从初级人类的幼稚和记忆T细胞的诱导调节性T细胞的生成

Summary

我们描述了从一个单一的人献血的监管，内存和幼稚T细胞产生的一种方法。极化调节性T细胞可以比较多种遗传同质性，这里还详细介绍了包括抑制法与遗传和功能应用中的其他子集。

Abstract

免疫的CD4 ⁺调节性T细胞（Tregs）的开发和维护，促进周边的宽容，需要保持大量对人体的自我和共生抗原在免疫稳态。调节性T细胞和炎症常规T细胞之间的平衡扰动可导致免疫病理或癌症。虽然已被证明是⁴几个根本的分歧在人类与小鼠的调节性T细胞生物学^{5 1，I}型糖尿病^，类风湿关节炎和移植物抗宿主病，结肠炎的小鼠模型中的有效调节性T细胞治疗注射迄今排除了临床使用。由于缺乏足够数量，纯度，稳定性和特异性治疗调节性T细胞归巢的需要Treg的人类发展的动力平台上，以优化条件下体外扩增 ^6。

在这里，我们倒是描述一个从一个单一的人外周血献血，其中可分为四个阶段的分化诱导调节性T细胞（iTregs）分离外周血单个核细胞，CD4 ^{+ T}细胞磁性选择的方法： 在体外细胞培养和荧光激活T细胞亚群细胞分选（FACS）。由于Treg的签名转录因子叉头框P3（FOXP3）是人类⁷激活诱导的转录因子，并没有其他存在独特的标记，标记的组合面板必须用于识别与抑制活性的T细胞。 6天培养后，细胞在我们的系统可以被划分成幼稚T细胞，记忆T细胞或基于其相对表达CD25，CD45RA的iTregs。由于内存和幼稚T细胞有不同的极化要求和可塑性^8，牛逼成CD45RA ⁺和CD45RO细胞人口的初始预分拣⁺亚群可以E中检查这些差异。与他人一致，CD25表达^喜 CD45RA的^- iTregs快递高水平的FOXP3 ^9，GITR和CTLA-4的^第11和CD127 ^12的水平低。按照每个人口的流式细胞仪，由此产生的细胞可用于在评估相对延缓羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自体T细胞增殖能力的抑制实验。

Protocol

1。分离人外周血单个核细胞（单核细胞从白膜）

1. 从医院或附近的血液中心位置，获得一个单位白膜。我们的血液中心提供约40-60毫升单位正常献血者中获得的棕黄色大衣。
2. 倒入蒸压500毫升玻璃瓶含无菌PBS稀释白膜血。最终体积的PBS +白膜应该是250毫升。
3. 装满十50​​ ml锥形管各20毫升Lymphoprep的解决方案。
4. 轻轻覆盖25毫升稀释白膜Lymphoprep解决方案，小心不扰乱Lymphoprep的解决方案的。
5. 在室温下30分钟500×Ğ旋转管。确保关闭离心机的制动，以便不打扰淋巴细胞分数。
6. 用吸管的Lymphoprep和等离子体介质层之间的接口在收集的外周血单核细胞。吸出，直到约1毫升血浆介质关闭仍然涵盖的的白膜层含有的单核细胞。使用10毫升吸管，单核细胞转移到一个新的50 mL管。
7. 用PBS洗涤细胞两次和然后悬浮在50毫升冷的RPMI上血球计数细胞。典型的复苏是8×10 ⁸ - 1×10 ⁹单核细胞。

此过程可缩减为较小的血液量。在PBS稀释的全血样本是1:1。

2。总的CD4 ⁺ T细胞的磁负选择，CD4 ⁺ CD45RA ⁺幼稚T细胞或CD4 ⁺ CD45RO + ⁺记忆T细胞使用EasySep富集试剂盒的单核细胞（干细胞的技术）

