The Tail Suspension Test

Summary

Halen-oppheng testen er validert som en eksperimentell prosedyre å vurdere antidepressiv effekt av medikamentell behandling hos mus. Mus er suspendert av halene i seks minutter og rømme-relaterte atferd vurderes. Vi beskriver prosedyrer som brukes i å gjennomføre halen suspensjon test.

Abstract

Halen-oppheng test er en mus atferdsdata test nyttig i screening av potensielle antidepressiva, og vurdering av andre manipulasjoner som forventes å påvirke depresjon relatert atferd. Mus er suspendert av halene med tape i en slik posisjon at den ikke kan rømme eller holde på nærliggende overflater. Under denne testen, vanligvis seks minutter i varighet, er den resulterende unnslippe orientert atferd tallfestet. Halen-oppheng test er et verdifullt verktøy i medisiner for high-throughput screening av potensielle antidepressiva forbindelser. Her beskriver vi detaljene som kreves for gjennomføring av denne testen med ekstra vekt på potensielle problemer som kan oppstå og hvordan unngå dem. Vi tilbyr også en løsning til halen klatring oppførsel, et vanlig problem som gjør denne testen ubrukelig i noen mus stammer, som brukte C57BL / 6. Spesifikt, hindrer vi hale klatring atferd ved å passere musa haler gjennom et lite plastsylinder før suspensjon. Til slutt, vi detalj hvordan du manuelt score atferd som er manifestert i denne testen.

Protocol

1. Materialer

1. Suspensjon Box

Halen-oppheng test (TST) innebærer å utsette mus over bakken av halene. På det mest grunnleggende nivået, krever prosedyren bare en suspensjon bar eller hylle avsatsen, og tape. Imidlertid bør eksperimentator vurdere bruken av en bakgrunn som gir optimal kontrast. I tillegg er det klokt å ta skritt for å hindre mus fra å observere andre dyr som blir testet. I vårt laboratorium, bruker vi spesielt produsert halen suspensjon bokser (Four-timers dag, Baltimore MD), laget av plast med dimensjonene (55 høyde x 60 bredde x 11,5 cm dybde). For å hindre dyr fra å observere eller i samspill med hverandre, er hver mus suspendert innenfor sitt eget tre vegger rektangulært rom (55 høyde x 15 bredde x 11,5 cm dybde). Musen er suspendert i midten av dette rommet, og bredden og dybden er tilstrekkelig størrelse slik at musen ikke kan gjøre contact med veggene. I denne innstillingen, er den omtrentlige avstanden mellom musens nesen og apparater gulvet 20-25 cm. Det er fire slike identiske avdelinger i apparatet tillater oss å teste fire mus gangen. En aluminium suspensjon bar (1 cm. Høyde x 1 cm. Bredde x 60 cm. Lengde), som brukes til å suspendere halen på hver mus, er plassert på toppen av boksen. Dimensjonene som vi bruker i vårt laboratorium bør betraktes som en generell referanse. For eksempel kan størrelsen på de enkelte avdelinger av halen-oppheng boks økes hvis en stor outbred mus belastning (for eksempel CD-1) blir brukt.

Nederst i hver kupé plasserer vi en avtakbar aluminium brett som samler avføring eller urin fra dyra. Vi bruker en mørk grå boksen for albino dyr og en krem ​​farget boks for mus av andre pelsen farger. Denne ordningen gir oss bedre kontrast og dermed mer pålitelig atferdsmessige scoring av testen.

2. Tape

3. Timer

Fire. Videoopptaksenhet

Et videokamera og et stativ (eller annen støtte struktur) er nødvendig. Siden denne testen vanligvis innebærer flere dyr blir testet på samme tid, vil leve scoring være vanskelig og anbefales ikke. Videokameraet bør rekord i hiGH nok oppløsning til å gjengi en bildekvalitet som skal brukes senere for behavioral scoring. Kontroller alltid at det er tilstrekkelig opptak minne i kameraet før du starter testen. Vi bruker et videokamera som tar opp digitalt uten bruk av fysiske medier (dvs. videokassett), noe som åpner for enkel overføring av videoer.

5. Hvit støy generator

Støyen generator bør maske intermitterende miljømessige lyder. Bruken av en støy generator er spesielt anbefalt i laboratorium miljøer der plutselige høye lyder kan høres som ville potensielt skremme mus. I vår eksperimentelle rom omgivelsesstøyen nivå (uten hvit støy generator aktivert) er rundt 60 dB. Den totale lydnivået med hvit støy generator aktiveres ved stedet der TST er gjennomført er 70-72 dB. Imidlertid bør det bemerkes at disse tallene er gitt som eksempel bare, og hvert laboratorium bør velgehøyre støynivå i henhold til deres unike miljø og omstendigheter.

