Utarbeidelse av Parasagittal Slices for etterforskningen av Dorsal-ventral Organisering av Rodent Medial entorhinal cortex

Summary

Vi beskriver prosedyrer for utarbeidelse og elektrofysiologisk registrering fra hjernen skiver som opprettholder dorsal-ventral aksen av medial entorhinal cortex (MEC). Fordi nevrale koding av plassering følger en dorsal-ventral organisasjon innenfor MEC, disse prosedyrene lette etterforskningen av cellulære mekanismer som er viktige for navigasjon og hukommelse.

Abstract

Beregningen i hjernen er avhengig av nevroner svarer riktig på sine synaptiske innganger. Nerveceller ulik komplement og distribusjon av membran ionekanaler som bestemmer hvordan de reagerer på synaptiske innganger. Imidlertid er forholdet mellom disse cellulære egenskaper og neuronal funksjon i oppfører dyr ikke godt forstått. En tilnærming til dette problemet er å undersøke topografisk organisert nevrale kretser i hvilken posisjon de enkelte nevroner kartene inn på informasjonen de kode eller beregninger de utfører ^en. Eksperimenter ved hjelp av denne tilnærmingen foreslå prinsipper for tuning av synaptiske svar underliggende informasjon koding i sensoriske og kognitive kretser ^2,3.

Den topografiske organisering av romlige representasjoner langs dorsal-ventral aksen av medial entorhinal cortex (MEC) gir en mulighet til å etablere relasjoner mellom cellulære mekanismer og beregninger important for romlig erkjennelse. Nevroner i lag II av gnager MEC kode plassering ved hjelp av grid-aktig skyte felt ^4-6. For nevroner som finnes på dorsal stillinger i MEC avstanden mellom de enkelte skyte felt som danner et rutenett er i størrelsesorden 30 cm, mens for nevroner ved gradvis mer ventrale posisjoner denne avstanden øker til mer enn 1 meter. Flere studier har avdekket cellulære egenskaper av nerveceller i lag II av MEC som, i likhet avstanden mellom rutenettet skyte felt, også variere i henhold til deres dorsal-ventral posisjon, noe som tyder på at disse cellulære egenskapene er viktige for romlig beregning ^2,7-10.

Her beskriver vi rutiner for forberedelse og elektrofysiologisk registrering fra hjernen skiver som opprettholder dorsal-ventral omfanget av MEC slik undersøkelse av topografisk organisering av biofysiske og anatomiske egenskaper MEC nerveceller. Dorsal-ventral posisjon identifisert neurons forhold til anatomiske landemerker er vanskelig å etablere nøyaktig med protokoller som bruker horisontale skiver av MEC ^7,8,11,12, som det er vanskelig å etablere referansepunkter for den eksakte dorsal-ventral plasseringen av stykket. Prosedyrene vi beskriver mulig nøyaktig og konsistent måling av plassering av innspilte celler langs dorsal-ventral aksen av MEC, samt visualisering av molekylære gradienter ^2,10. Prosedyrene er utviklet for bruk sammen med voksne mus (> 28 dager) og har blitt ansatt med mus opptil 1,5 år gammel. Med justeringer de kunne brukes med yngre mus eller andre gnagere. Et standardisert system for utarbeidelse og måling vil hjelpe systematisk undersøkelse av de cellulære og microcircuit egenskapene til dette området.

Protocol

1. Parasagittal Slice Forberedelse

1.1 Skjær ut hjernens hemisfærer

Alle dyreforsøk bør følge lokal etisk vurdering og nasjonale forskrifter. I tilfelle av eksperimentene som er beskrevet her, tilfredsstiller arbeidet til Storbritannia Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Vi rutinemessig bruker cervical forvridning uten bedøvelse for å avlive musen før du fjerner hjernen. Alternativt musen kan være terminalt bedøvet, men i dette tilfellet kan det være nødvendig å avgjøre om valget av anestesimiddel påvirker nevrale egenskaper.

Fjern hjernen fra musa og umiddelbart plass i kaldt (4-8 ° C) kutte kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) (se tabell 1 for løsning komposisjoner) boblet til metning med carbogen (95% O _2, 5% CO _2).

