דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

Summary

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

Abstract

פיתוח ותחזוקה של מערכת החיסון CD4 ⁺ ותאי T רגולטוריים (Tregs) לתרום סובלנות היקפי צריכה להישאר הומאוסטזיס חיסוניות עם סכום עצום של אנטיגנים עצמיים ו commensal ב ועל גוף האדם. הפרעות במאזן בין Tregs ו דלקת בתאי T קונבנציונאלי עלול לגרום immunopathology או סרטן. למרות הזרקת הטיפולי של Tregs הוכח להיות יעיל במודלים Murine של ¹ קוליטיס, אני סוכרת סוג ^2, דלקת פרקים שגרונית שתל מול המחלה המארח, ⁴ הבדלים בסיסיים כמה אדם לעומת העכבר Treg ביולוגיה ⁵ יש ובכך מנעה הרבה בשימוש קליני. היעדר מספר מספיק טוהר, יציבות וספציפיות הביות של טיפולי Tregs חייבה פלטפורמה דינמית של התפתחות Treg האנושי שבו כדי לייעל את התנאים להרחבת vivo לשעבר שלהם ^6.

כאן אנו דescribe שיטה בידול של המושרה Tregs (iTregs) מתורם דם אדם יחיד היקפי אשר ניתן לפרק לארבעה שלבים: בידוד של כדוריות דם היקפיים mononuclear, בחירת המגנטי של CD4 ⁺ T תאים, על תרבית תאים במבחנה הקרינה הופעלה התא מיון (FACS) של תת התא טי. מאז החתימה Treg גורם שעתוק forkhead תיבת P3 (FoxP3) הוא גורם ההפעלה הנגרמת שעתוק בבני אדם ⁷ ולא סמן ייחודי אחר קיים, פאנל קומבינטורית של סמנים יש להשתמש כדי לזהות תאים T עם פעילות מדכא. לאחר שישה ימים בתרבית, תאים במערכת שלנו ניתן התחום לתאי ה-T נאיבי, חולצות זיכרון תאים או iTregs המבוססים על הביטוי היחסי של CD25 ו CD45RA. כמו זיכרון תמים ותאי T שונים יש דרישות דיווח קיטוב ו plasticities ^8, לפני מיון של האוכלוסייה התא הראשוני T לתוך CD45RA ⁺ ו ⁺ תת CD45RO יכול בדואר רגיל לבחון התאמות אלה. עולה בקנה אחד עם אחרים, CD25 שלנו ^היי CD45RA ^- iTregs רמות גבוהות של אקספרס FoxP3 ^9, GITR ו CTLA-4 ו ¹¹ רמות נמוכות של CD127 ^12. בעקבות FACS של האוכלוסייה בכל התאים כתוצאה ניתן להשתמש assay מדכא אשר מעריכה את היכולת ביחס לעכב את הפצת carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE), שכותרתו עצמיים בתאי T.

Protocol

1. בידודו של האדם תאים דם היקפיים (mononuclear PBMCs) מ סמל באפי

1. לרכוש יחידה אחת של המעיל באפי מבית החולים או במיקום סמוך למרכז דם. מרכז הדם שלנו מספק לנו על 40-60 מ"ל של המעיל באפי ליחידת לקבל תורמי דם בריאים.
2. שופכים דם לתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל autoclaved המכיל PBS סטרילית לדלל את המעיל באפי. היקף הסופי של PBS + באפי המעיל צריך להיות 250 מ"ל.
3. מלאו עשר 50 צינורות חרוטי מ"ל כל אחד עם פתרון מ"ל 20 Lymphoprep.
4. בעדינות כיסוי הפתרון Lymphoprep עם 25 מ"ל של המעיל באפי בדילול מלא, נזהרת שלא להפריע את הפתרון Lymphoprep.
5. ספין צינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ב 500 x גרם. הקפד לכבות את הבלם של צנטריפוגות, כדי לא להפריע את החלק היחסי לימפוציטים.
6. לאסוף את PBMCs בממשק שבין Lymphoprep ואת פלזמה בינוני שכבות עם טפטפת. לשאוב את פלזמה בינוני עד כ 1 מ"ל עדיין מכסה את שכבת מעיל באפי המכיל את PBMCs. השתמש פיפטה 10 מ"ל להעביר PBMCs לצינור 50 מ"ל חדש.
7. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחר מכן resuspend תאים למ"ל של 50 RPMI קרים סומכים hemocytometer. התאוששות הטיפוסי הוא 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMCs.

הליך זה יכול להיות scaled למטה על כמויות קטנות יותר של דם. דילול של דגימות דם שלמים הוא 1:1 ב PBS.

