Summary
アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な "活動"の間の機構的な関係を明らかにする。
Abstract
シナプス間隙、ドーパミンへのそのリリース後に、その前と後シナプスターゲット1を介して、その生物学的特性を発揮する。ドーパミン信号が拡散2-3、細胞外酵素4、膜輸送体5で終了します。ドーパミンニューロンの周囲のシナプス間隙に位置するドーパミントランスポーターは、内側ドーパミンフラックス（取り込み）を介して放出さアミンをクリアします。ドーパミントランスポーターはまたドーパミン5の外側への輸送または流出と呼ばれるプロセスで、内部から外部へのアミンを解放するために逆方向に働くことができます。 。フォワード（摂取）とリバース（流出）5：20年以上前スルザーらは、ドーパミントランスポーターは、次の2つのアクティビティのモードで動作することができます報告した。トランスポーターを介して流出を介して神経伝達物質放出は、細胞外空間にドーパミンを大量に移動させることができ、細胞外ドーパミンhで主要な調節的役割を果たすことが示されているomeostasis 6。ここでは、同時パッチクランプとアンペロメトリー記録は膜電位が制御されているミリ秒の時間分解能で流出機構を介してドーパミン放出を測定するために使用する方法について説明します。このため、全細胞電流と酸化（アンペロメトリー）信号はAxopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、全細胞電流記録、1,000 Hzのローパスベッセルフィルタが設定された）を使用して同時に測定される。アンペロメトリーは炭素繊維電極を記録するためには、第二増幅器（Axopatch 200B）に接続されており、細胞膜に隣接して配置され、700 mVに保持されます。全細胞と酸化（アンペロメトリー）電流を記録することができ、電流 - 電圧の関係は、電圧ステッププロトコルを使用して生成することができます。濃度への変換を必要とする通常のアンペロメトリックキャリブレーションとは異なり、現在は有効容積7を考慮せずに直接報告されています。従って、得られたデータいくつかの送信機はバルク溶液に失われるので、ドーパミン流出には下限を表しています。
Protocol
1。用品
- バックグラウンドノイズを低減する防振台（TMI）の上にファラデーケージをマウントします。
- 同時パッチクランプアンペロメトリー記録システムは、優れたDICの光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡を必要とします。車のバッテリーに灯台顕微鏡を接続します。システムのこのDC光源はさらに、電気ノイズを減少させるであろう。
- 油圧マイクロマニピュレーター（Siskiyou）さらに減少ノイズ。私達の構成では、我々は、全細胞記録のために右利きのマニピュレータを使用し、電流測定のために左利き。
2。記録用の電極を準備
- P-2000プラー（サター）に石英ピペットを用いてパッチ電極を引き出します。私たちのプルは、2つの熱サイクルで、約5秒続く。この熱時間は私たちの全細胞パッチピペットで一貫抵抗（MΩ3-4）をもたらしました。
- に電極を埋めるピペットは、2mMのドーパミンを含む溶液と右マニピュレーターにマウントします。アルミホイルでDAを含むピペット溶液を保持する容器を包む。氷上で保存する。ドーパミンは酸化可能である。光から保護し、氷の上で解決策を維持すると、ドーパミンの酸化速度が低下します。
- 優しく、収納ボックスからProCFE（ダガン）低ノイズカーボンファイバーアンペロメトリー電極を取り外します（ 図1に示すように）アンペロメトリアダプタに水銀、マウントと入力し、[右maniupulatorにマウントされます。炭素繊維の遠端を保持することによって損傷から炭素繊維の先端を保護します。先端を清潔にし、無傷であることを確認するために、ラボ顕微鏡で電極を点検してください。
- 外液を含有するガラスボトムシャーレに電極を入れて電流滴電極の整合性を調べます。ドーパミンの非存在下での現在のベースラインを記録します。皿に1mmのDA溶液10μlを追加します。良いアンペロメトリー電極REコード酸化電流の増加。アンペロメトリー電極が正常に動作して確実にし、各実験の開始時と終了時に、この手順を繰り返します。
3。グラスボトムペトリ皿内ドーパミントランスポーターを発現するように遺伝子ドーパミン神経細胞や神経細胞の初代培養を始めて
- 優しく暖かい外液と細胞やドーパミンニューロン3回洗浄する。
- 顕微鏡ステージ上にグラスボトムシャーレをマウントします。
4。セルを視覚化し、実験を行う
- 明らかに細胞を可視化するための正しい焦点を見つける。パッチ電極に正の圧力をかける。その後、静かに溶液中に両方の電極をダウンさせると、セルに近接しています。
- セル（左側）、右側にパッチ電極の隣にアンペロメトリー電極を配置します。
- パッチ電極付きセルでgigaohmシールを達成。破裂に吸引シール細胞全体の構成を実現。
- 細胞内にドーパミンを含む内部液の透析のための5月8日分を許可します。
- 所望の電圧ステップまたはランプ·プロトコルを使用しています。同時にパッチピペットと膜電位はパッチピペットを介して制御されながら、ドーパミントランスポーターを介して全細胞電流とドーパミンの逆輸送を測定する電流測定型電極の両方からデータを取得します。