Seks. Rengjøring forsyninger

Suspensjonen boksen skal tørkes grundig etter hver økt med en sterilisering løsning (f.eks MB-10, QUIP Laboratories Inc., Wilmington, DE, eller lignende).

7. Climbstoppers (ekstrautstyr: avhengig stamme)

Mus av noen bakgrunner, som C57BL / 6, kan klatre halene under test ^1. Clear hule sylindre (4 cm lang, 1,6 cm utvendig diameter, 1,3 cm innvendig diameter, 1,5 gram) som er kuttet til fire cm lengde (ved FourHourDay Inc, Baltimore MD) fra polykarbonat tubing (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) er plassert rundt halen av mus for å hindre slike halen klatring oppførsel ^2,3. Disse enhetene kan gjøres i hvilken som helst laboratorium med felles verktøy og materialer.

2. Behavioral Prosedyrer

1. Plasser kameraet i posisjon. Kameraet bør være så nært som mulig for å oppnå høyest mulig oppløsning av dyrene.
2. Tape fragmenter som vil bli brukt under økten bør kuttes, merket og klargjort for økten.
3. Start hvit støy generator, hvis det blir brukt, før musene blir introdusert til testing rommet. Nivået på hvit støy bør bare være nok til å maskere eksterne lyder. Unngå høyt volum og sørg for samme nivå av hvit støy benyttes for alle dyr.
4. Bringe enimals inn i testing rommet. Dersom rommet hvor dyrene bor og testing rommet er ved siden av hverandre med tilsvarende forholdene, kan ingen akklimatisering periode være nødvendig. Ellers plasserer dyrene i testing rom for en periode på akklimatisering (vanligvis minst en time). Vær oppmerksom på at de andre dyrene plassert i samme rom kan føle olfactory og ultralyd pekepinner.
5. Hvis en belastning kjent for å klatre halene, som C57BL6 / J, blir brukt plass Climbstoppers rundt halene før påføring av tape.
6. Følge båndet til haler av mus. Bruk den markerte slutten på tape og sørg tapen holder seg til halen og tilbake på seg selv. Tapen skal brukes til helt på slutten av halen med 2-3 millimeter av halen igjen utenfor tapen.
7. Etter hvert stykke tape er festet til en mus hale pinne midt delen av tapen til den indre veggene i buret. Dette vil bidra til å forhindre floker av tape stykker til hverandre. Merk at confinement på denne måten kan føre til stress og at det er viktig å fullføre søknadsprosessen tapen til hvert dyr så snart som mulig.
8. Når alle tape er brukt, starter innspillingen og identifisere økten før mus er suspendert.
9. Suspend dyrene ved å plassere den frie enden av båndet på suspensjon baren eller hylle i en rekkefølge som er motvektstruck mellom behandlingsgruppene. Suspendere mus på en måte som ikke hindrer kameravisningen fordi hele TST økten vil bli scoret og hindrer kameraet vil føre til manglende evne til å vurdere atferd i løpet av den tiden. Sjekk at alle tape endene henger parallelt med suspensjon baren eller hylle med en lignende lengde slakk for hver mus.
10. På slutten av økten (som er typisk seks minutter), retur dyrene til homecage deres og forsiktig fjerne tapen fra hver hale ved å forsiktig dra den av. Ikke rippe tapen fra halen da dette kan forårsake smerte til mice.
11. Etter hjemkomsten musene til deres koloni rom forkaste fecal Boli og urin fra samlingen skuffer og tørk av apparatet med en sterilisering løsning.

