Summary
Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.
Abstract
Drosophila melanogaster, a mosca da fruta, tem sido utilizada para estudar os mecanismos moleculares de uma ampla gama de doenças humanas, tais como o cancro, doença cardiovascular e várias doenças neurológicas 1. Nós otimizamos simples e robusto ensaios comportamentais para determinar a locomoção das larvas, a capacidade de escalar adulto (ensaio ANEL), e os comportamentos de corte de Drosophila. Estes ensaios comportamentais são amplamente aplicáveis para o estudo do papel dos fatores genéticos e ambientais sobre o comportamento da mosca. Capacidade de rastreamento das larvas pode ser confiavelmente utilizado para determinar alterações em início de carreira nas habilidades de rastreamento de larvas de Drosophila e também para examinar efeito de drogas ou de genes de doenças humanas (em moscas transgénicas) em sua locomoção. O ensaio de rastreamento larval torna-se mais aplicável se a expressão ou a supressão de um gene provoca letalidade nas fases de pupa ou adulto, como estas moscas não chegam à idade adulta, onde de outra forma poderia ser avaliado. Esta base umssay também pode ser utilizado em conjunto com luz brilhante ou stress para examinar respostas comportamentais adicionais em larvas de Drosophila. Comportamento de corte tem sido amplamente utilizada para investigar base genética do comportamento sexual, e também pode ser usado para examinar a actividade e coordenação, bem como a aprendizagem ea memória. Drosophila comportamento de corte envolve a troca de vários estímulos sensoriais incluindo visual, auditivo, e os sinais de quimio entre homens e mulheres que levam a uma série complexa de condutas motoras bem caracterizadas, culminando na cópula bem-sucedida. Ensaios adultos tradicionais de escalada (geotaxis negativos) são de trabalho, tedioso intensivo e demorado, com variação significativa entre os diferentes estudos 2-4. O rápido iterativo geotaxis negativos (ANEL) ensaio 5 tem muitas vantagens sobre os protocolos mais amplamente empregadas, oferecendo uma abordagem de transferência reproduzível, sensível e de alta para quantificar locomotor adulto e negativos geotaxis behaviors. No ensaio de RING, vários genótipos ou tratamentos de drogas podem ser testados simultaneamente utilizando grande número de animais, com a abordagem de alto rendimento tornando-o mais favorável para as experiências de rastreio.
Protocol
A. Ensaio Crawling larval
1. Coleta de larvas
- Configure uma garrafa de 8 onças de moscas machos (10-15 + de 10-15 fêmeas).
- Deixe moscas põem ovos para 24 horas, em seguida, garrafa transparente de moscas. (Transfira os adultos em um novo frasco e repetir se necessário).
- Incubar garrafa durante 3-4 dias, ou até larvas de terceiro estádio são visíveis.
- Adicionar 50 - 100 ml de sacarose a 20% para a garrafa com larvas e deixar assentar durante 20 minutos. As larvas irá flutuar para o topo.
- Coletar larvas utilizando uma pipeta de 25 ml sorológico com a ponta cortada, e coloque em uma cesta de malha.
- Lavar as larvas no cesto de malha duas vezes com desionizada H 2 O. As larvas são agora pronto para os experimentos.
2. Para tratar larvas com droga
- Usar uma escova para transportar o número desejado de larvas para um copo de 5 ml contendo uma solução de sacarose a 5% + droga.
- Deixe alimentam as larvas por pelo menos 15 minutos.
- Verter droga tratada com larvas para um cesto de malha e enxaguar. Eles estão agora prontos para usar.
3. Ensaio Locomotor (medição da distância total percorrida ou contrações da parede do corpo)
- Usar uma escova para o transporte de larva indivíduo a uma:
- 15 centímetros placa de Petri contendo agarose a 2% (previamente vertida e deixou-se endurecer) ao longo de papel de gráfico com uma grade de 0,2 cm 2.
- Contar o número de linhas de grade cruzados em 1 minuto.