要遵循的步骤为1×10 ^{8〜4.25×10 8}单核细胞。

1. 重悬单核细胞的终浓度为5×10 ⁷ PBS中，每毫升含有2％FBS和1mM EDTA。细胞移动到一个新的14 mL聚丙烯圆底管。
   总人CD4 ⁺ T细胞的阴性选择分离：增加人体的CD4 ⁺ T细胞富集抗体鸡尾酒（50μL每毫升的外周血），混合，在室温下孵育10分钟。
   1. 人类幼稚T细胞的阴性选择分离：添加50μL抗CD45RO的每毫升外周血单个核细胞悬液，混合抗体，孵育15分钟，在室温下。加入浓缩试剂盒（50μL每毫升外周血），混合，在室温10分钟孵育提供的鸡尾酒。
   2. 人类的记忆性T细胞的阴性选择分离：添加人类记忆CD4 ⁺ T细胞富集抗体鸡尾酒（50μL每毫升的外周血），混合孵育10分钟，在室温下。
2. 混合磁性粒子，平均分配在整个解决方案。做不涡纳米粒子，从天真套件。
3. 添加磁性颗粒（100μL，每毫升的外周血总CD4 ⁺幼稚T细胞的选择，50μL每毫升的外周血记忆性T细胞的选择）。混合轻轻吹打在室温下的2-3倍，并培育幼稚T细胞的选择10分钟或5分钟内存或总的CD4 ^{+ T}细胞的选择。
4. 添加PBS包含2％胎牛血清和1 mM的EDTA带来量高达每管10毫升。混合轻轻吸取前封顶管总的CD4 ⁺ T细胞，幼稚和记忆亚群，分别为5年，10或2.5分钟放入银EasySep磁铁的2-3倍。
5. 管仍然在EasySep磁铁，注入新的50 mL试管液体隔离感兴趣的细胞。
6. 重复步骤2.5和2.6为更好地恢复。

3。细胞培养条件诱导调节性T细胞

1. 步骤1和2，大衣组织培养板前一天先稀释的抗CD3抗体（OKT3治疗克隆）1微克/毫升无菌PBS浓度。 6孔板，加入2毫升的PBS +每口井的抗CD3，12孔板，加1毫升，或24孔板，每孔加500μL的。保持涂层板在4°C，直到使用。
2. 准备加入RPMI-1640前用2.06毫米补充Glutamax-I和25毫米的10％热灭活小牛血清（FBS），100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素和50μMβ-巯基乙醇介质极化HEPES缓冲。接下来，添加2毫微克/毫升TGF-β和5 ng / ml的IL-2。在这里，人们可以添加媒体感兴趣的配体或抑制剂。悬浮细胞从第2步，在2×10 ⁶细胞/毫升的极化介质的浓度。
3. 预暖板在37°C和吸PBS的抗CD3涂井前加入细胞。 6孔板，12孔板或24孔板1毫升细胞2毫升细胞，加入4毫升，每孔细胞悬液。填补井空，以减少水分蒸发，用PBS媒体。在37°C / 5％CO ₂孵育3天。
4. 第3天后电镀，降速为5分钟离心500×Ğ板。不打扰板底部的T细胞，取出一半的媒体和新媒体取代。另外，如果井变得人满为患与细胞（3×10 ⁶ /毫升以上的浓度），平分到另一个抗CD3涂层板的体积和补充新鲜媒体回升到原来体积。两到三个多天在37°C / 5％CO ₂孵育。

