Summary
एक retrovirus मध्यस्थता Oct4 के अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न विधि, Sox2 Klf4, और MYC वर्णित है. मानव iPSC GFP अभिव्यक्ति पर आधारित कालोनियों की पहचान के लिए एक व्यावहारिक रास्ता भी चर्चा की है.
Abstract
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) pluripotent और इन विट्रो रोग मॉडलिंग और 1 दवा पुनर्योजी में के लिए एक अमूल्य सेलुलर स्रोतों हैं. यह पहले से दिखाया गया है कि मानव कोशिकाओं दैहिक चार प्रतिलेखन कारक (Oct4, Sox2, Klf4 और Myc) के अस्थानिक अभिव्यक्ति के द्वारा pluripotency के लिए reprogrammed किया जा सकता है और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) हो गया 2-4. HESCs तरह, मानव IPSCs के pluripotent और ऑटोलॉगस कोशिकाओं के लिए एक संभावित स्रोत हैं. हम यहाँ के लिए चार reprogramming की GFP युक्त रेट्रोवायरल 4 रीढ़ में क्लोन कारकों के साथ मानव fibroblast कोशिकाओं reprogram करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम मानव ईएससी संस्कृति शर्त के तहत 3-4 सप्ताह में मानव IPSCs उत्पन्न करते हैं. मानव iPSC कालोनियों निकट morphology में hESCs और समान रेट्रोवायरल transgene मुंह बंद करने का एक परिणाम के के GFP प्रतिदीप्ति के नुकसान के रूप में प्रदर्शित. iPSC कालोनियों एक प्रतिदीप्ति microsco के तहत यंत्रवत् अलगपे hESCs के रूप में एक समान फैशन में व्यवहार करते हैं. इन कोशिकाओं में, हम एकाधिक के pluripotency जीन और सतह मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने.
Protocol
1. Retrovirus द्वारा reprogramming की reprogramming कारक व्यक्त
- मानव fibroblasts तंतुप्रसू मध्यम (10% DMEM में पेन / Strep साथ FBS) में संवर्धित कर रहे हैं.
- संक्रमण से पहले एक दिन, प्लेट 1x10 5 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक में मानव fibroblasts.
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) को मृत कोशिकाओं को हटाने और ताजा तंतुप्रसू माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए. 5 / μg मिलीलीटर के अंतिम एकाग्रता पर protamine सल्फेट जोड़ें.
- ध्यान से प्रत्येक GFP-व्यक्त वायरस संक्रमण की बहुलता (MOI), 5 5 करने के लिए इसी की उचित राशि जोड़ें.
- संक्रमण के बाद एक दिन, वायरल सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धो लो, तो 2 मिलीलीटर तंतुप्रसू मध्यम के जोड़.
- संक्रमण के बाद तीन दिन, GFP प्रतिदीप्ति की जाँच करें और 2 मिलीलीटर तंतुप्रसू के माध्यम से अच्छी तरह से फिर से भरना.
- संक्रमण के बाद चार दिन, 1x10 थाली विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast 4/2 सेमी (MEFs) के fibroblast मध्यम में एक पर फीडर कोशिकाओं10 सेमी पेट्री डिश जेलाटीन 0.1% के साथ लेपित है. 37 ° रात भर सी सेते हैं.
- संक्रमण के बाद पांच दिन, 1 मिलीग्राम 0.05% typsin / EDTA के 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, और 200 ग्राम से कम 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ संक्रमित मानव fibroblasts अलग. इस माध्यम महाप्राण (व्यंजन) लिए और fibroblast मध्यम 10ml के साथ कोशिकाओं resuspend. एक पूर्व - लेपित 10 सेमी की प्लेट में कोशिकाओं का स्थानांतरण.
- 24 घंटे के बाद, hESC संस्कृति मध्यम (20 नॉक आउट% सीरम प्रतिस्थापन, DMEM/F12, 0.1 मिलीग्राम गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 4 एनजी / एमएल bFGF, पेन / / Strep ग्लूटामेट, बीटा merceptoethanol के) के साथ मध्यम की जगह. बदलें माध्यम दैनिक. ईएससी की तरह कालोनियों को संक्रमण के बाद 20-27 दिन से प्रकट शुरू कर देंगे.
2. अलगाव और IPSCs का विस्तार
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एक बस्ती में GFP प्रतिदीप्ति के अभाव है hESCs करने के लिए एक समान आकृति विज्ञान से पता चलता है के लिए जाँच.
- एक 10 μl विंदुक का प्रयोग, व्यक्तिगत iPSC कालोनियों लेने और जेलाटीन - और MEF सीओए की अच्छी तरह से एक में उन्हें जगहटेड 12 अच्छी तरह से थाली और hESC मध्यम के साथ पूरक. बदलें माध्यम दैनिक.
- Passaging के लिए, DMEM/F12 के 1 मिलीग्राम के साथ थाली धोने, तो Collagenase के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 पर 10 मिनट के लिए सेते हैं ° सी.