- Poço de um prato de dissecção de vidro contendo uma solução diluída de pasta de levedura.
- Conte peristaltismo (contrações anterior completo para posterior movimento de contração = 1) em um minuto, observando sob um microscópio de dissecção.
- 15 centímetros placa de Petri contendo agarose a 2% (previamente vertida e deixou-se endurecer) ao longo de papel de gráfico com uma grade de 0,2 cm 2.
- Repita até que os números desejados de larvas foram contadas.
B. rápida iterativo geotaxis negativos (ANEL) Protocolo
Este ensaio foi originalmente anulaçõesdescrita por Gargano et al 5.
- Colete recém-emergidas moscas machos adultos sob luz anestesiados CO 2 e coloque em um alimento frasco contendo padrão (ou alimento droga +).
- Manter as moscas à temperatura ambiente (no topo de bancada. ~ 22 ° C) durante 2-3 dias para permitir a recuperação a partir de CO 2 (e acumulação de níveis de estado estacionário droga se for caso disso).
- Transferir cerca de 25 moscas sem anestesia para frascos de poliestireno preparados.
- Montar frascos com moscas dentro do aparelho ANEL (Figura 1).
- Permitir que as moscas se aclimatar ao ambiente, tranquilo, por 15-20 minutos.
- Durante este tempo câmara lugar ~ digital 1 m em frente do aparelho (em uma plataforma, se necessário, para alinhar o centro da lente a meia-altura do frascos), concentrar e ampliar a câmara para o aparelho, e definir um temporizador para 3,0 segundos.
- Com cuidado, tomar posse do aparelho ANEL com a mão esquerda para não disturb as moscas, e mantenha o timer com sua mão direita.
- Acentuadamente toque no aparelho para baixo sobre a superfície da bancada três vezes, assegurando que a torneira é bastante difícil de abater todas as moscas para a parte inferior dos frascos.
- Simultaneamente com a realização do terceiro toque, iniciar a contagem regressiva de 3 segundos.
- Em três segundos tirar uma foto.
- Redefinir o temporizador para 1 minuto e começar. Durante este tempo, redefinir a câmera eo foco sobre o aparelho, e um outro canal do temporizador para três segundos.
- Após 1 minuto, repita os passos 1,7-1,10
- Após um total de 5-6 ensaios, fazer upload de imagens para um computador e usar o seu visualizador de imagens favorito abrir e marcar a altura média subiu para cada frasco.
- Realização de análise estatística em seus diferentes grupos, comparando a altura média subiu.
C. Corte e Ensaio Mating
- A primeira coisa de manhã, bem claras produtoras de garrafas de flies a ser usado.
- Durante o curso do dia (cada 3-4 horas), recolher recém-emergidas machos sexualmente ingénuos e fêmeas:
- Coloque machos individualmente em frascos ou tubos com meio.
- Coloque 5-6 fêmeas em conjunto por frasco / tubo.
- Isolar moscas recolhidos a 25 ° C sob 12 hr luz / escuro durante 5 dias.
- Transferir uma fêmea para a câmara de uma roda de acasalamento.
- Transferir um macho para dentro da câmara de uma roda de acasalamento.
- Observe par sob um microscópio de dissecção para os seguintes comportamentos:
- Orientação (os orienta masculina para a mulher)
- Tapping (o macho bate o sexo feminino)
- Música Wing (o macho estende e vibra uma asa)
- Lamber (os licks do sexo masculino a genitália feminina)
- Curling (o macho enrola seu abdômen debaixo de si mesmo)
- Tentativa de cópula (Curling atividade ao tentar montar a fêmea)
- Observar durante 10 minutos ou até que a cópula bem sucedida, observando o tempo em que cada comportamento ocorre (latência), o tempo total envolvida em comportamento de corte até cópula (para calcular o índice de corte), bem como o número de pares que realizar com sucesso um determinado comportamento ( freqüência). 100% dos pares de tipo selvagem, em geral acasalar dentro de 5 minutos.
