Summary
Spatio-अस्थायी प्रकाश द्वारा छोटे GTPase गतिविधि के नियंत्रण के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है. इस विधि rapamycin प्रेरित heterodimerization FKBP FRB और तस्वीर caging प्रणाली पर आधारित है. प्रकाश विकिरण के अनुकूलन स्तर subcellular पर छोटे GTPases spatio-अस्थायी नियंत्रित सक्रियण सक्षम बनाता है.
Abstract
महान spatiotemporal परिशुद्धता के साथ छोटे ग्वानोसिन triphosphatases के (GTPases) रो परिवार के गतिशील विनियमन विभिन्न सेलुलर कार्यों और घटनाओं 1, 2 के लिए आवश्यक है. उनके में गतिशील spatiotemporally प्रकृति उनकी गतिविधि और वास्तविक समय 3 में स्थानीयकरण का दृश्य द्वारा प्रगट किया गया है. आदेश में आण्विक स्तर पर विविध सेलुलर कार्यों में उनकी भूमिका की गहरी समझ हासिल करने के लिए, अगले कदम प्रोटीन गतिविधियों की गड़बड़ी एक सटीक subcellular स्थान और समय पर होना चाहिए.
(1) rapamycin प्रेरित heterodimerization FKBP FRB और (2) rapamycin के एक तस्वीर caging विधि: इस लक्ष्य को प्राप्त करने, हम प्रकाश प्रेरित, स्थानिक, अस्थायी दो तकनीकों के संयोजन से छोटे GTPases नियंत्रित सक्रियण के लिए एक विधि विकसित की है. Rapamycin की मध्यस्थता heterodimerization FKBP-FRB का उपयोग के साथ, हम तेजी से या छोटे GTPases includi के सक्रियण निष्क्रियता inducible के लिए एक विधि विकसित की हैएनजी 4 आरएसी, Cdc42, 4 4 RhoA और 5 रास, जिसमें rapamycin FKBP इनकार GTPases, या उनके activators का स्थानान्तरण लाती है जहां FRB लंगर प्लाज्मा झिल्ली,. इस heterodimerization प्रणाली के साथ युग्मन के लिए, हम भी rapamycin एनालॉग के एक तस्वीर caging प्रणाली विकसित किया है. एक मिश्रित तस्वीर कैद एक छोटा सा अणु जिसका गतिविधि है एक photocleavable रक्षा caging समूह के रूप में जाना जाता समूह के साथ दबा है. पूरी तरह से heterodimerization गतिविधि को दबाने के लिए, हम है कि एक ऐसी है कि जिसके परिणामस्वरूप बड़े जटिल प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं कर सकते macromolecule के लिए सीमित है एक बंदी rapamycin डिजाइन, 6 कोशिकाओं के अंदर एक रासायनिक dimerizer के रूप में वस्तुतः कोई पृष्ठभूमि गतिविधि के लिए प्रमुख चित्रा 1 हमारी योजना को दिखाता है. प्रणाली. इन दोनों प्रणालियों के संयोजन के साथ, हम स्थानीय स्तर पर सेकंड के एक timescale पर प्लाज्मा झिल्ली के लिए एक आरएसी उत्प्रेरक और भर्ती subcellular लेव पर प्रकाश प्रेरित आरएसी सक्रियण हासिल की6 एल.
Protocol
1. प्लास्मिड डीएनए का अभिकर्मक
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ 37.5 μl DH 2 ओ टैग: प्लाज्मिड DNAs, 0.5 μg झिल्ली सीमित FRB (इसके बाद LDR के रूप में संदर्भित) और 0.5 μg (आरएसी उत्प्रेरक टी कोशिका लिंफोमा आक्रमण और मेटास्टेसिस उत्प्रेरण 1 प्रोटीन) FKBP-Tiam1 के जोड़ें जोड़ें 1 μl एच.डी. FuGENE.
- भंवर और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इस बीच, 1.3-1.8 कदम के लिए आगे बढ़ना.
- 50 μl पाली-D-Lysine के साथ एक 8 अच्छी तरह से कक्ष की प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें.
- DH ओ 2 के साथ एक अच्छी तरह से धो केंद्र
- 80-85% संगामी NIH-3T3 कोशिकाओं Trypsinize और 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम (साथ DMEM 10% FBS) के लिए पतला.
