Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler

Summary

Vi beskriver en metode for generering av regulatoriske, minne og naive T-celler fra et enkelt menneske blodgiver. Polarisert Tregs kan deretter sammenlignes med andre undergrupper i en rekke genetiske og funksjonelle applikasjoner med genetisk homogenitet, inkludert en undertrykkelse analysen også beskrevet her.

Abstract

Utvikling og vedlikehold av immunsuppressive CD4 ⁺ regulatoriske T-celler (Tregs) bidra til perifer toleranse for å forbli i immunologisk homeostase med den enorme mengden av selvtillit og Commensal antigener i og på menneskekroppen. Forstyrrelsene i balansen mellom Tregs og inflammatoriske konvensjonelle T-celler kan resultere i immunopathology eller kreft. Selv om terapeutisk injeksjon av Tregs har vist seg å være effektiv i murine modeller av ^en kolitt, type I ² diabetes, revmatoid artritt og graft versus host sykdom, ⁴ flere grunnleggende forskjeller i menneskelige versus mus Treg biologi ⁵ har hittil utelukket klinisk bruk. Mangelen på tilstrekkelig antall, renhet, stabilitet og homing spesifisitet av terapeutisk Tregs nødvendiggjorde en dynamisk plattform for menneskelig Treg utvikling som å optimalisere forholdene for sin ex vivo ekspansjon ^6.

Her har vi describe en metode for differensiering av indusert Tregs (iTregs) fra et enkelt menneske perifert blod donor som kan brytes ned i fire stadier: isolasjon av perifere mononukleære blodceller, magnetisk utvalg av CD4 ⁺ T celler, in vitro cellekultur og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) av T-celle undergrupper. Siden Treg signaturen transkripsjonsfaktor forkhead boksen P3 (FoxP3) er en aktivering-indusert transkripsjonsfaktor i mennesker ⁷ og ingen andre unike markør eksisterer en kombinatorisk panel av markører må brukes til å identifisere T-celler med suppressor aktivitet. Etter seks dager i kultur, kan celler i systemet vårt skal avgrenses til naive T-celler, minne T-celler eller iTregs basert på deres relative uttrykk for CD25 og CD45RA. Som minne og naive T-celler har forskjellige rapporterte polarisering krav og plasticities ^8, pre-sortering av den første T-celle befolkningen inn CD45RA ⁺ og CD45RO ⁺ undergrupper kan be brukes til å undersøke disse avvikene. Konsistent med andre, vår CD25 ^Hi CD45RA ^- iTregs uttrykte høye nivåer av FoxP3 ^9, GITR og CTLA-4 ¹¹ og lave nivåer av CD127 ^12. Etter FACS av hver populasjon, kan resulterende celler brukes i en Lyddemper analysen som evaluerer den relative evnen til å forsinke spredning av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-merket autolog T-celler.

Protocol

1. Isolering av humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) fra Buffy Coat

1. Erverve en enhet av Buffy Coat fra sykehuset eller i nærheten blod sentrum. Vårt blod senter gir oss om 40-60 ml av Buffy Coat per enhet hentet fra normale blodgivere.
2. Hell blod inn i en autoklaveres 500 ml glass flaske inneholder sterilt PBS å fortynne Buffy Coat. Den endelige volumet av PBS + Buffy Coat bør være 250 ml.
3. Fyll ti 50 ml koniske rør hver med 20 ml Lymphoprep løsning.
4. Forsiktig overlappe Lymphoprep løsning med 25 ml av den fortynnede Buffy Coat, være forsiktig for ikke å forstyrre Lymphoprep løsningen.
5. Spinn rør i 30 minutter ved romtemperatur på 500 x g. Sørg for å slå av sentrifugen i bremsen, slik at ikke forstyrre lymfocytt fraksjonen.
6. Samle PBMCs i grenseflaten mellom Lymphoprep og plasma-medium lag med en pipette. Aspirer plasma-medium off til ca 1 mLfortsatt dekker Buffy Coat laget som inneholder PBMCs. Bruk en 10 ml pipette til å overføre PBMCs til en ny 50 ml tube.
7. Vask cellene to ganger med PBS og deretter resuspender cellene i 50 ml kaldt RPMI for telling på en hemocytometer. Typisk utvinning er 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMCs.