- Calcular um índice de corte (IC) é calculada dividindo o tempo gasto no corte dividida pelo tempo total de até cópula. Para pares de tipo selvagem isso geralmente varia entre 0,6-0,8.
D. Representante Resultados
Rastejando ensaio
Larva tipo normal selvagem vai passear a 3 centímetros por minuto, e exibem 40-50 ~ de contrações da parede do corpo em um minuto. Recentemente, desenvolvemos um modelo de Drosophila FUS / TLS relacionada com esclerose lateral amiotrófica, que mostra defeito rastejando larval, tempo de vida reduzido e adultos escalada deficiência 6. Visamos a expressão of tipo selvagem e formas mutantes de FUS / TLS para os neurônios motores (OK-371-gal4 motorista) e realizou um ensaio de rastreamento larval. Como mostrado abaixo, as larvas do tipo selvagem rastrear até 12 cm, enquanto que a expressão de FUS tipo selvagem diminuiu a capacidade de larvas de rastreamento a cerca de 6 cm. Animais que expressam o R521C mutação ALS-causando em FUS / TLS demonstram uma deterioração muito grave no seu movimento de rastreamento (Figura 1), arrastando apenas cerca de 1 cm / minuto.
Ensaio ANEL negativo geotaxis
Jovens moscas do tipo selvagem adultos deve ter uma altura média de escalada de ~ 4-5 cm de um período de tempo de 3 segundos (o tempo pode ser ajustado de 3 segundos para acomodar diferentes estirpes ou os níveis de actividade para definir uma altura média dada para uma dada tensão / tratamento). Moscas que permanecem na parte inferior é atribuído um valor de 0. Não é aconselhável a utilização de mais de 25 moscas por frasco porque, em seguida, torna-se difícil determinar a localização de cada indivíduo mosca para medir a altura. Ndessensibilização o tem sido observada em até os 6 ensaios consecutivos espaçados 1 minuto para além de que têm empregado. É crítico para NÃO reutilizar os frascos de polistireno de teste neste ensaio, após os conjuntos de dados iniciais são recolhidas porque as moscas novos colocados em frascos utilizados não irá subir para a mesma extensão como em frascos frescos.
Figura 1. Configuração para o Ensaio RING. A câmera digital é colocado ~ m 1 na frente do aparelho contendo moscas nos frascos de poliestireno, foco e zoom da câmera para o aparelho e definir um temporizador para 3,0 segundos.
Dados Figura 2. Representativos do ensaio rastejar larval usando moscas ectopicamente expressando UAS-FUS WT, e UAS-FUS R521C sob o controlo de um controlador de neurónio motor (OK371-gal4).
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Discussion
Comportamento Drosophila é estreitamente regulada por fatores genéticos e ambientais. Nós, e outros, já utilizado nos ensaios aqui descritos para coletar dados para analisar genes relacionados a comportamentos e voar para humanos doenças neurodegenerativas modelados em Drosophila 5-19. Para o ensaio de rastreamento, seleção criteriosa de 3 º ínstar é um passo crítico. Se o tratamento com um medicamento, levará 10-15 minutos (ou mais dependendo do tipo e da natureza da droga) para alcançar o efeito máximo se ele tem uma boa solubilidade. Portanto, rotineiramente alimentar voa a droga durante 15 minutos e, em seguida esperar um período adicional de 15 minutos antes do teste. É importante, no entanto, para manter as concentrações de droga em solução, e tempos de exposição, entre os grupos de tratamento, o mesmo para comparação precisa. SNC drogas ativas geralmente têm um efeito máximo duradoura ~ 45 minutos. As larvas devem ser bem lavado após selecção (ou cavada alimentação) para remover o alimento e moscapermitido aclimatizadas durante 1 minuto antes de iniciar o ensaio de indexação. A placa de ágar deve ser mantido à temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante uma hora, como a baixa temperatura pode influenciar a capacidade de rastreamento larval. Embora o ensaio de rastreamento larval pode fornecer informações importantes sobre os níveis de atividade, não é adequado para a análise dos défices de coordenação sutis. Portanto, como uma plataforma de triagem, é mais adequado para uma primeira passagem examinar déficits atividade bruta.