- DMEM/F12 साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
- ताजा hESC मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें. एक सेल चोर का प्रयोग, छोटे टुकड़ों में कालोनियों को तोड़ने और थाली से शेष कोशिकाओं को अलग.
- जेलाटीन और MEF लेपित 6 अच्छी तरह से थाली का अच्छी तरह से एक में स्थानांतरण कालोनियों की resuspended टुकड़े.
3. Pluripotent मार्करों का विश्लेषण immunofluorescence
- कोशिकाओं पीबीएस साथ तीन बार धो और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ तय.
- धीरे कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धोने और 0.2% ट्राइटन, पीबीएस में 30 मिनट के लिए X-100. साथ permeabilize
- पीबीएस में 3% BSA के साथ दो घंटे के लिए कोशिकाओं incubating के द्वारा गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.
- 4 बजे प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं रातोंरात सेते हैं डिग्री सेल्सियस <ली> कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धो और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए विशिष्ट माध्यमिक प्रतिरक्षी साथ कोशिकाओं को सेते हैं, प्रकाश से परिरक्षण.
- कोशिकाओं पिछले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद धोने के दौरान तीन बार धो पीबीएस और ऐड DAPI साथ.
- एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ धुंधला का पता लगाने.
4. मात्रात्मक वास्तविक समय pluripotent मार्करों के लिए पीसीआर परख
- कुल शाही सेना मानव मानव क्विएज़न RNeasy किट का उपयोग कर fibroblasts से व्युत्पन्न IPSCs के से अलग.
- पहली भूग्रस्त सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग सीडीएनए synthesize.
- QPCR प्रदर्शन pluripotency पहले रिपोर्ट प्राइमरों का उपयोग जीन का पता लगाने के 6.
5. प्रतिनिधि परिणाम
- Reprogramming के दौरान morphological परिवर्तन
हम मानव fibroblasts Oct4, Sox2, Klf4 और MYC ले रेट्रोवायरस की एक कॉकटेल के साथ BJ1 और डेट्रोइट 551 संक्रमित,और reprogramming की (चित्रा 1) के दौरान morphological परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम थे. इक्कीस दिनों के संक्रमण के बाद, हम hESC की तरह उनके आकारिकी द्वारा छोटे iPSC कालोनियों की पहचान. इसके अलावा, हम GFP प्रतिदीप्ति द्वारा IPSCs पहचान. Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के ESCs और IPSCs रूप में, आणविक मशीनरी व्यक्त करने के लिए proviral जीन की अभिव्यक्ति 7-9 दबाने. हमारे अद्वितीय रेट्रोवायरल वेक्टर GFP के साथ व्यक्त रेट्रोवायरल लीटर द्वारा जीन reprogramming के साथ. इस प्रकार, लगातार GFP व्यक्त कोशिकाओं proviral जीन मुंह बंद करने के बिना transgenes व्यक्त करने के लिए माना जाता है. ईमानदारी से reprogrammed किया iPSC कालोनियों कि pluripotency आणविक नेटवर्क प्राप्त GFP (चित्रा 2) अभिव्यक्ति 10 का अभाव दिखा. - मानव IPSCs की pluripotency की विशेषता
हम immunohistochemistry के माध्यम से डेट्रायट 551-fibroblasts से Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 और NANOG एंटीबॉडी के साथ निकाली गई कालोनियों का विश्लेषण (
आकृति 1. Retrovirus संक्रमित मानव fibroblasts की morphological परिवर्तन (ई.). प्रगतिशील डेट्रोइट 551-reprogramming के कारकों से संक्रमित fibroblasts से कालोनियों में morphological परिवर्तन. दिन 5 (ए), दिवस 10 (बी), 14 दिन (सी), 21 (डी) दिन है. सेल 21 दिनों के बाद आकारिकी hESC तरह दिखाते हैं.
चित्रा 2. Reprogramming के दौर से गुजर कोशिकाओं में प्रतिनिधि GFP फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति. 4 व्यक्त के साथ संक्रमित थे, और चार सप्ताह के लिए hESC मध्यम में incubated. बी.जे. (ए, बी) fibroblasts और डेट्रोइट 551 (सी, डी) रूपात्मक समान दिखा. 21 दिन से, GFP नकारात्मक कालोनियों के लिए फार्म शुरू, जो प्रामाणिक 10 IPSCs में प्रतिनिधित्व करते हैं. (ई, एफ) दिखाने के लिए बदल डेट्रोइट 551 कोशिकाओं है कि उचित reprogramming नहीं आया है. (ए, सी, ई) चरण विपरीत दृश्य के तहत कालोनियों. (बी, डी) ठीक से कोशिकाओं है कि GFP मुंह बंद दिखाने reprogrammed किया. (एफ) बदल कॉलोनी से उज्ज्वल GFP अभिव्यक्ति.