Denne prosedyren kan skaleres ned til mindre mengder blod. Fortynning av fullblodsprøver er 1:1 i PBS.

2. Magnetic negativ seleksjon av totalt CD4 ⁺ T celler, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ naive T-celler eller CD4 ⁺ CD45RO ⁺ Minne T celler fra PBMCs bruker EasySep berikelse Kits (STEM Cell Technologies)

Fremgangsmåte for å følge for 1 x 10 ⁸ til 4,25 x 10 ⁸ PBMCs.

1. Resuspender PBMCs til en endelig konsentrasjon på 5 x 10 ⁷ per ml i PBS inneholder 2% FBS og 1mm EDTA. Flytt celler til en frisk 14 mL polypropylen rund bunn rør.
   Isolering av totalt menneskelige CD4 ⁺ T celler ved negativ seleksjon: legg menneskelige CD4 ⁺ T celler Enrichment cocktail av antistoffer (50 mL per ml PBMCs), bland og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
   1. Isolering av menneskelige naive T-celler ved negativ seleksjon: tilsett 50 mL av anti-CD45RO antistoff per ml av PBMC cellesuspensjon, miks og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur. Legg berikelse cocktail følger med i settet (50 mL av per ml PBMCs), bland og Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
   2. Isolering av menneskets hukommelse T-celler ved negativ seleksjon: legg menneskets hukommelse CD4 ⁺ T celler Enrichment cocktail av antistoffer (50 mL per ml av PBMCs), bland og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur.
2. Bland magnetiske partikler godt å like distribuere dem hele løsningen. Ikke vortex nanopartikler fra naiv kit.
3. Legg de magnetiske partikler (100 mL per ml av PBMCs for totale CD4 ⁺ og naive T celleutvalget, 50 mL per ml av PBMCs for minne T-celle utvalg). Bland forsiktig pipettere 2-3 ganger og Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter for naive T-celler utvalg eller 5 minutter for minnekort eller total CD4 ⁺ T celler valg.
4. Legg PBS inneholder 2% FBS og 1 mM EDTA for å få volumet opp til 10 ml per rør. Bland ved å forsiktig pipettere 2-3 ganger før du plasserer uncapped rør inn sølv EasySep magnet for 5, 10 eller 2,5 minutter for totalt CD4 ⁺ T celler, naiv og minne undergrupper, henholdsvis.
5. Med tube fortsatt i EasySep magnet, hell væske inn i nye 50 ml tube å isolere celler av interesse.
6. Gjenta trinn 2.5 og 2.6 for bedre utvinning.

3. Cellekultur Forhold å indusere regulatoriske T-celler

1. Dagen før trinn 1 og 2, jakke vevskulturstudier plater ved første fortynne anti-CD3 antistoff (OKT3 klone) til en konsentrasjon på 1 mg / ml i steril PBS. For en 6 brønn plate tilsett 2 mL PBS + anti-CD3 per brønn, for en 12 brønn plate tilsett 1 ml eller for en 24 brønn plate legge 500 mL per brønn. Hold belagt plate ved 4 ° C inntil bruk.
2. Forbered polarisering middels ved å legge 10% varme-inaktiverte fostermedisin Bovine Serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin og 50 mikrometer β-mercaptoethanol til RPMI-1640 pre-supplert med 2,06 mM Glutamax-I og 25 mm HEPES buffer. Deretter legger 2 ng / ml TGF-β og 5 ng / ml IL-2. Her kan man legge til ligander eller hemmere av interesse for media. Resuspender celler fra trinn 2 i en konsentrasjon på 2 x 10 ⁶ celler / ml av polarisering middels.
3. Pre-varme plater ved 37 ° C og aspirer PBS ut av anti-CD3-belagte brønner før du legger celler. Tilsett 4 ml per brønn av cellesuspensjon for en 6 brønn plate, 2 mL av celler for en 12 brønn plate eller 1 mL celler for en 24 brønn plate. Fyll opp tomme brønner med PBS å redusere fordampning avmedia. Inkuber i 3 dager ved 37 ° C / 5% CO _2.
4. På dag 3 innlegg plating, spinner ned plate i en sentrifuge i 5 minutter ved 500 x g. Uten å forstyrre T-celler på bunnen av tallerkenen, fjerne halvparten av media og erstatte med ferske media. Alternativt, hvis brønnen blir overfylt med celler (konsentrasjon over 3 x 10 ⁶ / ml), dele volumet likt inn i en annen anti-CD3 belagt plate og legge ferske media tilbake til opprinnelig volum. Inkuber i to til tre dager ved 37 ° C / 5% CO _2.