2. סלקציה שלילית המגנטי של CD4 ⁺ T תאים בסך הכל, מסוג CD4 ^{+ +} CD45RA תאים טי נאיבי או מסוג CD4 ⁺ CD45RO ⁺ זיכרון ותאי T מ PBMCs באמצעות ערכות העשרה EasySep (לתאי גזע טכנולוגיות)

צעדים שיש לבצע על 1 x 10 ⁸ עד 4.25 x 10 ⁸ PBMCs.

1. Resuspend PBMCs לריכוז הסופי של 5 x 10 ⁷ לכל מ"ל PBS המכיל 2% FBS ו 1 מ"מ EDTA. העבר תאים צינור טרי 14 מ"ל עגול פוליפרופילן התחתונה.
   s = "lalpha">
   1. הבידוד של CD4 ⁺ אדם בסך הכל ותאי T של סלקציה שלילית: להוסיף CD4 ⁺ אדם העשרה T Cell קוקטייל של נוגדנים (50 μL לכל מ"ל של PBMCs), לערבב דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. בידודו של אדם ותאי T נאיבי של סלקציה שלילית: להוסיף 50 μL של נוגדנים נגד CD45RO לכל מ"ל של תרחיף תאים PBMC, לערבב דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף קוקטייל ההעשרה המצורף לערכה (50 מ"ל לכל μL של של PBMCs), לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   3. בידוד של תאים T אדם זיכרון על ידי סלקציה שלילית: להוסיף CD4 ⁺ הזיכרון האנושי העשרה T Cell קוקטייל של נוגדנים (50 μL לכל מ"ל של PBMCs), לערבב דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לערבב חלקיקים מגנטיים טוב באותה מידה להפיץ אותם ברחבי פתרון. האם חלקיקים לא מערבולת מתיק נאיבי.
3. מוסיפים את חלקיקים מגנטיים (100 מ"ל לכל μL של PBMCs עבור CD4 ⁺ הכולל של התא נאיבי הבחירה T, 50 μL לכל מ"ל של PBMCs לבחירת זיכרון T התא). מערבבים בעדינות על ידי pipetting 2-3 פעמים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לבחירה נאיבי תא T או 5 דקות CD4 ⁺ הכולל זיכרון או בחירה T התא.
4. הוסף PBS המכיל 2% FBS ו 1 mM EDTA להביא בנפח של עד 10 מ"ל לכל צינור. מערבבים בעדינות על ידי pipetting 2-3 פעמים לפני הנחת צינור הסיר את המיכסה לאבן שואבת EasySep כסף עבור דקות 5, 10 או 2.5 עבור CD4 ⁺ הכולל תאים T, תת נאיביות וזיכרון, בהתאמה.
5. עם צינור עדיין מגנט EasySep, לשפוך נוזל לתוך שפופרת 50 מ"ל חדש לבודד תאים של עניין.
6. חזור על שלבים 2.5 ו -2.6 להתאוששות טובה יותר.

3. תרבות תנאים סלולריים לגרום לתאי T רגולטוריים

1. יום לפני שלבים 1 ו -2, רקמות המעיל צלחות תרבות על ידי דילול 1 נגד CD3 נוגדנים (OKT3 שיבוט) לריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS סטרילית. על צלחת 6 גם להוסיף 2 מ"ל PBS + אנטי CD3 לכל ובכן, צלחת 12 גם להוסיף 1 מ"ל או צלחת 24 גם להוסיף 500 μL בכל טוב. שמור על צלחת מצופה ב 4 ° C עד השימוש.
2. הכן בינוני הקיטוב על ידי הוספת 10% חום מומת בסרום שור עוברית (FBS), 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 50 מיקרומטר סטרפטומיצין β-mercaptoethanol כדי RPMI-1640 mM Glutamax-I ו 25 מראש בתוספת מ"מ 2.06 HEPES המאגר. לאחר מכן, להוסיף 2 ng / mL TGF-β ו - 5 ng / mL IL-2. כאן, ניתן להוסיף ligands או מעכבי המעניינים את התקשורת. Resuspend תאים בשלב 2 בריכוז של 2 x 10 ⁶ תאים למ"ל של המדיום הקיטוב.
3. טרום חמים צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, לשאוב PBS מתוך אנטי CD3 מצופים בארות לפני הוספת תאים. הוסף 4 מ"ל לכל גם ההשעיה התא לצלחת 6 ובכן, 2 מ"ל של תאים על צלחת 12 טוב או 1 מ"ל של תאים על צלחת יפה 24. למלא את בארות ריקות עם PBS להפחתת אידויהתקשורת. דגירה במשך 3 ימים ב 37 ° C / 5% CO _2.
4. על ציפוי 3 ימים הודעה, לסובב את הצלחת בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם. מבלי להפריע לתאי T בתחתית הצלחת, הסר מחצית התקשורת ולהחליף עם התקשורת טריים. לחלופין, אם כן נעשה צפוף עם תאים (ריכוז מעל 3 x 10 ⁶ / ml), לפצל את עוצמת הקול באופן שווה לתוך צלחת אנטי CD3 אחר מצופה ולהוסיף התקשורת טריים חזרה לנפח המקורי. דגירה של שבועיים עד שלושה ימים ב 37 ° C / 5% CO _2.