4。荧光激活细胞分选（FACS）T细胞群体

1. 准备加入0.5％（W / V）牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的无菌PBS洗涤液的流式细胞仪。地方缓冲区在4°C至冷。
2. 删除从细胞培养细胞，每孔2毫升的PBS冲洗，以确保完整的细胞恢复。将50毫升聚丙烯管的所有细胞，离心10 500 XG分钟，在4°C。
3. 血球计数细胞，以确定细胞密度。
4. 地方3-5×10 ⁵细胞每管四个独立的5毫升圆底聚苯乙烯补偿控制管。将50毫升聚丙烯管，不超过35×10 ⁶个细胞管中剩余的细胞。
5. 降速细胞在4°C和抽吸介质为5分钟。悬浮细胞在90μL冷水洗每1×10 ⁶细胞的缓冲区排序。悬浮在100μL冷洗涤液的补偿控制管。
6. 对细胞进行排序，结合抗CD25-PE，2μL的反CD45RA的PE-Cy5的3μL，1μL，每1×10 ⁶细胞的抗CD127-APC。没有抗体补偿控制管，2μL抗CD25-PE的第二管，抗CD45RA的3μL ^- PE-Cy5的第三管AND1μL抗CD127-APC第四管。冰上孵育45分钟，在黑暗中所有的管子。
7. 吸在1×10 ⁷细胞每毫升洗涤液浓度的缓冲和重悬细胞。通过40微米尼龙细胞过滤器过滤前添加的DNase II的细胞每毫升1.5μL。将细胞要多5 mL圆底聚丙烯管，每管不超过3.5毫升。补偿控制细胞重悬于300μL洗涤液。
8. 补偿设置上MoFlo流式细胞仪的PE，APC和PE-Cy5的过滤器，以尽量减少交叉检测。设置门排序iTregs（CD25表达^喜 CD127 ^-/LOW CD45RA的^-细胞）5 mL圆底聚苯乙烯管含有1 mL的小牛血清T细胞，幼稚（CD25-CD45RA的^+）和内存（CD25表达^{- -} CD45RA的）。

5。制止含量

1. 使suppr加入100的U / ml青霉素，链霉素100微克/毫升，5毫微克/毫升的IL-2和2毫微克/毫升，TGF-β在AIM-V的分裂国家法媒体。
2. 每天的检测，净化异的CD4 ⁺ T为细胞在步骤1和2表示从白膜。这些都将抑制试验的靶细胞和不含有CD25 ^{+ Treg}细胞，可以看到在图2 0日。
3. 标签细胞CellTrace套件，为制造商的指示，只用1μL5毫米，每毫升的细胞，而不是2μL，原液除外。直接光了，一小瓶CFSE标记添加18μL二甲基亚砜提供由CellTrace套件做一个5毫米的原液。悬浮在预热的PBS + 0.1％（W / V）牛血清白蛋白的靶细胞所需数量（最高为1×10 ^7）至终浓度为1×10 ⁶细胞/ ml。加入1μL5毫米每毫升细胞CFSE标记，并在37℃水浴中孵育5 minutES。加入含10％胎牛血清5卷完整的，冰冷的RPMI，解渴染色并在冰上孵育5分钟。洗净用冷水完整的RPMI 1重悬细胞两倍以上×10 ⁵细胞每100μL抑制法媒体。
4. Treg细胞抑制督察珠的股票在2×10 ⁷珠/毫升的浓度。颗粒的珠子数量等于每Eppendorf管中的快速离心实验细胞的总数。一次洗珠用RPMI和再沉淀。的RPMI愿望后，重悬珠，使每口井珠适量8μL抑制法媒体。
5. 到96圆底培养板，添加CFSE染色的细胞（1×10 ⁵细胞/ ml），督察珠和新鲜抑制试验介质的极化和排序细胞（1×10 ⁵细胞/ ml）到一个理想的目标（CFSE染色）：在200微升的最终体积效应（排序）的比率。所有条件都在tripli设置盖茨。
6. 准备加入100μLCFSE染色的细胞，8μL督察珠和1×10新鲜的，未染色的细胞，每孔92μL抑制试验介质的两个控制条件。与上述相同的细胞成分，但没有调节性T细胞督察珠准备第二控制。
7. 覆盖在37°C / 5％CO ₂板铝箔，并培育了五天。
8. 在黑暗中，从每口井的细胞收集在5 mL圆底聚苯乙烯管的移液器和地点。离心5分钟，在500 XG细胞在4°C时，抽吸介质，并从第4步洗涤缓冲液在300冷流式细胞仪悬浮。分析的第一个3×10 ⁴ CFSE标记⁺代表靶细 ​​胞与细胞Quest软件的直方图从现场淋巴细胞门事件。