3. Behavior Analysis

1. Generelt er TST fra start til slutt seks minutter i lengde. I motsetning til en annen mye brukt antidepressiv effekt prosedyre, tvunget svømme test, er hele økten scoret. Dette skyldes den generelle finne at mus har en tendens til å manifestere immobilitet tidligere i TST.
2. I vårt laboratorium opplasting vi videofiler direkte fra kameraet til en PC hvor analysen er utført.
3. Under atferdsanalyse den tid hver mus bruker som mobil er målt. Selv om det er mulig å måle immobilitet tid direkte, har vi funnet det lettere å oppdage og måle aktive bevegelser snarere enn mangel på slike bevegelser.
4. Det viktigste aspektet ved TST atferdsanalyse er konsistent identifisering av bevegelses som er registrert som bona fide mobilitet. Mus, spesielt i begynnelsen av økten, utvist atferd som er åpenlyst unnslippe relatert. Disse inkluderer prøver å nå veggene i apparatet, og suspensjonen bar, sterk risting av kroppen, og bevegelse av lemmer meg til å kjøre. Disse bevegelsene tydelig utgjør mobilitet. Disse atferd deretter avta og bli mer presise. I vårt laboratorium små bevegelser som er begrenset til forbena, men uten involvering av bakbena regnes ikke som mobilitet. I tillegg svingninger og pendel som svinger som skyldes fremdriften fikk i løpet av tidligere mobilitet bouts heller ikke regnes som mobilitet.
5. I vårt laboratorium bruker vi på skjermen stoppeklokke programvare for tiden målinger (Xnote Stoppeklokke, dnSoft Research Group). To separate stoppeklokker benyttes på skjermen. Den første stoppeklokke teller ned fra 360 sekunder og varsler observatøren når atferdsanalyse perioden ender. Den andre stopwatch-kontrollert av observatør-måler tidsbruk mobil. Visse stoppeklokke programvare har evnen til å tildele tastene for å starte og stoppe funksjoner, slik at på-skjermen tastatur kan kontrollere stoppeklokken. I stedet for en vanlig tastatur, bruker vi en inndataenhet kjent som en "gamepad" for å kontrollere stoppeklokker.
6. Hvis det er mer enn én mus testet og presentere på skjermen er det en god idé å dekke andre dyr, slik at deres bevegelser ikke vil distrahere observatøren. Dette kan gjøres ved å bruke et annet program-vinduet, eller ved fysisk dekker andre mus på skjermen med papir.
7. Det kan være noen skjevhet som oppstår dersom den totale mengden av mobilitet tid gått for en spesiell mus er synlig før ferdigstillelse av analysen økten. Hvis en på skjermen stoppeklokke blir brukt, foreslår vi å dekke alle, men millisekund desimaler av stoppeklokken. Ved å dekke stoppeklokken observatøren vet bare om stoppeklokkenpå eller av på noe punkt, men kjenner ikke den totale tiden som er gått og kan derfor ikke bli påvirket av eventuelle skjevheter. Ved hjelp av denne tilnærmingen observatøren, mens blind for gruppeoppgaver av dyrene, ikke vil ha en generell idé om nivået av mobilitet i hvert dyr.
8. En interobserver pålitelighet test bør gjennomføres for hver ny observatør før du begynner å samle inn data fra forsøksdyr. I vårt laboratorium hver ny observatør klokker første en erfaren observatør mens han eller hun er scoring. Etter den nye observatørene få nok selvtillit til å skille mobilitet fra immobilitet, de da poengsum i sanntid med den erfarne observatør se og peke ut eventuelle feil. Når denne fasen er fullført, vil den nye observatører analysere et bestemt sett av TST videoer som vi opprettholder i vårt laboratorium for opplæringsformål. Først etter et høyt nivå av interobserver Korrelasjonen er oppnådd med den erfarne observatør ikke analysere en etterforsker TST videoer fra faktiskeeksperimenter. Vi arkivere data fra disse opplæring analyser for å utgjøre en intern standard for laboratoriet. Vi har observert forskjeller mellom stammer i måten de uttrykker mobilitet (og immobilitet) oppførsel, og mener immobilitet tid mellom kjønnene. Når en ny stamme, kjønn eller genmodifiserte mus modell er testet i laboratoriet er det nødvendig å igjen foreta denne typen pålitelighetsanalyse.

Fire. Representant Resultater

Vi har brukt TST å vurdere antidepressiv-lignende respons på litium behandling i ulike mus stammer (figur 1) ^3. Eksperimentelle detaljer om dette eksperimentet er publisert i Can et al., 2011 ^3.

Figur 1. Immobilitet gang i halen suspensjon testen etter kronisk litium administrasjon i fem innavlede mus stammer. Mus ble gruppen husetd, fire mus per bur. Mus i litium behandlingen gruppen fikk litium chow inneholder 4 g / kg LiCl i tre uker. Kontroll dyr mottatt identiske mat uten lithium klorid. **: P <0,01, ***: p <0,001 betegne en betydelig, uparet t-test. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. n :10-12 dyr per gruppe for hver stamme. (Figur gjengitt fra ^3).