4. הקרינה המופעל Cell מיון (FACS) של שלוש אוכלוסיות של תאים T

1. הכן FACS כביסה המאגר על ידי הוספת 0.5% (W / V) שור סרום אלבומין (BSA) ו - 2 מ"מ EDTA כדי סטרילית PBS. מאגר מקום 4 ° C להיות קר.
2. הסרה של תאים תרבית תאים היטב ולשטוף היטב את כל 2 מ"ל של PBS על מנת להבטיח התאוששות התא מלא. מניחים את כל התאים ב -50 צינורות פוליפרופילן מ"ל ו סרכזת ב XG 500 עבור 10דקות ב 4 ° C.
3. לספור את התאים על hemocytometer לקבוע צפיפות התאים.
4. מקום 3-5 x 10 ⁵ תאים לכל צינור בארבעה נפרדים עגולים 5 מ"ל התחתונה צינורות פוליסטירן עבור פקדים פיצויים. המקום התאים הנותרים ב -50 צינורות פוליפרופילן מ"ל, לא יותר מ 35 x 10 ⁶ תאים לכל צינור.
5. לסובב את התאים למשך 5 דקות 4 התקשורת מעלות צלזיוס ו aspirate. Resuspend תאים למיון ב 90 μL מאגר כביסה קרה לכל 1 x 10 ⁶ תאים. Resuspend ב μL 100 מתוך חוצץ כביסה קר משנים את צינורות פיצויים.
6. לתאים להיות מסודר, לשלב 2 μL נגד CD25-PE, 3 μL נגד CD45RA-PE-Cy5 ו 1 μL נגד CD127-APC לכל 1 x 10 ⁶ תאים. הוסף אין נוגדנים צינור שליטה 1 פיצוי, 2 μL נגד CD25-PE לצינור 2, 3 μL נגד CD45RA ^- PE-Cy5 כדי μL 3 צינור and1 נגד CD127-APC ל צינור 4. דגירה כל צינורות על קרח למשך 45 דקות בחושך.
7. Aspirate תאים חיץ resuspend בריכוז של 1 x 10 ^-7 תאים לכל מ"ל של שטיפת המאגר. הוסף 1.5 μL של DNase II לכל מ"ל של תאים לפני סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר ניילון התא. העבר תאים מרובים 5 התחתונות מ"ל צינורות עגולים פוליפרופילן עם מ"ל לא יותר מ -3.5 דולר הצינור. Resuspend בקרה תאים פיצוי μL 300 של שטיפת המאגר.
8. קביעת פיצוי על cytometer זרימת MoFlo למזער זיהוי על ידי הצלב, PE APC ו PE-Cy5 מסננים. קביעת השערים למיין iTregs (CD25 ^היי CD127 ^-/LOW CD45RA ^- תאים), תמימה (CD25-CD45RA ⁺⁾ וזיכרון (CD25 ^- CD45RA ^-) ותאי T ל -5 עגולים מ"ל התחתונה צינורות המכילים פוליסטירן 1 מ"ל סרום היילוד העגל.