Etter maksimalt tre minutter, forsiktig fjerne hjernen fra cUtting ACSF med en slikkepott og forsiktig plassere den i en oppreist stilling (dorsal side vendt oppover) på filter papir som er fuktet med klippeutstyr ACSF (figur 1A).

For å lette nøyaktig montering av halvkuler, bruke en barberhøvel eller skalpell for å fjerne så mye av lillehjernen som mulig uten at det påvirker den MEC (plassert ved kaudal ekstreme av cerebrum) og fjern rostral tredjedel av cerebrum ved snitting i den koronale plan (Figur 1B).

Hemisect hjernen, ta vare på at seksjonen er nøyaktig langs den vertikale planet av midtlinjen (figur 1C).

Returner halvkulene til boblet kutte ACSF for ett og et halvt minutt.

1.2 Monter halvkulene på en vibratome

Før du monterer, sikre at forkant av vibratome bladet er vinklet på 20 grader fra vannrett (

Ta vare å minimere fysisk påvirkning, fjerne hver halvkule fra skjæringen ACSF med en slikkepott og posisjon slik at den mediale overflaten hviler på spatelen og dorsal grad vender mot mikrotomen bladet. Skyv hver halvkule på stripen av superlim, ta vare å sikre at den mediale overflaten av hver halvkule er parallell med mikrotomen basen. Vi har funnet at for best resultat dorsal overflaten av hver halvkule skal være parallelle og møte vibratome bladet (figur 1D).

1.3 Vedlikehold av preparatet under kutting

Etter montering umiddelbart senk halvkulene i Rørkutting ACSF (4 - 8 ° C). Opprettholde temperaturbasertee og carbogen metning i hele slicing prosedyren. Hvis direkte kjøling og boblende av løsningen i skjæringen kammeret ikke er praktisk, periodevis fylle skjæringen ACSF løsningen i kammeret med fersk kjølt og boblet løsning.

1.4 Cut seksjoner

Ved hjelp av en vibratome, fjerne cortex fra begge halvkuler i sagittal planet inntil du identifisere den laterale mest omfanget av MEC (typisk ~ 1mm ned fra den laterale overflaten) (Figur 1F).

Mellom kutt løfte vibratome bladet opp ~ 200 mikrometer for å unngå å dra bladet tilbake over og skade den eksponerte vev. Samtidig kuttet 400 mikrometer parasagittal seksjoner fra begge halvkuler (hvis de står oppstilt som vist i figur 1D de vil begge bli kuttet samtidig) inntil den mediale omfanget av MEC er nådd. Dette kan identifiseres ved fravær av den tykke hvite bånd rundt ventro-kaudal kurve than hippocampus (den ytre kapsel), den ikke-konveks form av sin rostral grense og den kantete dorso-kaudal "hjørnet". Figur 1E illustrerer den sirkulære utseendet av hippocampus i parasagittal flyet sideveis til MEC. Tall 1F-G illustrerer hvordan deler i MEC vises på ulike lateral-mediale stillinger når slicing. Legg merke til gradvis mer bønneformet utseende av hippocampus på flere mediale posisjoner. Hver halvkule gir vanligvis to eller tre 400 mikrometer tykke skiver som inneholder MEC.

1.5 Inkuber skiver

Etter hvert kutt umiddelbart plassere skivene i carbogen-mettet standard ACSF opprettholdes i et vannbad ved 35 ° C. Tillat skiver å ruge ved 35 ° C i ca 15 minutter i ACSF etter slicing er fullført.

Ta stykket holderen fra vannbad og fortsette bobler carbogen ved romtemperatur i løst 45 minutter.

2. Eksempel Parasagittal Slice Experiment

En typisk eksperiment ved hjelp av dette preparatet er å gjøre elektrofysiologiske opptak fra stellate celler i lag II av MEC.

2.1 Optimalisere optikk

Før opptaket, sørge for at kondensatoren er i fokus på skive flyet (Koehler belysning) og er sentrert under høy forstørrelse (f.eks 40x) objektiv.