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Representative Results
アンペロメトリーとの複合パッチクランプは、電位依存DAT媒介DA流出。 図2Aは、細胞内環境と膜電位が全細胞パッチピペットによってクランプされるDATの媒介DA流出の代表的な実験設定や記録を示して測定することができます。アンペロメトリー電極が細胞膜（ 図2A）上に置かれている間、このテクニックを使用すると、YFP-DATのタンパク質を発現する細胞は全細胞パッチピペットを用いて電圧にクランプされます。全体のセル電極を2mM DAを含むピペット溶液で満たされている。原形質膜に触れるアンペロメトリー電極が700 mVに、DAの酸化還元電位よりも高い電位に保たれる。 DATの媒介電流（全細胞- 図2C及びアンペロメトリー- 図2D）-40 mVの保持電位（ 図2Bから-60〜+100 mVの膜電位に全細胞ピペットを踏んで記録されている図2D）は、DAの外側束に対応しています。パッチから炭素繊維を移動すると、酸化反応が小さいと遅くなる原因となります。としてDAの酸化に期待、酸化反応は、炭素繊維電圧は300 mVに低減され、さらなる削減に完全に消えたときに減少します。2E-2F図は受け入れ、受け入れられないレコーディングの代表的なものである。 図2Eは、タイトGΩの例です。細胞全体のシールとそれに対応する電流滴信号図2F representsは漏れやすいホールセルパッチ。対応するアンペロ記録が流出したDAを測定します。
図1。アンペロメトリー電極の作製とアセンブリが。ゆっくり、収納ボックスからProCFE低ノイズカーボンファイバーアンペロメトリー電極を除去水銀を詰めます。パッチクランプホルダーに銀線を通すことにより、アダプタを準備して、パッチクランプホルダーにアダプターを通すと優しくアンペロメトリー電極をマウントします。炭素繊維の先端が何も触れてはいけません。
図2。代表的な全細胞とアンペロメトリー記録パッチピペットは、全細胞構成になっている複数の電圧で、実験構成を示す（）漫画。アンペロメトリー電極は細胞膜の近くに配置している間にドーパミントランスポーターを発現する細胞は全細胞パッチピペットを用いて電圧をクランプした。正アンペロメトリー現在におけるDA結果の酸化。電圧クランプ波形プロトコルの（B）のイラスト。 （C）は全細胞をピペットで-40 mVの保持電位から-60〜+100 mVの膜電位を踏んで記録されたDATの媒介電流が。 7月9日以前に説明したようにピペット溶液は、2mMのドーパミンが含まれていました。 （D）はアンペロメトリ電流はパネルC（上記）で表される全細胞電流を同時に取得しました。電圧ステップの開始時に、20 mVより高い電圧のために、電流測定電極は電圧ステップの全期間中に増加した酸化電流（正）を記録します。 （E）及び（F）は、それぞれ、許容、容認できないホールセルパッチクランプ実験を代表するものである。 図2EはタイトGΩワットの一例ですホールセルシールとそれに対応する電流滴信号図2Fは、漏洩ホールセルパッチを表しています。シール抵抗はGΩ前またはホールセルモードを達成するために、細胞に侵入した後の代わりMΩレンジに達した。対応amperomtric記録が流出したDAを測定します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
同時に電圧クランプとアンペロメトリーは、次の利点があります。すべての細胞型はアクセス可能であり、記録のために使用することができます。レコーディングが行われた細胞またはニューロンの同定は、シンプルで簡単です。特に、細胞が蛍光実験者が容易に目的の細胞や神経細胞を選択することができ、目的のタンパク質に蛍光タグを追加することで、ラベルが付いていた場合。実験的な構成では、パッチピペットを介して、または浴溶液10〜これらの薬剤を添加することによりどちらか薬理学的薬剤の均一かつ制御された送達を可能にする。同時パッチクランプアンペロメトリー技術は、ミリ秒の時間分解能で酸化され、トランスミッタのリリースによって異なるチャネルやトランスポーターの役割の調査を可能にしながら膜 電位が制御されます。同じ情報は、生化学的方法8を介して取得することはできません。このapproacのユニークな特徴の一つhは、それがパッチピペット7,11を介して、透析により細胞内環境の操作を可能にすることである。ただし、この手法は、電流滴電極が酸化性のみの送信機を検出できないという欠点を有している。自発的に放出される酸化性化合物のプリロード、例えば、後のリリースの測定、こうしての減少を生成することができ、加えて、電流測定電極の感度は、酸化性化合物の実質的な基礎、自然放出の存在下で減少現在の酸化。この手法の主な欠点は、技術的な専門知識と高価な機器の要件です。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、この原稿の重要なレビューのために博士Sanika Chirwaに感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DA026947、DA021471、そしてNS071122）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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