5. דיכוי Assay

1. הפוך את supprassay ession התקשורת על ידי הוספת 100 U / mL של פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, 5 ng / mL של IL-2 ו 2 ng / mL של TGF-β לכוון-V.
2. יום assay, לטהר CD4 ⁺ Heterologous ותאי T מ באפי מעיל כמפורט שלבים 1 ו -2. אלה יהיו התאים היעד עבור assay דיכוי ואינו מכיל CD25 ⁺ תאים Treg, כפי שניתן לראות באיור 2, יום 0.
3. תווית תאים עם CellTrace ערכת לפי הוראות היצרן, למעט שימוש רק 1 μL של פתרון 5 מ"מ מניות לכל מ"ל של תאים במקום 2 μL. שמירה מתוך אור ישיר, להוסיף 18 μL של DMSO מסופק על ידי ערכת CellTrace כדי בקבוקון אחד CFSE לעשות פתרון המניה 5 מ"מ. Resuspend את המספר הדרוש של תאים היעד (עד למקסימום של 1 x 10 ⁷⁾ prewarmed PBS + 0.1% (W / V) BSA לריכוז הסופי של 1 x 10 ⁶ תאים למ"ל. הוסף 1 μL של CFSE 5 מ"מ לכל מ"ל של תאים דגירה של אמבטיה 37 ° C מים מינוט 5ES. הוסף 5 כרכים של שלמה, קרח קר RPMI עם FBS 10% כדי להרוות את הכתמים, דגירה על קרח במשך 5 דקות. לשטוף את התאים עוד פעמיים עם RPMI מלאה קר resuspend 1 x 10 ⁵ תאים לכל μL 100 של התקשורת assay דיכוי.
4. Treg מפקח חרוזים דיכוי הם בריכוז מלאי של 2 x 10 ^-7 חרוזים למ"ל. גלולה מספר חרוזים שווה את המספר הכולל של תאים לכל ניסוי על ידי צנטריפוגה מהירה בצינור eppendorf. לשטוף פעם אחת עם חרוזים RPMI מחדש גלולה. לאחר שאיפת RPMI, חרוזים resuspend כך את הכמות המתאימה של חרוזים לכל גם הם μL 8 של התקשורת assay דיכוי.
5. ל 96 עגול גם צלחת רקמות התחתון תרבות, להוסיף CFSE המוכתמים תאים (1 x 10 ⁵ תאים למ"ל), חרוזים מפקח ותאי מקוטב מיון (1 x 10 ⁵ תאים למ"ל) בתקשורת assay טריים דיכוי ליעד הרצוי (צבעונית CFSE): יחס מבצע (מיון) בכרך האחרון של μL 200. כל התנאים נקבעים tripliקייטס.
6. הכן הראשון של שני תנאים שליטה על ידי הוספת 100 μL של תאים מוכתמים CFSE, 8 μL של חרוזים מפקח 1 x 10 ⁵ של תאים חדשים בלא כתם בינוני assay μL 92 מדכא בכל טוב. מכינים את השליטה 2 עם מרכיבים תאיים כנ"ל אך ללא Treg חרוזים מפקח.
7. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום דגירה על 37 ° C / 5% CO ₂ למשך חמישה ימים.
8. בחושך, לאסוף תאים גם כל על ידי pipetting ומניחים 5 מ"ל סביב הצינור התחתון קלקר. סרכזת תאים ב XG 500 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, מדיה aspirate, ו resuspend ב -300 FACS קרים μL כביסה המאגר משלב 4. ניתוח 1 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ אירועים מהשער לימפוציטים חי המייצג תאים היעד בהיסטוגרמה עם תוכנת Quest Cell.

6. נציג תוצאות

דוגמה pseudocolor תזרים cytometric נקודה על מגרשים של חמישה ימים בזמן couבידול RSE iTreg ניטור מבוסס על יחסי שיתוף ביטוי של CD25 עם FoxP3, CTLA-4 ו CD45RA ניתן לראות באיור 2. היסטוגרמה באיור 3 מראה assay דיכוי מוצלח שבו מיון iTregs (CD25 ^היי CD45RA ^- CD127 תאים ^-/LOW). הם קבוצת משנה רק מתרבות של חמישה ימים, כי רכשה את היכולת הרגולטורית / מדכא איור 4 מראה את הגיוס של Tregs מן הבריכה תא T נאיבי (לוחות למעלה) ו T הזיכרון הנייד בריכה (לוחות למטה), לאחר תרבות של חמישה ימים בכל אמצעי iTreg סטנדרטי. מכתים CFSE של תאים ראשוניים מראים כי גם בתאי ה-T נאיבי (לוח הימנית העליונה) או זיכרון (לוח הימנית התחתונה) כדי לבדל את iTregs (הגבוה ביותר FoxP3-לבטא תאים) רק לאחר כמה סיבובים של חלוקת התא.

באיור 1. סכמטי של הליך ניסיוני. PBMCs arהדואר נפרד מן הדם ההיקפי האנושי באמצעות צנטריפוגה שיפוע לפני סלקציה שלילית המגנטי של CD4 ⁺ CD25 ^- ותאי T. אחרי חמישה עד שישה ימים בתרבית, התאים עוברים FACS והם לשתף מודגרות עם Heterologous תאים CFSE שכותרתו היעד למדוד פעילות מדכא.