2.2 identifisere celler av interesse

Bruk en lav forstørrelse (f.eks 4x) som mål å identifisere en omtrentlig innspilling region innenfor MEC (Figur 2A-B). Bytt til en høy forstørrelse mål å identifisere levedyktige celler i denne regionen (figur 2C-D).

Som et eksempel, blir formodet Layer II stellate celler visuelt identifisert av sin polygonal eller ovale formen og flere primære dendritter med tilsvarende diameterter, og fravær av en enkelt stor diameter apikal dendrite ^2,13,14. De er sikkert identifisert på kanten av laget I / II grensen, hvor de er mange og ofte vises i små grupper ^2,9 (Figur 2C-D). Andre celletyper, for eksempel interneurons og pyramidale celler bør også kunne identifiseres.

På dette punktet eksperimenter kan utføres, for eksempel bruk av hel-celle patch-clamp å registrere membranpotensiale eller membran strøm fra identifiserte nerveceller, og elektriske eller optogenetic metoder for å aktivere synaptiske innganger til registrert neuron. Neuron identitet kan verifiseres fra elektrofysiologiske egenskaper registrert nervecellen og ved å inkludere fluorescerende etiketter innenfor den intracellulære løsningen.

3. Mål beliggenhet langs Dorso-ventral aksen

3.1 Bilde plassering av interesse og omkringliggende skive

For å bestemme posisjonen til et innspiltded neuron langs dorsal-ventral aksen, først bruke en lav forstørrelse mål å avbilde MEC regionen stykket og omkringliggende områder. Merk plasseringen av interesse av, for eksempel, herunder opptak elektroden i et bilde (figur 3A) eller ved å tråkke ned i feltet irisblender å forlate en lys sirkel rundt plasseringen av interesse i en kopi. For å finne innspillingen sted i bildet den dupliserte kan da bli lagt på den første bildet av innspillingen beliggenheten og omgivelsene (figur 3B). Opp til tre separate lav forstørrelse (4x) bilder kan være nødvendig for å dekke området fra en ventral opptak beliggenhet til dorsal grensen av MEC. Disse bildene kan deretter sydd sammen ved hjelp av bilde-manipulasjon programvare for å gi et bilde som avstandsmålinger kan tas fra (figur 3). Videre verifisering av nervecellen identitet og plassering kan utføres etter opptak ved å inkludereinaktive markører som biocytin eller Alexa fargestoffer i den intracellulære løsningen og deretter bruke hensiktsmessig behandling av vev etter opptak ^to.

3.2 Etablere dorsal grensen MEC

Dorsal grensen av MEC gir en praktisk landemerke for å måle dorsal-ventral posisjon. Den ventrale grensen av MEC er ikke så godt definert.

Figur 4 illustrerer hvordan MEC mobilnettet landemerkene definert i Nissl fargede skiver på ulike medial-lateral stillinger vises under DIC belysning.

Figur 4 A viser den sirkulære hippocampus (Figur 4 (i)), og mangel på en parasubicular utvekst i lag I (Figur 4 (iv)) forbundet med parasagittal skiver inneholder Lateral entorhinal cortex (LMU).

Figur 4 f.Kr. viser typiske skiver som inneholder MEC. Den dorsale delen av fremtredende mørk dorsal entorhinal / Parasubicular grensen regionen i DIC opplyste skivene inneholder et område av parasubiculum. Det parasubiculum Området er tydelig avslørt av Nissl farging i de tilsvarende bilder i kolonne (iii). Dorsal grensen til MEC (svarte piler i 4B og 4C kolonne (iv)) er ventral til gruppen av parasubicular celler som stikker langt ut i lag jeg (røde piler i 4B og 4C kolonne (iv)).

Sammenligning av Tall 4B og 4C kolonner (ii) og (iii) viser at dorsal grensen av MEC i Nissl delene utgjør en plassering som er ventral til dorsal kanten av det mørke entorhinal / Parasubicular grensen regionen i DIC skive ( svarte piler). Plasseringen av grensen kan estimeres fra DIC bilder og sammenlignet med referanse bilder (se også ref. 14). Future validering av dorsal MEC grensen med molekylære markører vil forbedre nøyaktigheten av dette anslaget. Vi noterer that farget referanse seksjoner, og seksjoner som er behandlet for morfologisk identifisering av merket nevroner, kan bli gjenstand for betydelig svinn. Sammenligning av absolutte avstander i forhold til landemerker i DIC og referansenummer seksjoner krever derfor første måling og korreksjon for krymping (se f.eks ref 2).