4. Fluorescens-Aktivert Cell Sorting (FACS) av tre populasjonene av T-celler

1. Forbered FACS vaske buffer ved å legge til 0,5% (w / v) bovint serum albumin (BSA) og 2 mM EDTA til sterilt PBS. Plasser buffer ved 4 ° C for å få kaldt.
2. Fjern celler fra cellekultur godt og skyll hver brønn med 2 mL PBS for å sikre fullstendig celle utvinning. Legg alle cellene i 50 ml polypropylen rør og sentrifuger ved 500 xg for 10minutter ved 4 ° C.
3. Telle celler i et hemocytometer å bestemme celle tetthet.
4. Place 3-5 x 10 ⁵ celler per tube i fire separate 5 ml rund bunn polystyren rør for kompensasjon kontroller. Plasser gjenværende cellene i 50 ml polypropylen rør, ikke mer enn 35 x 10 ⁶ celler per tube.
5. Spinn ned celler i 5 minutter ved 4 ° C og aspirer media. Resuspender celler skal sorteres i 90 mL med kaldt vaske buffer per 1 x 10 ⁶ celler. Resuspender i 100 mL med kaldt vask buffer kompensasjonsavgift kontrollrørene.
6. Til cellene som skal sorteres, kombinere to mL av anti-CD25-PE, 3 mL av anti-CD45RA-PE-Cy5 og 1 mL av anti-CD127-APC per 1 x 10 ⁶ celler. Legg ikke antistoff mot den første kompensasjon kontroll rør, 2 mL av anti-CD25-PE til andre rør, 3 mL av anti-CD45RA ^- PE-Cy5 til tredje røret And1 mL av anti-CD127-APC til fjerde røret. Inkuber alle rør på is i 45 minutter i mørket.
7. Aspirer buffer og resuspender celler i en konsentrasjon på 1 x 10 ⁷ celler per ml vaske buffer. Tilsett 1,5 mL av DNase II per ml av cellene før filtrering gjennom en 40 mM nylon celle sil. Flytt celler til flere 5 ml rund bunn polypropylen rør med ikke mer enn 3,5 mL per rør. Resuspender kompensasjon kontroll celler i 300 mL av vask buffer.
8. Sett kompensasjon på MoFlo strømningscytometeret å minimere kors påvisning av PE, APC og PE-Cy5 filtre. Sett porter for å sortere iTregs (CD25 ^Hi CD127 ^-/LOW CD45RA ^- celler), naive (CD25-CD45RA ⁺⁾ og minne (CD25 ^- CD45RA ^-) T-celler i 5 ml rund bunn polystyren rør som inneholder 1 ml nyfødt kalv serum.