Um comportamento adulto que envolve a coordenação motora fina é a corte eo acasalamento. Este comportamento tem sido usado para examinar os aspectos de comportamentos relevantes para doenças humanas, e envolve o processamento sensorial (olfactivo, acústico, visual) em adição ao controle de motor fino 18. Quando um macho percebe uma fêmea, ele inicia o ritual de acasalamento, que evolui em um início padrão estereótipo com o comportamento de orientação (e virando-se para perseguir a fêmea). Isto é seguido por wingsong, licking e batendo da genitália feminina, curling do abdômen para a fêmea, e culmina com a cópula, que pode durar várias dezenas de minutos 20-22. Porque muitos dos aspectos do namoro envolver pistas visuais, as condições escuras levar a uma degradação do desempenho sexual, e os ensaios devem ser realizados com luz suficiente para que voa pode ver um ao outro. Assim, de olhos brancos moscas costumam ter um desempenho extremamente pobre em nosso ensaio descrito e os leitores são aconselhados a planejar experimentos utilizando-as com este protocolo. Se o tratamento das moscas com uma droga, colocar a droga para o meio de que as moscas são isolados em (por exemplo, 1% de agarose de sacarose + 10% + droga, em vez de comida padrão quando o tratamento com o fármaco a fim de evitar qualquer possível degradação da droga por microorganismos no alimentos). Geralmente as moscas são isolados em 5 ml tubos de ensaio que têm 300-500 ml de alimento nas mesmas, ligado com algodão. NÃO anestesiar as moscas para a transferência para a roda de acasalamento. É is absolutamente crítico para lavar a roda de acasalamento muito bem entre usa para remover quaisquer feromonas residuais (água quente com pequena quantidade de Alconox sabão durante a noite com agitação, em seguida, lavou-se por um mínimo de 48 horas em água desionizada com agitação, e numerosas mudanças de água) . Outra consideração quando da realização do ensaio que descrevemos é o tempo. Em moscas nossa experiência não vai cortejar se está chovendo ou parece que vai chover. Eles têm melhor desempenho em dias ensolarados, independentemente se o laboratório tem janelas ou não. A nossa teoria atual é que esse fenômeno está relacionado à pressão atmosférica, mas não investigaram isso.
O ensaio geotaxis tradicional negativo depende da medição de quantos moscas subir acima de um predeterminado altura em 10 segundos (descrito no http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Acreditamos que o ensaio de anel tem certas vantagens sobre o ensaio de tradicional. Uma é throughput, como seis repetições independente pode ser medida simultaneamente em comparação com a do ensaio padrão, eo sistema é geralmente escalável. Outra é a sensibilidade, porque a altura média subiu em um período de tempo definido é quantificado, em vez de uma passagem / falha número para a altura absoluta. Usando essa abordagem, os déficits mais sutis podem ser observadas. Devido ao nível da taxa de transferência, o ensaio é mais adequado para telas que o ensaio geotaxis mais tedioso tradicional negativo. Além disso, Garagano et al. (2005) descrevem um método de pontuação informatizado que, se empregadas aumentaria ainda mais o rendimento. Considerações principais para este ensaio são que é imperativo que as moscas não são anestesiados antes do ensaio, e que os frascos frescos são utilizados após um dado conjunto de ensaios antes de um novo lote de moscas são testados.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Astha Maltare para gerar os dados rastejantes larvas. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Nicholas Lanson Jr. para dar seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Robert Packard Centro de ALS em Johns Hopkins (a UBP) e da Associação de Esclerose Lateral Amiotrófica (UBP) e R01MH083689 do National Institutes of Mental Health (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
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