Summary
Быстрый способ изменить геном
Protocol
Метод TransFLP (рис. 1) на примере трех различных подходов: I) удаление двух соседних генов, кодирующих вирулентности детерминанты В. вибрион (например, ΔctxAB); II) удаление островка патогенности (например, ΔVPI-1) и III) интеграция полимеразы T7-зависимой РНК-последовательность промотора перед геном из интереса, который впоследствии позволяет его искусственное выражение в соответствующем фоне деформации (например, T7-tfoX) (рис. 2).
1. Получение хитина хлопья
- Вес 50-80 мг хитина хлопья в стандартных 1,5 мл пластиковую трубку. Это могут быть получены в большом объеме. Хитин хлопья являются коммерчески доступными от Sigma (кат. номер C9213).
- Автоклав хлопья поддержанию крышки трубы открыты.
- Немедленно закройте крышками после автоклав остынет.
- Магазин автоклавного хитина хлопьевпри комнатной температуре.
2. Дополнительно: Искусственная трансформация V. вибрион с Flp рекомбиназой кодирования плазмиды
- Подготовка электрокомпетентные V. вибрион клеток с использованием стандартных методов 11. Хранить аликвоты компетентных клеток при -80 ° C.
- Добавить 1-2 мкл регулярные мини-подготовка плазмиды PBR-ФЛП 5 до электрокомпетентные V. вибрион клеток и передачи смеси в кювете электропорации (0,2 см ширины щели).
- Применить импульса на уровне 1,6 кВ.
- Добавить 0,9 мл SOC среде, мягко передавать ячейки в стандартном 14 мл трубки. Инкубируйте неподвижные в течение 2,5 до 3 часов при 30 ° C.
- Плита 100 мкл и 300 мкл на пластинах LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина и инкубировать при 30 ° C в течение ночи.
- Очищают одного клона и магазин как глицерин наличии для будущих экспериментов TransFLP.
3. Олигонуклеотидов Дизайн и полимеразной цепной реакции
- По меньшей мере шесть олигонуклеотидов, необходимых для усиления участка ДНК (ы) интерес, а также FRT-окружении антибиотиков кассеты методом ПЦР (рис. 3). Рекомендуется также включать в себя пару грунтовки олигонуклеотидов за пределами вставленного фрагмента ПЦР. Это позволяет проверки интеграции и правильное удаление FRT-окружении антибиотиков кассеты сопротивления (например, изображается как "CHK-вверх" и праймеры "CHK-вниз" на рисунках 3 до 5).
- Дизайн олигонуклеотидов, № 2, № 3, № 4 и № 5 с осторожностью. Они должны быть в состоянии в достаточной степени отжига (например, ~ 28 б.п.), в шаблоне ДНК. Шаблона ДНК геномной ДНК (гДНК) для праймеров № 2 и № 5 и FRT-Кан-FRT-содержащие ДНК плазмиды, такие как pROD17 12 и СКД-FRT-KAN-FRT (это исследование) для праймеров № 3 и № 4 ( рис. 3а).
- Дизайн праймеров № 2 к № 5 позволяет обширная база спаривания на их 5'-конце между # 2 / # 3 и # 4 / # 5, соответственно (рис. 3А
- Выполните три независимые реакции ПЦР, как 1-й раунд ПЦР. Первый из них будет усиливать вверх по течению области гена / ДНК регионе интересов, с помощью олигонуклеотидов № 1 и № 2. ПЦР должно привести фрагмент, по меньшей мере, 500 б.п. в длину, чтобы гомологичной рекомбинации в клетках. Более короткие фрагменты (~ 250 б.п.) может быть достаточным 8, но не рекомендуется.
- Параллельно выполнить второй ПЦР, который усиливает FRT-окружении антибиотиков кассеты. Для примеров, приведенных здесь, мы в основном использовали APH (кан R). Использование олигонуклеотидов № 3 и № 4 для этой реакции (рис. 3А).
- Одновременно усиливаются вниз по течению области ДНК с помощью ПЦР (третьего образца). ПЦР-фрагмента должна быть не менее 500 б.п. в длину. Выполните ПЦР с гДНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов № 5 и № 6 (рис. 3А).