3.3 Kalibrer og måle avstander

For å lette enkel måling av avstand i bilder, bruke samme lav forstørrelse mål å avbilde en referanse rutenett for å etablere en piksel: avstand bytteforhold. Mål pixel avstanden fra dorsal grensen av MEC til plasseringen av interesse langs konturen av MEC med en grafikk program og konvertere piksel avstand til distanse i mikrometer (Figur 5A). Hvis nevroner er fylt med en markør som biocytin, da plasseringen av den innspilte nervecellen kan da også bli gjenopprettet ved passende behandling (se f.eks ref 2).

4. Representative Resultater

Figur 5A viser et eksempel lav forstørrelse (4x) sammensatt bilde av en parasagittal skive etter opptak, med plassering av innspilte nevroner og måling guider overlagret. Opptak fra de merkede dorsal og ventral stellate celler er vist i figur 5B. Disse opptakene bidra til å etablere identiteten til cellene og illustrere hvordan elektriske egenskapene til MEC Layer II stellate cellene skiller på rygg og ventral steder.

Figur 1. Utarbeidelse av parasagittal skiver. En Hele hjernen hvile med dorsal side vendt oppover mot et filter papir fuktet med å kutte ACSF. B C Hemisected hjernen klar for montering. D montert halvkuler på lim stripe parallell til cutting edge of vibratome bladet før neddykking i skjæring ACSF og kutting. E Utseende § inneholder LMU under det kutting prosedyren etter fjerning av lateral vev og ennå ikke tilstrekkelig medial for en standard parasagittal MEC skive. F Utseende av "lateral" delen av MEC etter fjerning ytterligere 400 mikrometer vev (overflaten er 400 mikrometer mediale det som vises i . (F)) G Utseende av «medial» del av MEC etter en 400 mikrometer parasagittal skive har blitt kuttet HI Skjematisk av EF henholdsvis indikerer anatomiske landemerker, c:. lillehjernen, L: lateral entorhinal cortex (LMU), m: mediale entorhinal cortex (MEC), h: hippocampus, oransje: ytre kapsel, blå: corpus callosum, cyan: dentate gyrus, green: CA3 og CA1. Utseendet rostral grensen av hippocampus i skiver som inneholder LMU er konkav (svart pil i H), mens i skiver som bare inneholder MEC, kan grensen være lineær (rød pil i I) eller konkav (rød pil i J). De omtrentlige former av fargede anatomiske landemerker ble hentet fra merknadene i Allen Brain Atlas ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Figur 2. Identifisere MEC Layer II celler under DIC belysning. Et Eksempel sammensatt bilde av en para sagittal hjernen skive ved lav forstørrelse (4x). Separate bilder har blitt justert og blandet for å fjerne forstyrrende kanter og vignettering. Viktig landemerke områder h: hippocampus, m:. MEC B Crop fra en individuell lav forstørrelse (4x) image som inneholder lag II av MEC, synlig som den mørke vertikal stripe nær høyre hånd kant C MEC lag II ved høy forstørrelse (. 40x) med DIC belysning. Bildet er en justert og blanda sammensatt av flere bilder. Den tette sentrale 'kolonne' av celler er Layer II. D Enkel høy forstørrelse DIC bilde som viser en gruppe friske antatte stellate celler og interneurons i lag II. Som vist her, stellate cellene forekommer ofte i grupper på grensen av lag I / II. Pyramidale celler har en tendens til å ligge nærmere den Layer II / III grensen. De stiplede linjene i AC indikerer omfanget av BD henholdsvis. Skala barer: i A-og B 500 mikrometer, i C og D 100 mikrometer.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Figur 3. Måle dorsal-ventral posisjon steder av interesse. En Aligned lav forstørrelse (4x) bilder som inkluderer hele dorso-ventral omfang av MEC mellom plasseringen av interesse (merket med spissen av en innspilling elektrode) og den mørke entorhinal / Parasubicular grensen region landemerke (brukes til å etablere dorsal grensen av MEC - se figur 4) B Som A, men med en overlagret bilde med en nedblendet felt irisblender (kledde med redusert opacity) i stedet for et opptak elektrode for å markere plasseringen av interesse..