6。代表结果

例如，流式细胞仪伪点缀了为期五天的时间，凑地块RSE的监测iTreg分化的基础上共同表达的CD25与FOXP3的相对，CTLA-4和CD45RA的可以看出，在图2。在图3中的直方图显示了一个成功的抑制实验中排序iTregs（CD25表达^喜 CD45RA的^-细胞CD127 ^-/LOW）。为期五天的文化，已获得监管/抑制能力是唯一的一个子集， 图4显示了调节性T细胞诱导从一个天真的T细胞池（顶部面板）和记忆T细胞池（底板）后五天文化标准iTreg介质。 CFSE标记的原始细胞染色表明，无论是天真的（右上面板）或记忆T细胞（右下面板）区分只经过几轮细胞分裂到iTregs（最高Foxp3的表达）。

图1。实验过程示意图。外周血ART细胞^-通过梯度离心分离出人外周血前磁⁺ CD25表达的CD4阴性选择E。 5至6天培养后，细胞进行流式细胞仪，并与异CFSE标记靶细胞共同孵育测量抑制活性。

图2纯化的人主要的CD4 ⁺ CD25 ^- T细胞培养iTreg介质。等份细胞被收集后隔离（0天），并在细胞培养1天，3和5，监察CD45RA的，FOXP3，CTLA-4和CD25标记的进展。 iTreg轮廓对应CD45RA的^- ，FOXP3 ^嗨 ，CTLA-4 ^高和CD25 ^HI（在图形窗口中高亮显示）。

纯化的CD4 ⁺ CFSE标记拉图3。贝莱德细胞（1×10 ⁵ /孔）培养中存在天真排序，内存或iTreg细胞的调节性T细胞抑制督察珠 （3×10 ⁴ /孔）。五天后，细胞收获和染细胞的流式细胞仪检测CFSE标记的文件。 iTreg细胞的存在，完全废除的CD4 ^{+ T}细胞的增殖。有数字表明CFSE标记的细胞发生分裂的百分比。

图4纯化的人类主要天真（的CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ^+）和内存（的CD4 ⁺ CD25 ^- CD38 ^+）T细胞被染色CFSE和培养iTreg中等。五天后，细胞phenotyped和细胞分裂率估计。 如图2所示，从两个亚群分化的iTreg子集对应CD45RA的^- CD25表达^喜 FOXP3 ^高和CTLA-4 ^高 （后者未显示）。比较CFSE染色型材iTregs（这里的最高表达Foxp3的T细胞）识别在为期五天的文化最增殖细胞。

Discussion

虽然拥有巨大的调节性T细胞的转移在打击自身免疫排斥反应和其他免疫或炎症介导的疾病，其高效发电和维护稳定的方法治疗的承诺尚未开发。由于只有1-5％的循环人类T细胞是调节性T细胞，他们控制的扩张和分化克服这种缺乏作为实施调节性T细胞进入临床的主要威慑。另一方面，我们从审判¹³ TGN1412了解到，这是科学和伦理的必要深入了解分子事件，编排实施任何治疗方案之前，人类T细胞命运的决定。用这种方法iTreg分化，导致人口的天真，内存，效应T细胞和iTregs促进从一个单一的人外周血捐助派生的细胞种群之间的基因表达或功能的比较。在我们的手中，排序细胞已相比，在芯片和QRT-PCR分析来衡量遗传印迹的变化，研究关键的信号事件，或在补丁夹紧功能测量离子通道的使用^14。

我们的系统提供了额外的好处的能力来操纵的分化过程中的关键环节，围绕一个中心框架和读数。因此，可以预排序的单核细胞，改变细胞的输入人口或包括小分子抑制剂和配体的培养基。也可以转染细胞过度或击倒感兴趣的蛋白质或介绍记者建造。作为一个额外的好处，我们可以改变培养条件，以最大限度地发挥产生iTregs的百分比。总的来说，这个人类T细胞培养与生理意义远远比在小鼠系统创建描绘了非常可靠的实验平台。重要的是，它也可能维持一个直接的治疗价值。事实上，作为MOST电流的调节性T细胞的治疗方法， 在体外或体外的发展或操纵细胞的参与，我们的系统可以被看作是对列入中Treg细胞疗法的护理标准的道路上的重要渠道。这个系统未来的扩展将裁缝调节性T细胞成为激活后，与具体的 ，而不是描述的多克隆激活体内的炎症抗原相遇。