- После очистки всех трех PCRфрагментов, выполните 2-й раунд ПЦР. Используйте равные смесь всех трех фрагментов, полученных в первом туре в качестве шаблона. Усиление катализируется олигонуклеотидов № 1 и № 6. Полученные ПЦР-фрагмента (рис. 3В) служит преобразование ДНК в естественный эксперимент преобразование (рис. 1).
4. Хитин-индуцированной естественное преобразование
- Расти V. вибрион клетки аэробно в богатой среде при температуре 30 ° C до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,5.
- Урожай бактерий с помощью центрифугирования. Вымойте гранул один раз в определенный искусственной среде (DASW 6) до ресуспендирования клеток в 2 объемов DASW. Добавить 1 мл культуры до 50-80 мг стерильной хитина хлопья (объяснено в пункте 1). Если бактерии гавани плазмиды PBR-ФЛП (дополнительный пункт 2), добавить ампициллин (50 мкг / мл) в культуру. Инкубировать при 30 ° С в течение 16-24 часов без движения.
- Добавить & Gе, 200 нг 2-й круглый ПЦР-фрагмента производных (объясняется в пункте 3). Тщательно перемешать без широкой отсоединения от бактерий хитин поверхности. Инкубировать при температуре 30 ° C в течение 24 часов без движения.
- Vortex культуры широко течение ≥ 30 сек. Распространение 100-300 мкл на селективной среде LB пластины (например, канамицин и гентамицин содержащих LB пластины для примеров, приведенных здесь). Используйте двойные селективные пластины, если бактерии питать плазмиды PBR-ФЛП, добавив ампициллина одновременно с другими антибиотиками. Инкубируйте пластины при температуре 30 ° C в течение 16-24 ч или до колонии видны.
- Изолировать одного трансформантов с селективным пластин. Такие трансформантов заменили оригинальные хромосомный локус по ПЦР-фрагмента в связи с двойным событием кроссовера. Эти штаммы могут быть непосредственно использованы для дальнейших экспериментов в случае удаления антибиотика кассеты не надо.
5. Удаление Селективный кассеты (ы) FlpРекомбинации
- Искусственно превратить ваш трансформантов плазмидной PBR-ФЛП, как описано в пункте 2, если не сделано до того, как природные анализ трансформации.
- Рост бактерий на LB агаром, содержащей ампициллин при 37 ° C в течение 16-24 часов. Функции: изменение температуры между течение 2-3 ч до 40 ° C как выражение ФЛП из плазмиды PBR-ФЛП-де-репрессированы при более высоких температурах 5,10; передача бактерий на свежую пластин прим. 8 ч инкубации.
- Тест на чувствительность антибиотиков (продемонстрировано здесь для канамицин, рисунок 1), restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агаром. Изолировать один чувствительный колонии. Замораживание устойчивых к ампициллину клон как глицерин складе, если вы намерены и в дальнейшем изменять напряжение с другими удаления / вставки использованием TransFLP.
6. Плазмида отверждения
- Расти культуры ночи в аэробных условиях ипри 30 ° C. Использование обогащенной среде без добавления любого антибиотика.
- Дополнительно: Вырастить свежие культуре в течение 3-6 часов путем разбавления ночь 1:100 культуры в свежую без антибиотиков среды.
- Плиты или полосы разбавления (ы) культуры на равнине пластины агара LB (ы) и инкубировать при 30 ° С в течение 8-16 ч (до колонии видны).
- Тест на ампициллин-чувствительность клонов restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агара (рис. 1). Замораживание ампициллин-чувствительного штамма как глицерин акций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты трех примерах показаны на рисунках 4 до 6. Первый подход, направленный на удаление соседних генов ctxA и ctxB. Вместе они кодируют основной фактор вирулентности V. вибрион, холерный токсин. Мы разработали олигонуклеотидов для метода TransFLP, как описано выше, и в соответствии с рисунком 3. Родительского штамма, промежуточные деформации несущих FRT-окружении антибиотиков кассеты сопротивление на оригинальные локус ДНК ctxAB и окончательной деформации удален за ctxAB и освободил сопротивления кассеты были проверены на их генотипа (рис. 4). Методом выбора было целых клеток ПЦР. Мы использовали праймеры, которые не отжигать на преобразовании ПЦР-фрагмент, но только в хромосомной ДНК (рис. 3). Это позволило нам проверить сайт-специфического обмена ПЦР-фрагмента с гомологичной области хромосомы (Figure 4А). ПЦР фрагменты были отделены от стандартных электрофореза в агарозном геле для определения их размеров (рис. 4В). Эта стратегия может быть использована для проверки деформации промежуточных и подтвердить конечной конструкции штамм (ы).