I dette eksemplet er en signifikant behandlingseffekt av kronisk litium levert i mat observert bare i C57BL/6J og DBA/2J stammer. I de tre andre stammer, var det ingen statistisk signifikant reduksjon i immobilitet tid observert. Disse dataene indikerer at en antidepressiv-lignende respons på kronisk litium behandling belastning avhengig som har også blitt observert med andre antidepressive medisiner ^4-8.

Discussion

Utvikling av TST ved Steru et al. ⁹ ble påvirket av tidligere utviklet tvunget svømme test ^10-12. I likhet med tvungen svømme test, i TST mus er plassert i en uunngåelig, men moderat stressende situasjon. Mangel på flukt atferd anses immobilitet. I likhet med tvang svømme test, er TST en test beste validert for evaluering av antidepressive effekten av narkotika, men også brukt til å evaluere effekten av miljømessige, nevrobiologisk og genetisk manipulering ^13-18. I motsetning til tvungen svømme test, i TST er det ingen fare for nedkjøling på grunn av nedsenking i vann ^19. De forskere bør huske på at mens tvang svømme test og TST er like prima facie, er det ulike viktige forskjeller i deres følsomhet og ytelse og resultatene av en test ikke nødvendigvis bli replikert i den andre. For en utmerket beskrivelse av forskjellene between disse to testene se følgende referanser ^4,20,21. Selv om de fleste antidepressiva ta uker å utøve klinisk signifikante effekter hos pasienter, kan antidepressiva utøve sine effekter i TST og tvunget svømme teste både etter akutt og kronisk behandlinger ^20,22,23. Men det er mange andre atferdsmessige tester brukes til å vurdere antidepressiv-lignende effekter i mus som er generelt følsomme for kronisk behandling bare. Disse inkluderer kronisk uforutsigbar belastning ^24, sosiale nederlag stresset ^25, og nyheten undertrykt fôring ^26.

I tillegg til sin lille størrelse, lave kostnader og relativt enkelt oppsett, er automatisering av datainnsamling i TST også mulig ^9,27,28. To hovedtilnærminger for automatisering er elektro-mekanisk målesystemer og videoanalyse. I elektro-mekanisk tilnærming, er dyret henger fra en belastning gauge og bevegelser av dyrene er målt (f.eks Med Associates Inc, St. Albans, VT, Harvard Apparatus, Holliston, MA). En annen tilnærming er software-basert analyse av TST videoopptak (f.eks Noldus Inc., Nederland, Cleversys Inc., Reston, VA). Men selv med automatisering, vil menneskelige inngrep fortsatt være nødvendig, siden den anvendte parametrene må justeres for hver ny mus modell eller belastning, og resultater skal verifiseres av en menneskelig observatør for kvalitetskontroll.

Et vedvarende problem som fortjener spesiell oppmerksomhet med TST er halen-klatring oppførsel av noen mus, spesielt brukte C57BL / 6 belastning ^1,20. Disse dyrene har en tilbøyelighet mot å nå for og klatring sin egen hale. Mus som vellykket klatrer halene har lært at rømning er mulig. Slike mus bør derfor ekskludert fra analysen, noe som øker antallet mus som kreves og reduserer påliteligheten av prosedyren. At C57BL / 6 musen belastningen er den mest common belastning brukes i nevrobiologisk og genetisk forskning forverrer påvirkning av dette problemet. I denne artikkelen, detaljerte vi en løsning til tail-klatring oppførsel som ble utviklet i vårt laboratorium ^2,3. For å hindre at halen-klatring atferd, legger vi hule sylindere rundt haleroten av mus. Musene kan ikke holde på disse sylinderne og kan derfor ikke klatre halene. Vi har observert at ingen mus har klatret halene når du bruker denne tilnærmingen ^2,3. I tillegg har vi vist at antidepressiva-lignende effekter av litium, rapporterte tidligere i TST uten disse typer sylindere ^29, er fortsatt til stede når du bruker dem ^3.

Det bør bemerkes at TST er ikke anbefalt for tyngre gnagere som rotter, siden det er potensielt smertefulle for disse dyrene for å støtte sin vekt bare av halene. Av samme token, bør man vise forsiktighet med usedvanlig tung mus (f.eks mus brukes tilmodellering fedme), og i disse tilfellene forskere bør se etter alternative tester som tvang svømme test ¹⁰ Det bør holdes i bakhodet at noen manipulasjoner som kan påvirke det totale aktivitetsnivået kan potensielt endre mobilitet i TST som fører til falske konklusjoner. På grunn av dette, er det viktig å verifisere resultatene av TST med separate atferdsmessige tester som måler generelle aktiviteten i mus som åpen-field test ^30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tape
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Climbstoppers (optional; depending upon strain used)