5. Suppression Assay

1. Gjør suppression analysen media ved å tilsette 100 U / ml av penicillin, 100 mikrogram / ml av streptomycin, 5 ng / ml IL-2 og 2 ng / ml av TGF-β til AIM-V.
2. Dagen av analysen, rense heterologe CD4 ⁺ T celler fra Buffy Coat som angitt i trinn 1 og 2. Disse vil være målcellene for undertrykkelse analysen og ikke inneholder CD25 ⁺ Treg celler, som kan sees i figur 2, Dag 0.
3. Label celler med CellTrace kit pr produsentens anvisninger, unntatt ved hjelp av bare ett mL av 5 mM stamløsning per ml av celler i stedet for 2 mL. Holde ut fra direkte lys, legge til 18 mL av DMSO levert av CellTrace kit til en ampulle med CFSE å lage en 5 mM stamløsning. Resuspender det nødvendige antall målcellene (til maksimalt 1 x 10 ⁷⁾ i prewarmed PBS + 0,1% (w / v) BSA til en endelig konsentrasjon på 1 x 10 ⁶ celler / ml. Tilsett 1 mL av 5 mM CFSE per ml av celler og inkuberes i en 37 ° C vannbad i 5 minutes. Legg til 5 volumer av komplett, iskald RPMI med 10% FBS å slukke flekker og inkuber på is i 5 minutter. Vask cellene to ganger flere med kald komplett RPMI og resuspender 1 x 10 ⁵ celler per 100 mL av undertrykkelse analysen media.
4. Treg undertrykkelse inspektør perler er på et lager konsentrasjon på 2 x 10 ⁷ perler / ml. Pellet en rekke perler lik det totale antall celler per eksperiment ved rask sentrifugering i en Eppendorf rør. Vask perler gang med RPMI og re-pellet. Etter aspirasjon av RPMI, Resuspender perler slik at riktig mengde perler per brønn er i 8 mL av undertrykkelse analysen media.
5. Til en 96 vel rund bunn vevskultur plate, legge CFSE-fargede celler (1 x 10 ⁵ celler / ml), kontrollør perler og polariserte og sorteres celler (1 x 10 ⁵ celler / ml) i friske undertrykkelse analyseverdier media til en ønsket mål (CFSE beiset): effektor (sortert) forholdet i en endelig volum på 200 mL. Alle vilkår er satt i triplisertifikater.
6. Klargjør den første av to kontroll forhold ved å tilsette 100 mL av CFSE fargede celler, 8 mL av inspektør perler og 1 x 10 ⁵ av friske, unstained celler i 92 mL suppressor analysen medium per brønn. Forbered andre kontrollen med de samme cellulære komponenter som ovenfor men uten Treg inspektør perler.
7. Dekkplate i aluminiumsfolie og Inkuber ved 37 ° C / 5% CO ₂ i fem dager.
8. I mørket, samle celler fra hver brønn ved pipettering og plass i en 5 ml rund bunn polystyren tube. Sentrifuger cellene ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C, aspirer media, og resuspender i 300 mL kalde FACS vaske buffer fra trinn 4. Analyser første 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ hendelser fra den levende lymfocytt gate representerer målceller i et histogram med Cell Quest Software.

6. Representative Resultater

Eksempel på flowcytometrisk pseudocolor prikk plott over en fem-dagers tid-belRSE overvåking iTreg differensiering basert på den relative co-uttrykk av CD25 med FoxP3, kan CTLA-4 og CD45RA sees i figur 2. Histogrammet i Figur 3 viser en vellykket undertrykkelse analysen som sorteres iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 ^-/LOW celler). Er den eneste delsett fra en fem dagers kultur som har kjøpt regulatorisk / suppressor evne Figur 4 viser induksjon av Tregs fra en naiv T celle pool (toppaneler) og et minne T-celle pool (nederste paneler), etter fem dagers kultur i standard iTreg medium. CFSE farging av innledende celler viser at enten naive (øverst til høyre panel) eller minne T-celler (nederst til høyre panel) differensiere å iTregs (høyest FoxP3-uttrykke celler) først etter flere runder med celledeling.

Figur 1. Skjematisk av eksperimentell prosedyre. PBMCs are skilt ut av humant perifert blod via gradient sentrifugering før magnetisk negativ seleksjon av CD4 ⁺ CD25 ^- T-celler. Etter fem til seks dager i kultur, celler gjennomgå FACS og er co-inkubert med heterologe CFSE merket målceller å måle suppressor aktivitet.