चित्रा 3. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन. (ए) मानव 551-आईपीएस-K1 सेल कालोनियों pluripotent कोशिकाओं के लिए आम मार्करों व्यक्त. DAPI धुंधला क्षेत्र के प्रति कुल सेल सामग्री को इंगित करता है. (बी) मात्रात्मक वास्तविक (RT-qPCR) Oct4 की अभिव्यक्ति के लिए, समय पीसीआर Sox2, Klf4, माता पिता च में MYCibroblast, 551-आईपीएस-K1 IPSCs, और H9 मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs). डेटा β-actin के गृह व्यवस्था जीन के खिलाफ सामान्य थे और माता पिता तंतुप्रसू 4 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर के सापेक्ष प्लॉट किए जाते हैं.
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Discussion
चार प्रतिलेखन कारक reprograms IPSCs मानव fibroblasts की अभिव्यक्ति. मानव गैर एकीकृत या गैर आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए चिकित्सकीय सुरक्षित IPSCs उत्पन्न IPSCs उत्पन्न करने के लिए कई प्रयास किए गए थे. अब तक, इन विधियों बहुत कम दक्षता दिखाने के लिए और आगे अनुकूलन की आवश्यकता reproducibility के 11-14 में सुधार. रेट्रो या lentiviral तरीके आसानी से प्राप्त करने के लिए और मानव के लिए इन विट्रो रोग मॉडल में IPSCs, जो कम वायरल एकीकरण की वजह से सुरक्षा मुद्दों पर निर्भर कर रहे हैं लागू किया जाता है. विधि reprogramming के यहाँ वर्णित मानव IPSCs के कुशल व्युत्पत्ति के लिए उपलब्ध है. मानव IPSCs का चयन मुख्य रूप से कॉलोनी आकारिकी कि मानव ESCs जैसा दिखता है पर आधारित है. अधिक महत्वपूर्ण बात, हमारे विधि रेट्रोवायरल pluripotent स्टेम कोशिकाओं में 7,15 लंबे टर्मिनल (लीटर) दोहराता का मुंह बंद करने की सुविधा का लाभ लेता है. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता रेट्रोवायरल वेक्टर GFP reprogramming करने के लिए जुड़े जीन शामिल हैंकारकों के माध्यम से आंतरिक ribosome प्रवेश के (IRES) अनुक्रम और 5. GFP अभिव्यक्ति proviral लीटर के द्वारा संचालित है. इन वायरस से संक्रमित fibroblasts शुरू उज्ज्वल GFP अभिव्यक्ति दिखाओ. एक बार पूरी तरह से reprogrammed किया है, IPSCs GFP अभिव्यक्ति है, जो आसानी से एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कल्पना है खो देंगे. इस प्रोटोकॉल में, हम भ्रूण और नवजात fibroblasts (551) और BJ1 डेट्रोइट से IPSCs की पीढ़ी का वर्णन किया. हालांकि, इस रेट्रोवायरल वेक्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य वयस्क fibroblasts से IPSCs Mendelian और जटिल 4,16,17 विकार के साथ रोगियों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया गया है.
पहले हम मानव दैहिक सेल के दौरान 10 reprogramming के सेलुलर सतह मार्करों में परिवर्तन का विश्लेषण किया है. कोशिका की सतह मार्करों में एक प्रगतिशील परिवर्तन है. Fibroblasts व्यक्त CD13, जो reprogramming की अभिव्यक्ति द्वारा दमित है. कोशिकाओं reprogramming के शुरू के दौर से गुजर SSEA4 GFP के साथ एक साथ व्यक्त की. तो, वे expressi खोनापर proviral silecing और व्यक्त अतिरिक्त pluripotency निर्माता TRA1 60 10 के माध्यम से GFP की. अच्छी तरह TRA1 की अभिव्यक्ति-60 GFP मुंह बंद और teratoma अच्छी तरह से विकसित गठन के साथ सहसंबद्ध है, सुझाव है कि TRA1-60 ईमानदारी से reprogrammed किया IPSCs के लिए एक मार्कर है. GFP मुंह बंद TRA1-60 अभिव्यक्ति के लिए वैकल्पिक मार्कर है और श्रमसाध्य रहते सेल धुंधला बिना iPSC कालोनियों की पहचान की अनुमति देता है. GFP अभिव्यक्ति की हानि का उपयोग IPSCs के लिए एक मार्कर के रूप में, स्टेम सेल वैज्ञानिकों ने आसानी से और लगातार IPSCs अलग होगा Reprogramming में कोई पूर्व अनुभव है.
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Acknowledgments
यह काम और चार्ल्स हूड फाउंडेशन से बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार मेडिसिन के येल स्कूल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| Knockout Serum Replacer | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | Invitrogen | 11140050 | 0.1 mM |
| β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG | Invitrogen | M-6250 | 0.1 mM |
| bFGF-2 10 μg/ml | GIBCO, by Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| FBS | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| Table 1. Culture Medium | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD Biosciences | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD Biosciences | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD Biosciences | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa-Flur 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa-Flur 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Collagenase type IV | Invitrogen | 17104019 | 1mg/ml |
| Gelatin, Porcine | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0.1% |
| Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0.2% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| BSA | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| MEF feeder cells | EMD Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
| Table 2. Reagents and equipment | |||
References
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