proksimal kvadrant (dvs. en del av eksplantering nærmest tilstøtende eksplantering) og en distal kvadrant (del av eksplantering lengst vekk fra tilstøtende forklaringnt) (figur 2, 4).
- Mål lengde på 20 lengste neurites fremvoksende fra eksplantering både i proksimale og distale kvadranter.
- Bruk den gjennomsnittlige lengden av de 20 lengste neurites å beregne P / D-forhold for hver enkelt eksplantering. AP / D ratio> 1 indikerer axon tiltrekning, mens en ratio <1 indikerer axon frastøting.
- I noen tilfeller hindrer tette veksten av neurites vurderingen av enkelte neurite lengde. I slike situasjoner kan kvantifisering utføres ved å måle avstanden mellom kanten av eksplantering og ledende foran axon vekst i de proksimale og distale kvadranter.
6. Representative Images
Etter vellykket kultur av dopaminerge og striatale banene explants et stort antall axoner er synlige ved hjelp av lyse felt mikroskopi eller som visualiseres ved anti-βIII tubulin immunocytochemistry (ikke vist). En undergruppe av disse axoner vil være dopaminerg eller s triatal axoner som visualiseres ved hjelp immunocytochemistry (figur 3). Ved å dele explants inn kvadrantene som beskrevet og bestemme P / D forhold, kan en antatt axon attraktiv eller frastøtende effekt kvantifiseres (Figur 3E).
Figur 1. Bilder som illustrerer utarbeidelsen av kollagen fra rotte hale sener. A) Trekke fra hverandre rotte halen eksponerer sener. B) Sener er synlige som tau-lignende pakker. C) De sener er lette å skille fra vener av sin skinnende hvite utseende. D) Etter oppløser senene i eddiksyre, er løsningen overført til dialyse tubing. For å holde oppløst kollagen kald, er rørene plasseres på sterile aluminiumsfolie på is.
e 2 "src =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
Figur 2. Skjematisk viser de ulike trinnene i prosedyren. Passende områder av hjernen blir dissekert og kuttet å generere explants. Et enkelt midbrain og striatale banene eksplantering er plassert i umiddelbar nærhet i en kollagen matrise og venstre for å vokse i 48-72 timer ved 37 ° C. Axoner er visualisert ved fluorescens immunhistokjemi og en P / D ratio er beregnet å kvantifisere chemotropic svar.
Figur 3. Representative resultater som viser axon vekst i en kollagen matrise kultur. A) midbrain eksplantering farget med anti-tyrosin hydroksylase antistoff avslørende axon utvekst. Prikket linje angir tilstøtende eksplantering. B) Forstørrelse av A Viser individuelle neurites og vekst kjegler (piler). C) striatale banene eksplantering farget med anti-DARPP32. D) Forstørrelse av C viser individuelle neurites. E) Eksempel påP / D ratio kvantifisering. Explants er delt inn i like kvadranter. Den proksimale kvadrant vender den tilstøtende eksplantering mens distale kvadrant er vendt bort fra den. Skala linjene viser 100 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollagen matrise analysen beskrives her har blitt brukt og forbedret av mange ulike laboratorier i de siste tiårene for å undersøke en rekke axon veiledning molekyler og nevrale systemer (f.eks se referanser 5-8). Disse studiene har vist at denne analysen er et kraftig verktøy for å studere effekter og regulering av axon veiledning molekyler utskilles av forskjellige (middels) målvevet.
Imidlertid bør det bemerkes at kollagen matrisen er en erstatning for den ekstracellulære miljøet (ECM), men klart mangler mange proteiner som normalt finnes i ECM. Komponenter i ECM er kjent for å påvirke effekten av axon veiledning molekyler 10. Likevel er kollagen matrisen analysen spesielt nyttig for å undersøke grunnleggende molekylære mekanismer in vitro og i kombinasjon med andre vevskulturstudier tilnærminger (f.eks organotypic skive kulturer 11) eller analyse av genmanipulerte dyremodeller. Flere faktorer avgjør suksessen til kollagen matrise analysen. For det første er størrelsen på explants avgjørende for optimal axon vekst. Store dopaminerge og striatale banene explants ofte vise begrenset axon vekst, mens små explants viser uregelmessig og fasciculated utvekst. Videre påvirker avstanden mellom de enkelte explants stor effekten et utskilt molekyl kan øve på tilstøtende explants. Hvis explants er for langt fra hverandre, vil diffusible molekyler klarer å nå explants. Omvendt, når avstanden er for liten axoner kan vokse inn i de tilstøtende explants, noe som gjør det vanskelig å kvalitativt og kvantitativt vurdere axon vekst og veiledning. Endelig er kvaliteten på rotte halen kollagen viktig og er direkte korrelert med utvekst av axoner og overlevelse explants.
Analysen beskrives her kan endres på ulike måter å løse konkrete problemstillinger. For eksempel, tillegg avFunksjonen blokkerer antistoffer mot vekst medium åpner for funksjonelle hemming av (kandidat) molekyler. I tillegg kan explants kombineres med celle tilslag secreting spesifikk axon vekst og veiledning faktorer. Endelig kunne explants fås fra GFP reporter mus i hvilke spesifikke nevronale populasjoner og deres aksoner er merket. Ved hjelp av dette oppsettet kan axoner følges i løpet av kollagen matrisen analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Kollagen matrise analysen har blitt utviklet og forbedret av arbeidet til mange ulike forskningsgrupper i løpet av de siste to-tre tiår. De tilnærminger som beskrives her for dopaminerge og striatale banene explants stor nytte av disse studiene. I tillegg ønsker forfatterne takke Asheeta Prasad for hennes hjelp i å sette opp striatale banene eksplantering kulturer. Arbeid i laboratoriet ble finansiert av Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), den nederlandske organisasjonen for helse Forskning og Utvikling (ZonMW-Vidi og ZonMW-TOP), den Europanian Union (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (til RJP), og den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (TopTalent; til Eres).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J.
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J.
- Chilton, J. K.
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