Figur 2 Purified menneskelige primære CD4 ⁺ CD25 ^-. T-celler dyrkes i iTreg medium. En delmengde av celler er hentet rett etter isolering (dag 0) og på dag 1, 3 og 5 i cellekultur for å overvåke fremdriften av CD45RA, FoxP3, CTLA-4 og CD25 markører. Den iTreg profilen tilsvarer CD45RA ^-, FoxP3 ^Hei, CTLA-4 ^Hei og CD25 ^Hi (uthevet i in-grafen vindu).

Figur 3. Purified CD4 ⁺ CFSE labeled celler (1 x 10 ⁵ / brønn) dyrkes med Treg undertrykkelse inspektør perler i nærvær av sorterte naiv, minne eller iTreg celler (3 x 10 ⁴ / brønn). Etter fem dager, blir cellene høstet og CFSE profilen av de fargede cellene er analysert ved flowcytometri. Tilstedeværelsen av iTreg celler opphever helt spredning av CD4 ⁺ T celler. Numbers er en indikasjon på andelen CFSE-merkede celler som har gjennomgått divisjon.

Figur 4 Renset human primær naivt. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ og minne (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ T celler er farget med CFSE og kultivert i iTreg medium. Etter fem dager, blir cellene phenotyped og celledelingsrate anslått. Som vist i figur 2, tilsvarer iTreg undergruppe differensiert fra begge undergrupper tilCD45RA ^- CD25 ^Hei FoxP3 ^Hei og CTLA-4 ^Hei (de to sistnevnte ikke vist). Sammenlignende CFSE flekker profiler identifisere iTregs (her som de høyeste uttrykker FoxP3 T-celler) som de mest proliferative celler under den fem dager kultur.

Discussion

Mens Treg overføring holder enorm terapeutisk løftet i kampen mot autoimmunitet pode avvisning og andre immun eller provoserende-mediert lidelser, metoder for deres effektiv produksjon og stabil vedlikehold ennå ikke er utviklet. Som bare 1-5% av sirkulerende menneskelige T-celler er Tregs, overvinner deres kontrollert ekspansjon og differensiering dette sparsomt som en stor avskrekkende for gjennomføringen av Tregs inn i klinikken. På den annen side, så vi lært fra TGN1412 rettssaken ^13, er det vitenskapelig og etisk nødvendig å dypt forstå de molekylære hendelsene som arrangerer humane T-celle skjebne beslutninger før implementere noen terapeutisk regime. Med denne metoden for iTreg differensiering, de resulterende bestander av naive, minne, effektor T-celler og iTregs lette genekspresjon eller funksjonelle sammenligninger mellom populasjoner av celler som stammer fra et enkelt menneske perifert blod donor. I våre hender, har sortert celler værtsammenlignet i microarray og QRT-PCR-analyser for å måle genetiske endringer, i vestlige blotter å undersøke viktige signalmolekyler hendelser, eller i patch klamring til funksjonelt måle ionekanal bruk ^14.

Vårt system gir den ekstra fordelen av evnen til å manipulere sentrale sider ved differensiering prosessen rundt en sentral ramme og avlesning. Dermed kan en pre-sorter PBMCs å endre input populasjon av celler eller inkludere små molekyl-hemmere og ligander til kulturen medium. Man kan også transfektere celler til overuttrykker eller slå ned et protein av interesse eller innføre en reporter konstruere. Som en ekstra fordel, kan vi endre vilkårene for kulturen å maksimere andelen iTregs generert. Samlet skisserer denne menneskelige primære T cellekultur en meget robust eksperimentell plattform med en fysiologisk relevans langt større enn de som er opprettet i murine systemer. Viktigere, kan det også opprettholde et direkte terapeutisk verdi. Faktisk, som most gjeldende Treg-baserte terapeutiske tilnærminger involvere in vitro eller ex vivo utvikling eller manipulering av celler, kan systemet vårt bli sett på som en viktig kanal på veien mot inkludering av Treg celleterapi i standard vare. Framtidige utvidelser på dette systemet vil skreddersy Tregs å bli aktivert ved møte med spesifikk in vivo inflammatoriske antigener snarere enn polyklonale aktivering beskrevet.