Для второго примера, удаление весь остров геномной, мы выбрали Vibrio островка патогенности 1 (VPI-1) в качестве целевого 13. Стандартная процедура TransFLP описано выше была неудачной в этом случае. Было известно из предыдущих исследований, что такой большой области ДНК может быть заменен аналогичным размером области ДНК с использованием хитин-индуцированной естественное преобразование 9. Поэтому мы предположили, что размер разницы между регионом-к-быть-удалена и довольно короткие преобразования ПЦР-фрагмент (<3,5 Кб) может быть ограничивающим фактором. Поэтому мы решили использовать метод TransFLP в два этапа: сначала мы интегрированы APH гена (кан R) предшествовала одна FRT сайте в начале VPI-1 (показано на рисунке 5А). Затем мы провели второй раунд естественное преобразование, которое позволило нам вставить дополнительные кассеты сопротивления антибиотикам (GM R, присвоении гентамицин сопротивления) последовала вторая сайте FRT в конце островка патогенности (рис. 5). Соответствующее двойное устойчивый штамм был электропорации для вставки плазмиды PBR-ФЛП и метод TransFLP была продолжена как описано выше. В результате штамм не хватало всего VPI-1, как проверить с помощью ПЦР очищенной геномной ДНК (рис. 5В).
В третьем примере мы интегрированы полимеразы T7-зависимой РНК-последовательность промотора перед геном интересов, в нашем случае гена, кодирующего основным регулятором естественной трансформации tfoX 6. Это было сделано с помощью TransFLP метод с небольшими изменениями от стандартного протокола: мы включили в Т7 РНК-зависимой рromoter консенсусной последовательности в соответствии с Ref. 14, как свесы в олигонуклеотидов № 4 и № 5. С этой стратегии зависит от полимеразы Т7 РНК последовательности промотора была сохранена на хромосоме даже после антибиотиков кассеты сопротивление, вырезали (рис. 6). Мы интегрировали в конструкцию V. вибрион штамм ADVCH-T7POL, которые таит в себе РНК-полимеразы Т7 гена обусловлена lacUV5 промотора (Blokesch, не опубликовано). Чтобы проверить функциональность конструкции, а именно T7 РНК-полимеразы зависит от выражения tfoX, мы провели анализы природных преобразований в LB среде. Родительского штамма, естественно, не трансформируемая в этих условиях в связи с отсутствием tfoX транскрипции в богатой среде и в отсутствие своего природного хитина индуктора (рис. 6). Этот фенотип не зависит от того, РНК-полимеразы Т7 был искусственно индуцированных IPTG или нет (рис. 6, дорожки 1 и 2, respectively). Тем не менее, TransFLP генерируемых штамм ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, в котором содержится T7 РНК-полимеразы зависит от промоутера на входе в компетенцию гена tfoX, действительно естественно трансформируемые в обогащенной среде (рис. 6, полосы 3 и 4) . В связи с утечкой lacUV5 промоутер в среде LB 15, производится T7 РНК-полимеразы уже переписана tfoX от T7 РНК-полимеразы зависит от промоутера без индукции. Это положило начало природного компетенции и преобразования подтверждающие функциональность встроенного T7 РНК-полимераза-зависимого промотора (рис. 6, дорожка 3). Этот фенотип был существенно усовершенствованы с помощью полной индукции РНК-полимеразы Т7 за счет добавления индуктора lacUV5 промоутер, IPTG (рис. 6, дорожка 4).