איור 2 מטוהרים CD4 ⁺ CD25 העיקריים אדם ^-. ותאי T הם בתרבית iTreg בינוני. Aliquot של תאים נאסף מיד לאחר בידוד (יום 0) ועל בימים 1, 3 ו -5 של תרבית תאים כדי לפקח על ההתקדמות של CD45RA, FoxP3, CTLA-4 ו הסמנים CD25. פרופיל iTreg מתאים CD45RA ^-, FoxP3 ^שלום, CTLA-4 ו CD25 ^{היי היי} (מסומן ב-בחלון הגרף).

איור 3. מטוהרים CD4 ⁺ CFSE laתאים beled (1 X 10 ⁵ / טוב) מתורבתים עם Treg מפקח חרוזים דיכוי בנוכחות תאים זיכרון תמים, או iTreg ממוינים (3 x 10 ⁴ / טוב). לאחר חמישה ימים, התאים נקצרים ו פרופיל CFSE של תאים מוכתמים מנותח על ידי cytometry הזרימה. נוכחות של תאים iTreg מבטל לחלוטין את שגשוג CD4 ⁺ T תאים. המספרים מצביעים על אחוז התאים CFSE שכותרתו שעברו חלוקה.

איור 4 מטוהרים האנושי העיקרי נאיבי. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ וזיכרון (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ ותאי T מגואלות CFSE ותרבותיים ב iTreg בינוני. לאחר חמישה ימים, תאים phenotyped וחלוקת שיעורי סלולריים מוערך. כפי שצויין בתרשים 2, משנה iTreg להבדיל בין שתי קבוצות משנה מתאיםCD45RA ^- CD25 FoxP3 ^{היי היי} ו CTLA-4 ^שלום (שני האחרונים לא מוצג). ההשוואה צביעה פרופילי CFSE לזהות iTregs (כאן התאים הגבוהים ביותר FoxP3 המבטאים ה-T), כמו שגשוג התאים ביותר במהלך התרבות של חמישה ימים.

Discussion

תוך העברת Treg טומן בחובו הבטחה טיפולית עצומה במאבק נגד השתל אוטואימוניות דחייה הפרעות חיסוניות או דלקתיים בתיווך אחרים, שיטות לייצור יעיל שלהם ותחזוקה יציבה טרם פותחו. כמו שרק 1-5% במחזור של אדם ותאי T הם Tregs, הרחבה מבוקרת שלהם בידול מתגבר על זה מיעוט אמצעי הרתעה משמעותי של יישום Tregs לתוך המרפאה. מצד שני, כפי שלמדנו מן הניסיון TGN1412 ^13, הוא הכרחי מבחינה אתית מדעית כדי להבין לעומק את האירועים המולקולריים האדם לתזמר טי התא גורל ההחלטות טרם ביצוע כל משטר טיפולי. בשיטה זו של בידול iTreg, אוכלוסיות כתוצאה של נאיביות, בתאי זיכרון ה-T ו iTregs מפעיל להקל על ביטוי גנים או השוואות תפקודית בין אוכלוסיות של תאים שנובעת תורם דם אדם יחיד היקפי. בידינו, תאים ממוינים להיותלעומת ב microarray ו-PCR qRT ניתוחים כדי למדוד שינויים גנטיים, ב כתמים המערב לבחון אירועים איתות מפתח, או תיקון לחיצה על פונקציונלי למדוד ערוץ יון השימוש ^14.

המערכת שלנו מספקת יתרון נוסף של היכולת לתפעל היבטים מרכזיים של תהליך בידול סביב מסגרת הקריאה המרכזי. לכן, אחד מראש המיון PBMCs יכול לשנות את האוכלוסייה הקלט של תאים או לכלול מעכבי מולקולה קטנה ו ligands עד בינוני התרבות. אפשר גם transfect התאים overexpress או להפיל חלבון של עניין או להציג כתב לבנות. כיתרון נוסף, אנחנו יכולים לשנות את התנאים של התרבות על מנת למקסם את אחוז iTregs שנוצר. בסך הכל, זה התא האנושי העיקרי תרבות T מתווה פלטפורמה ניסיוני מאוד חזקים עם הרלוונטיות פיזיולוגית הרבה יותר מהפער שנוצר מערכות Murine. חשוב מכך, היא עשויה גם לשמור על ערך טיפולי ישיר. ואכן, חודשטי הנוכחי Treg מבוססי גישות טיפוליות כוללות במבחנה או פיתוח לשעבר vivo או מניפולציה של תאים, המערכת שלנו ניתן לראות כצינור חשוב בדרך לקראת הכללת Treg טיפול בתאי ברמת הטיפול. הרחבות עתידיות על המערכת הזו יתאים Tregs להיות מופעל על המפגש עם ספציפי אנטיגנים דלקת ב vivo ולא הפעלת polyclonal תיאר.