- निलंबन के 375 μl निकालें और 3 मिनट के लिए 1750 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- मीडिया महाप्राण (व्यंजन), सावधान गोली को परेशान नहीं किया जा रहा है.
- DMEM / 10 डब्ल्यू% FBS और resuspend के 750 μl जोड़ें.
- इस DH 2 हे / डीएनए / FuGENE के HD समाधान के लिए सेल निलंबन जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- 250 में जोड़ेंसेल / डीएनए निलंबन की एक अच्छी तरह से μl (3 कुओं को भरने जाएगा).
- 37 में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 15-18 घंटे के लिए 5% सीओ 2.
2. CRB - एक समाधान की तैयारी
- Synthesize करने बंदी अभिवर्तन rapamycin बायोटिन (CRB). CRB की जानकारी के लिए सिंथेटिक योजना "देखें. संक्षेप में, caging और बायोटिन moieties अलग से तैयार कर रहे हैं. caging आधा भाग तो rapamycin (नियंत्रण रेखा प्रयोगशाला) संयुग्मित, उत्पाद बाद में क्लिक करें प्रतिक्रिया के लिए 7 CRB वहन के एक साधन के द्वारा बायोटिन आधा भाग करने के लिए युग्मित है.
- DMSO में 1 माइक्रोन CRB स्टॉक समाधान तैयार.
- एक 0.5 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूब में 250 पीबीएस की μl में 1mg avidin भंग.
- भंग avidin CRB स्टॉक समाधान की 1 μl जोड़ें. Inverting के कई बार के द्वारा मिश्रण.
- CRB - avidin संयुग्म (CRB एक उपज के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं) समाधान.
- अपार छोटे अणुओं अपवर्जित और शुद्ध CRB एक एक आकार अपवर्जन स्तंभ का उपयोग कर.
3. माइक्रोस्कोपी और Subcellular स्तर पर हल्की रोशनी
- सीरम FBS बिना DMEM में 12 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को भूखा.
- धीरे कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और तैयार 400 एनएम CRB एक समाधान (2.6 कदम से) के 250 μl जोड़ें.
- प्रकाश इलाज से पहले और बाद में subcellular संकल्प में जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता कल्पना, कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी (2a चित्रा) इस्तेमाल किया गया था. यूवी रोशनी महामारी प्रतिदीप्ति (चित्रा 2b) प्रकाश के साथ यूवी एलईडी प्रकाश (365 एनएम) के लिए प्रकाशिकी युग्मन द्वारा प्राप्त किया गया था.
- Metamorph सॉफ्टवेयर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों को हर 15 सेकंड पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- पराबैंगनी प्रकाश से उत्साहित फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेपित एक गिलास प्लेट का उपयोग करके और एक रोशनी स्थान के निर्देशांक आकार को परिभाषित करें. आकार कर सकते हैंविभिन्न magnifications के साथ उद्देश्य लेंस लगाने से और अलग मूल आकार के साथ ऑप्टिकल फाइबर का चयन करके विविध.
- कोशिकाओं की परिधि में झिल्ली ruffling, चमकाना यूवी प्रकाश की पृष्ठभूमि के स्तर का निर्धारण करने के बाद. निम्न दो चरणों के लिए स्थानीयकृत प्रभाव पूर्ववर्ती के विपरीत हैं.
- विश्व स्तर पर 365 एनएम पारा दीपक द्वारा प्रदान की प्रकाश के साथ कोशिकाओं को चमकाना.
- Uncaged भंग, DMSO में तो और पीबीएस (अंतिम 400 एनएम) में इस प्रकार मूल rapamycin, और इमेजिंग कक्ष समाधान के लिए वैश्विक प्रभाव उत्पन्न जोड़ें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि परिणाम का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है. एक सेलुलर किनारे के पास एक छोटे से क्षेत्र में यूवी प्रकाश विकिरण तेजी स्थानीयकृत का गठन प्रेरित और विकिरणित क्षेत्र के पास केवल झमेलें. की पुष्टि के लिए है कि यह वास्तव में स्थानीय गतिविधि थी, हम तो दुनिया भर में यूवी के साथ कोशिकाओं विकिरणित, या थोक मीडिया rapamycin जोड़ी, whi के दोनोंचर्चा झिल्ली भर में वैश्विक व्याकुल गठन प्रेरित किया. एक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, हम चार quadrants में लक्ष्य कोशिकाओं में विभाजित है, और प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग में स्थानीय पर व्याकुल गठन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण (चित्रा 4) सहित विभिन्न शर्तों के तहत वैश्विक उत्तेजना के बाद की आवृत्ति की गिनती. यह केवल यूवी विकिरण के इस संयोजन,, CRB एक, और उचित FKBP FRB constructs कि स्थानीय ruffling लाती है.