Figur 4. Beregning av dorsal grensen av MEC fra DIC bilder av parasagittal skiver. AC Parasagittal seksjoner (lateralt for mediale) fra entorhinal cortex. DIC og Nissl delene er fra forskjellige mice AC kolonne (i):.. Hele parasagittal skiver (400 mikrometer tykk) (justert og blandet sammensetninger av lav forstørrelse (4x) bilder) AC kolonne (ii): Nærbilde av entorhinal cortex med karakteristisk mørk entorhinal / Parasubicular grensen region i det øverste området av hvert bilde. AC kolonnen (iii) Nissl fargede skiver (40 mikrometer tykk) fra en annen mus på linje med bilder i AC (ii). Jo mørkere, tett lag av celler er laget II. Sammenlikning kolonner (ii) og (iii) viser hvordan Nissl fargede cellene vises i DIC bilder AC kolonnen (iv):. Detalj Nissl fargede skiver. B og C kolonne (iv) omfatter celler fra parasubiculum (dorsal del av den mørke entorhinal / Parasubicular grensen regionen i DIC bilder) og celler fra dorsal MEC. I B (iv) og C (iv) den store dorsal oppdateringen av parasubicular celler som strekker seg dypt inn i laget er jeg lett synlig (røde piler). Den ventrale kanten av disse lappene tilsvarer dorsal border av MEC (svarte piler). I A (iv) parasubicular patch er fraværende, noe som indikerer at stykket er for sideveis for en standard parasagittal MEC skive forberedelse. I alle paneler, svarte piler indikerer dorsal grensen til MEC. Grå piler indikerer omtrentlig ventrale grensen av MEC.

Figur 5. Representative resultater. En blandet og beskåret del av bildet i Figur 3A. Plasseringen av en dorsal celle og en ventral celle indikeres med blå og grønne fylte sirkler hhv. Den svarte pilen markerer den estimerte dorsal grensen av MEC og er utvidet i de dype lagene av den hvite stiplede linjen. Den solide hvite linjen er en guide som viser konturene stien langs der pixel måling av avstand fra dorsal grensen av MEC til ventrally ligger cellen ble tatt. Scale bar: 500 mikrometer B Electrop.hysiological spor fra cellene angitt i A. Fra venstre til høyre - subthreshold svar på aktuelle trinnene som brukes for å beregne inngang motstand, skyter svar på et stort positivt inneværende trinnet, pigg detalj.

Discussion

For å lette etterforskningen av MEC krets eiendommer som følger en dorsal-ventral organisasjon vi har beskrevet her i detalj en prosedyre for å produsere en parasagittal skive forberedelse som bevarer dorsal-ventral omfanget av MEC.

Kritiske trinn

Fjerne hjernen fra dyret. Vær spesielt forsiktig for å unngå press på hjernen. Dette er viktigere enn rask fjerning av hjernen.

Slicing. Slice bør være fast limt til gulvet i å holde kammeret. Den vibratome bør ha z-aksen vibrasjon <2 mikrometer og bør brukes med høy amplitude og lave hastigheter. De optimale innstillinger kan variere mellom modellene og skal etableres ved prøving og feiling.

Overvåking løsning temperaturer. Vi finner at skive kvalitet er følsom for temperatur under og etter klipping. Outsid e den anbefalte temperaturen varierer antall friske nevroner reduseres, kan nevronene blitt vanskeligere å patch og reaksjoner på synaptisk input kan reduseres.

Imaging. Koehler belysning og sentrering av feltet irisblender er viktig for visualisering av cellene før opptak.

Feilsøking

Slices inneholde få friske celler. Bytt løsninger. Sjekk z-aksen forskyvning på vibratome. Kontroller temperaturen på løsninger. Sjekk orientering av stykket når du skjærer.

Nevroner i stykket er vanskelig å se. Sjekk Koehler belysning er riktig konfigurert. Sjekk mikroskop linser er rene.