Рисунок 1.Схема метода TransFLP. Эти шесть пунктов, описанных в данном протокол составляется.. 1) Получение хитина хлопьев, 2) Дополнительно: Искусственная трансформация В. вибрион с Flp рекомбиназой кодирования плазмиды;. 3) олигонуклеотидов дизайн и полимеразной цепной реакции;. 4) хитин-индуцированной естественное преобразование; 5) Удаление избирательный кассету (ы) FLP-рекомбинации... 6) плазмиды отверждения нажмите здесь чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Схематическое изображение из трех возможностей применения метода TransFLP. I) 1458 п.н. фрагмента ДНК, содержащего токсин холеры генов, кодирующих ctxA и ctxB, был удален, как показано Δ. II) ~ 40 кб Vibrio островка патогенности 1 (VPI-1, 13)был исключен из штамма дикого типа. III)-полимеразы Т7 РНК-зависимой последовательности промотора (28 б.п.) был интегрирован перед геном tfoX. Красный прямоугольник указывает слева за короткие нуклеотидные последовательности в одном месте FRT 10. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Объяснение для дизайна праймеров и выполнение ПЦР основан на удалении ctxAB. Группа A: Для 1-го раунда ПЦР геномной ДНК (гДНК) и плазмиды pROD17 12 и СКД-FRT-Кан-FRT, соответственно, служил в качестве шаблонов. Необходимые олигонуклеотиды № 1 до № 6. Грунтовка # 2 / # 3 и # 4 / # 5 (например, в вставке) также должны обладать значительной мере совпадают друг с другом по их 5'ends. Группа B: После 2-го тураПЦР, которая основана на 1-й раунд ПЦР-фрагментов в качестве шаблонов, длинного фрагмента должны быть получены с использованием пары праймеров # 1 + # 6. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Ожидаемый результат примером для стратегии удаления ctxAB. Исходного штамма (дикий тип), инсерционного мутант Δ ctxAB :: FRT-Кан-FRT, а окончательный деформации Δ ctxAB :: FRT были испытаны на их генотипов. Группа: Схематическое представление дифференциации власть пары праймеров CTX-CHK-и CTX-CHK-вниз, особенно по отношению к удалению антибиотиков кассеты. Группа B: Всего бактериальные клетки использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. Чтобы проверить, изменилось локус ДНК праймеров CHK-и CHK-вниз были использованы. Усиленный ПЦР фрагменты были отделены с помощью электрофореза в агарозном геле и визуализировали с использованием SYBR безопасной ДНК пятна. Полоса 1: дикого типа В. вибрион штамм; дорожка 2: деформация Δ ctxAB :: FRT-Кан-FRT; дорожка 3: Δ ctxAB :: FRT. Ожидаемый размер ПЦР-фрагмент в соответствии с панели отображаются справа. L, 1kb лестнице (Invitrogen). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Стратегии для проверки удаления геномной острова. Группа: Схема Vibrio островка патогенности 1 (VPI-1) (свободно адаптированы из работы 16; не в масштабе.). Для штамма дикого типа интересующей нас области не является усиливаемых с помощью стандартных ПЦР и VPI-1-специфических праймеров CHK-и CHK-вниз (~ 40 кб). Поэтому дополнительныеотжига олигонуклеотидов в регионе к-быть-удален был применен (VC0817-обратно) вместе с VPI-CHK-вверх. Группа B: Представитель результате использования геномной ДНК соответствующих штаммов в качестве матрицы и пары праймеров указано выше каждого изображения. Штаммов: дикого типа В. вибрион штамм (полоса 1), процедить VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (дорожка 2), и ΔVPI-1 :: FRT (дорожка 3). Размеры фрагментов ПЦР, как предсказано в панели отображаются справа. L, 1kb лестнице (Invitrogen). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Представитель фенотипа после введения искусственных последовательностей промотора. Полимеразы T7-зависимой РНК-последовательность промотора была интегрирована перед компетенции нормативные tfoX гена с использованием TransFLP метоD (рисунок выше график). Родительского V. вибрион штамм (ADVCH-T7POL) содержит РНК-полимеразы Т7 гена обусловлена lacUV5 промоутер. График: родительский штамм ADVCH-T7POL (линии 1 и 2) и штамм манипулировать TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT; полосы 3 и 4) были протестированы на природный трансформируемость в отсутствие (дорожки 1 и 3 ) или в присутствии 1 мМ IPTG (дорожки 2 и 4). Преобразование геномной ДНК была получена из штамма A1552-LacZ-Кан 8. Преобразование частоты приведены на Y-оси. <Дл, ниже предела обнаружения ~ 5 х 10 -8. ** P <0,01 (как определено критерия Стьюдента лог-преобразованных данных). Черная стрелка с "T7" текста:. T7 РНК-полимеразы зависит от промотора Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод TransFLP описано выше, и в других местах 5 была широко используется в нашей лаборатории. Такого рода генетических манипуляций, которые возможно включать, среди прочего: удаление отдельных генов и генных кластеров, удаление геномной островах (например, VPI-1), вставки последовательностей перед интерес гена (например, промоутер последовательности) и вставки последовательностей в конце конкретного гена (например, теги кодирования сродство).