चित्रा 1 spatially सीमित प्रोटीन dimerization में बंदी rapamycin - avidin (CRB - ए) संयुग्म और यूवी प्रकाश का उपयोग कर के योजनाबद्ध. यूवी विकिरण rapamycin और बायोटिन के बीच linker cleaves, रासायनिक (महामहिम Rapa, C40-O (rapamycin 2 - hydroxyethyl)) dimerizer और अपने उत्पाद की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप. जारी dimerizer तो कोशिकाओं में diffuses और ब्याज की प्रोटीन FKBP POI के और प्लाज्मा memb के बीच dimerization लातीराणे विकिरणित क्षेत्र (नीले वृत्त) की निकटता में ही FRB लंगर. पराबैंगनी विकिरण के बिना, FKBP और FRB एसोसिएट (रेड क्रॉस), नहीं है इसलिए कोई प्रभाव नहीं है. (कॉपीराइट _AT_ ACS2011) 6
चित्रा 2 अनुकूलित confocal प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का चित्र. (क) confocal सूक्ष्मदर्शी के ललाट दृश्य (200 Axiovert, Zeiss उलटा). (ख) बंद, महामारी प्रतिदीप्ति और यूवी रोशनी के लिए एक युग्मन इकाई के शीर्ष दृश्य.
चित्रा 3. Spatially सीमित ट्रांसफ़ेक्ट NIH3T3 स्थानीयकृत यूवी विकिरण से प्रेरित सेल में व्याकुल गठन. है कि YFP टैग (आरएसी उत्प्रेरक) FKBP-Tiam1 और LDR (FRB झिल्ली लंगर) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है एक NIH3T3 तंतुप्रसू सेल की confocal प्रतिदीप्ति छवियों अपने किनारे के पास एल के साथ एक सीमित क्षेत्र में विकिरण लिया15 सेकंड थोक मीडिया में CRB - एक संयुग्म की उपस्थिति में 210 सेकंड में शुरू करने के लिए 365 एनएम पर प्रवर्तन निदेशालय प्रकाश. इस उपचार 1063 rapamycin अंतिम 400 एनएम के 1560 सेकंड में सेकंड और वैश्विक इसके अलावा में 1 सेकंड के लिए पारा दीपक के साथ वैश्विक रोशनी द्वारा पीछा किया गया था. सेल शुरुआत (क) में लगभग कोई ruffling गतिविधि से पता चला है लेकिन पता चला है spatially स्थानीयकृत रोशनी के बाद ruffling सीमित (पीला सर्कल) (ख). सेल वैश्विक रोशनी और rapamycin (सीडी) के अलावा के बाद वैश्विक व्याकुल गठन से पता चला है, यह दर्शाता है कि स्थानीय व्याकुल गठन आरएसी की spatially सीमित सक्रियण की वजह से किया गया था. स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन. (कॉपीराइट _AT_ ACS2011) 6
चित्रा 4 ट्रांसफ़ेक्ट NIH3T3 कोशिकाओं की quadrants में व्याकुल गठन की आवृत्ति. CRB एक और निम्नलिखित वैश्विक यूवी विकिरण 13 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया. CRB एक साथ स्थानीय यूवी विकिरण CRB एक साथ झालकर बनाना गठन दिखाया. हम कम पृष्ठभूमि व्याकुल गठन के साथ कोशिकाओं से डेटा एकत्र लेकिन जो rapamycin प्रेरित झालकर बनाना गठन है, जो हम rapamycin (अंतिम 400 एनएम) के अलावा एक परिणाम के रूप में वैश्विक व्याकुल गठन की पुष्टि करने के द्वारा एक प्रयोग के बाद जाँच की क्षमता थी. इन परिणामों से पता चला है कि CRB एक और स्थानीय यूवी विकिरण कोशिकाओं में स्थानीय व्याकुल गठन के लिए आवश्यक हैं. (कॉपीराइट _AT_ ACS2011) 6
लघुरूप:
FK506 बाध्यकारी प्रोटीन: FKBP
FKBP-rapamycin बाध्यकारी प्रोटीन: FRB
टी सेल लिंफोमा आक्रमण और मेटास्टेसिस उत्प्रेरण 1 प्रोटीन (आरएसी जीईएफ): tiam1
LDR: Lyn से DSAG linker के FRB (Lyn: एन टर्मिनल Lyn kinase के 11 अमीनो एसिड)
महामहिम Rapa: C40 - हे - (2 hydroxyethyl) rapamycin
बायोटिन आधा भाग के साथ बंदी rapamycin: CRB
CRB एक: CRB avidin संयुग्मित
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम एक तकनीक है कि एक बंदी परिसर उपन्यास रोजगार FRB heterodimerization FKBP प्रणाली के साथ एक साथ क्रम में करने के लिए सेकंड के एक समय के पैमाने पर एक सटीक subcellular स्थान पर रो GTPase गतिविधि में हेरफेर का वर्णन किया.