Vanskeligheter forming gigaseals. Sjekk form av opptak elektroder. Undersøke skive etter tegn på celledød, f.eks runde celleformer, eller høy kontrast celler.

ve_content "> Bilder av stykket er vanskelig å justere. Sørg for at skivene er i fokus for å fange mest mulig detaljer. For automatisk bildejusteringen> 40% bilde overlapping er vanligvis tilstrekkelig.

Begrensninger

En mulig begrensning av parasagittal skive preparatet er at svært lang rekkevidde synaptiske forbindelser innenfor MEC ikke kan kjøre direkte parallell til parasagittal Plane ^{9, 15} og så kan ikke bli bevart. Vedlikeholde disse forbindelsene kan kreve endring av forberedelse fremgangsmåten for å endre vinkelen på skive kuttet enten hemisecting eller montering av hjernehalvdelene på vibratome i en vinkel i rostral-kaudal fly. Lignende betraktninger kan gjelde for bevaring av andre tilkoblinger, for eksempel afferent innspill fra mediale septum.

Sammenligning med horisontale MEC skive forberedelser

1. Nøyaktig måling av dorsal-ventral plassering er viktigfor å etablere kvantitative relasjoner mellom posisjon langs på dorsal-ventral aksen og fysiologiske egenskaper. I horisontale slice preparater ^7,8,11,12 er det vanskelig å fastslå den eksakte dorsal-ventral plassering av kuttet og dette kompliserer etablere en konsekvent referanse sted. I kontrast, i parasagittal del forberedelse dorsal grensen av MEC er lett å etablere som et referansepunkt og kunnskap om dybden av en nervecelle i en skive er unødvendig å måle sin dorsal-ventral posisjon. Parasagittal skiver derfor i stor grad forenkle nøyaktig måling av dorsal-ventral sted, slik at raskere og presis undersøkelse av kvantitative relasjoner mellom dorsal-ventral plassering og cellulære og krets egenskaper.
2. Molekylære gradienter er viktig for topografisk krets organisasjon i MEC, og kan visualiseres ved hjelp av fluorescens eller annen merking teknikker. I forhold til horisontale skiver, der the signal måtte sammenlignes mellom skivene på ulike dorsal-ventral steder, lar parasagittal forberedelse for enklere, mer finkornet og mer pålitelig visualisering og kvantifisering av dorsal-ventral molekylære gradienter.
3. Dorsal-ventral gradienter i synaptiske tilkobling kan spille en viktig rolle i MEC funksjon. Den parasagittal skive forberedelse kan bevare synaptiske forbindelser mellom rygg og ventral områder innenfor MEC, som er viktig for å undersøke hvordan tilkoblinger varierer innen og mellom forskjellige steder langs dorsal-ventral aksen av MEC og for å opprettholde kretsintegriteten like ved ulike dorsal-ventral steder. Hvis tilkobling varierer betydelig langs dorsal-ventral aksen, horisontale skiver er mindre sannsynlig å like inkludere hele funksjonelle microcircuits på hver ekstrem.

Fremtidig utvikling og applikasjoner

Kunnskap om de molekylære determinanter formobilnettet identitet i MEC vil gjøre definitive karakterisering av neuronal identitet og tillate mer presis fastsettelse av dorsal-ventral sted.

Bruke parasagittal skive forberedelser kan topografisk organisert reaksjoner fra celletype-og location-spesifikk aktivitet av flere nevroner observeres samtidig (for eksempel bruk av spenningsstyrte fargestoffer eller kalsium Imaging) innenfor en enkelt skive.

I kombinasjon med optogenetic verktøy, tillater parasagittal forberedelse selektiv aktivering på ulike posisjoner langs dorsal-ventral aksen. Spør hvordan microcircuitry på ulike dorsal-ventral steder reagerer på romlig målrettet aktivering kunne levere viktig innsikt i MEC microcircuit funksjon.

Vi forventer at dette preparatet vil gi en enkel, robust og standardisert grunnlag for å undersøke dorsal-ventral gradienter i fysiologiske egenskaper og lette understanding av hvordan disse fargeovergangar bidra til informasjonsbehandling egenskaper MEC.