Импорт предпосылкой для TransFLP в том, что соответствующие V. вибрион штамм естественно трансформируемые. Иногда это не так, особенно в изолятов, полученных от больных холерой. Такие штаммы часто мутировал в пределах например кворума схему, в рамках ген, кодирующий основной регулятор кворума, HapR 17. Предоставление обратно копию hapR восстанавливает естественный трансформируемость в эти штаммы 6, exempliFied для HapR дефектной штамма N16961 18.
Возможные изменения могут быть включены, например, обогащение бактерий после естественное преобразование 8 в случае частота слишком низкая. Пожалуйста, обратите внимание, что преобразование частоты в целом ниже, в случае PBR-ФЛП плазмиды уже присутствует при этом хитин-индуцированной природных анализ трансформации. Скорее всего это вызвано частичной утечки чувствительных к температуре экспрессии гена ФЛП от PBR-ФЛП, что приведет к преждевременному удалению антибиотиков кассеты сопротивление и невозможность выбрать для этих трансформантов. Поэтому мы рекомендуем для критических случаев, чтобы вставить PBR-ФЛП плазмиды после того, как естественный шаг преобразований.
Другим важным шагом является 2-й раунд ПЦР, которая будет сочетать в себе три 1-й раунд ПЦР-фрагментов. Это может произойти, что частичные фрагменты присутствуют после ПЦР причинамие (например, частичная сборка только фрагменты «вверх» и «FRT-Кан-FRT» в соответствии с рисунком 1). Это ничтожно мало, как двойной гомологичной рекомбинации с целевым хромосомной области не может происходить в этой ситуации. Как только трансформанты укрывательство антибиотиков кассеты сопротивления выбранных для всех других трансформантов с неправительственными организациями, желаемый обмен ДНК исключены.
Еще один момент, чтобы иметь в виду, по отношению к повторение процедуры в течение нескольких раундов. Мы уже успешно сочетаются удаления кластера генов ctxAB с исключением островка патогенности (VPI-1) и другой кластер генов вирулентности (Blokesch, не опубликовано). Кроме того, мы эффективно интегрировать T7 РНК-полимеразы зависит от промоутера в рамках этих штаммов (вверх по течению tfoX и др.). Тем не менее, предусмотренные генотипом должны быть постоянно проверяется на всех промежуточных деформаций (например, ПЦР колоний, как гemonstrated в рис. 4). Это поможет исключить нежелательное Flp-опосредованной рекомбинации слева за FRT шрамы (показано красным прямоугольником на всех рисунках) друг с другом, в то время как PBR-ФЛП плазмиды по-прежнему присутствуют в бактериях. Это, вероятно, может не учитываться для отдаленно расположенных генов, а вероятность того, что удаление в период между регион был бы смертельным из-за удаления основных генов очень велико.
Наконец, мы хотели бы обсудить удаление генов в оперонов. Мы не можем исключать, что удаление гена вверх по течению, которое оставляет шрам FRT позади, может привести к изменению экспрессии генов вниз по течению (ы). Для того, чтобы этот эффект не вызывает наблюдаемый фенотип, но что это действительно вызвано удаления, дополнения анализа рекомендуется. Другой элемент управления, который мы уже успешно используется в лаборатории интеграции FRT вниз по течению шрам гена интересов, withouт удаления последнего. Мы не наблюдали подобных проблем в нашей лаборатории, но пока не может исключить их существование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Я хотел бы отметить Ольга Силва де Соуза для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Швейцарского национального научного фонда (SNSF) Грант 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