वर्तमान दृष्टिकोण के तीन सीमाएं हैं. सबसे पहले, क्योंकि विधि को रोकने या प्लाज्मा झिल्ली भर dimerizer के प्रसार की अनुमति पर आधारित है, लक्ष्य सेलुलर स्थान प्लाज्मा झिल्ली या उसके आसपास की जरूरत है. CRB की रासायनिक संरचना के आगे अनुकूलन परिसर प्रकाश विकिरण तक dimerization उत्प्रेरण के बिना कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए अनुमति दे सकता है. एक ऐसी dimerizer के साथ, हम सिद्धांत में कोशिकाओं के अंदर कहीं भी संकेतन अणुओं की गतिविधि में हेरफेर सकता है. दूसरे, रासायनिक dimerizers, FKBP FRB dimerization जटिल है, या सक्रिय अंतर्जात संकेतन अणुओं की आणविक प्रसार बहुत इरादा प्रभाव के सटीक कारावास को प्रभावित कर सकते हैं. यह प्रभाव विशेष रूप से स्पष्ट हैपर समय अंक और बाद में यूवी विकिरण (जैसे बीम चौड़ाई, ऊर्जा, और बीम मोड (निरंतर बनाम स्पंदित) के रूप में) और शामिल यौगिकों के प्रसार गुणांक के साथ जुड़े मानकों पर निर्भर है. इन मानकों के आगे अनुभवजन्य अनुकूलन संकेत गतिविधियों के और अधिक कठोर कारावास सक्षम बनाता है. तीसरा, एक यूवी प्रकाश कोशिकाओं को गैर तुच्छ phototoxicity दर्शाती है. इस समस्या को उन्नति के लिए एक आसान तरीका के लिए 405 एनएम के रूप में अब तरंगदैर्य का उपयोग करने के लिए nitrobenzyl caging समूहों को रिहा कर देना है. Uncaging के लिए दो photon रोशनी एक भी लंबे समय के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं की अत्यंत स्थानीयकृत क्षेत्र तरंगदैर्ध्य पर रोशनी की अनुमति देता है. हाल ही में, अन्य शोधकर्ताओं ने एक सुरुचिपूर्ण subcellular 8-11 प्रकाश के प्रति संवेदनशील संयंत्र प्रोटीन का उपयोग कर के स्थान पर आरएसी सक्रिय दृष्टिकोण की सूचना है. अब तक, केवल कुछ प्रोटीन के लिए अपने आवेदन सीमित है. अपनी रणनीति की तुलना में, हमारे वर्तमान तकनीक को और अधिक अनुकूलनीय आसानी से बिना लक्ष्य प्रोटीन की संख्या का विस्तार व्यापक और तीमुझे लेने को फिर से इंजीनियरिंग. हम और दूसरों को पहले से ही है कि प्लाज्मा झिल्ली 5, 6, 12-14 में विविध संकेतन अणुओं की गतिविधि में हेरफेर कर सकते हैं dimerization जांच की एक किस्म विकसित की है. Spatiotemporally गतिशील सेलुलर घटनाओं अब सीधे परीक्षण योग्य हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन NIH अनुसंधान के वित्तपोषण (DK090868 और GM092930 तिवारी) द्वारा समर्थित किया गया. वहाँ एक बंदी rapamycin के अनुरूप पर एक पेटेंट लंबित है.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T.
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
