Summary
Основной квест в клеточной биологии является определение механизмов, которые лежат в основе личности органеллы, которые делают эукариотических клеток. Здесь мы предлагаем метод для идентификации генов, ответственных за морфологической и функциональной целостности растительного органелл с помощью флуоресцентной микроскопии и следующее поколение инструментов последовательности.
Abstract
Этот протокол описывает флуоресцентного микроскопа на основе проверки Arabidopsis саженцев и описывает, как отобразить рецессивные мутации, которые изменяют субклеточных распределение конкретных помеченный флуоресцентного маркера в секреторный путь. Arabidopsis является мощной биологической модели для генетических исследований, поскольку его размер генома, Время создания и сохранения молекулярных механизмов между царствами. Массив генотипирования, как подход к карте мутации в альтернативу традиционным методом, основанным на молекулярные маркеры выгодно, потому что это сравнительно быстрый и может разрешить отображение нескольких мутантов в очень короткие сроки. Этот метод позволяет идентифицировать белки, которые могут повлиять на целостность любой органеллы растений. Здесь, как, например, мы предлагаем экран карту генов, важных для целостности эндоплазматического ретикулума (ЭР). Наш подход, однако, можно легко распространить и на другие органеллы растительной клетки(См., например, 1,2), и, следовательно, представляет собой важный шаг на пути к пониманию молекулярных основ, регулирующих другие субклеточные структуры.
Protocol
1. EMS лечение
Arabidopsis семена THALIANA которые мутагенизированный, используя в качестве мутагенного агента этилового метан сульфонат (EMS) 3,4, которое индуцирует в геном C-к-T изменения, приводящие к C / G Т / мутаций 5-7.
- Взвесить 0,8 г семян Arabidopsis (~ 40 000 семян) проведение маркер органелл люминесцентные (в частности, в этом исследовании ssGFPHDEL (сигнал последовательности GFP-HDEL тетрапептид) был использован в качестве маркера ER).
- Передача семена в 50 мл трубку сокол, а затем добавить 25 мл дистиллированной воды.
- Добавить 0,2% (объем / объем) этилового метан сульфонат.
- Выдержите в течение 16 часов на nutating миксером на низкой скорости.
- Аспирацию жидкости и отбросить его в колбу, содержащую 1,0 М NaOH, чтобы инактивировать EMS.
- Добавить 25 мл воды в трубе Сокол содержащие семена, близкие, и инвертировать в 5 раз, чтобы вымыть семена, ждать, пока все семена урегулирован, то аспирация воды и выбросить в 1,0 М Na ОН колбу.
- Повторите промывки до 10 раз.
- После последней промывки, вновь приостановить семена в минимальном количестве воды.
- Приступить к стерилизации семян добавлением 25 мл 10% гипохлоритом натрия, энергично встряхивают в течение 30 сек. Пусть семена оседают на дно, затем слить и промыть отбеливателя с 25 мл стерильной воды. Вылейте стерильной воды и добавить 25 мл 70% этанола. Встряска трубы в течение 30 сек. Пусть семена оседают на дно. Слейте и промойте этанола с 25 мл стерильной воды. Повторите два раза промыть стерильной водой, затем заливают семян на пластиковые чашки Петри, содержащей 3 мм фильтровальную бумагу и дайте высохнуть под капотом. Хранить при температуре 4 ° С в течение 2 дней.
- Пластина семян на ½ MS phytagel (половина средней концентрации Мурасиге и Скуга), 150-мм чашки Петри (~ 250-300 семян на табличке).
- Рост M1 семян на пластине в течение 2 недель, а затем пересадить в почву.
- Сбор семян М2 отдельных M1 растений для создания линии M2 (1000 независимых линий).
В этом разделе мы описываем наблюдения саженцев с конфокальной или флуоресцентного микроскопа, как описано выше 8.
- Шестьдесят семена из каждой линии М2 выросла на 7 до 10 дней на пластиковые чашки Петри, ½ MS phytagel, на той же пластинке также выращивают рассаду 5 EMS-необработанных (контроль).
- Пять-десять семядоли монтируются с абаксиальной стороны в сторону объектива (40X) на предметное стекло и заключены с покровным.
- Каждый семядолей наблюдается, начиная с коры на медиальной области, по флуоресценции для любых измененных субклеточных распределение маркеров органелл.
- Положительные растения пересаживают в почву и семена собирают и обследование для подтверждения мутантного фенотипа в поколение M3.
- Удалить загрязнения фоне мутации по беккросс по крайней мере три раза, чтобы дикого типа генома возможно совместноntaining желаемого органелл флуоресцентный маркер.
- От материнского растения, с помощью тонких ножниц или щипцов удалите зрелые стручки, и распускающиеся цветы.
- Удаление почки, которые слишком малы из меристемы.
- Вставьте кончик одной паре щипцов между лепестками и чашелистиками, чтобы открыть один бутон цветка и удалить все пыльники.
- Использование одной пары щипцов принимать открытое зрелые цветы от отца завод и протрите пыльников на рыльце выхолощенной завода.
3. Сопоставление
В этом разделе описываются по существу, как отобразить рецессивные мутации с использованием модифицированного протокола от Borevitz 9, который работает быстрее, по сравнению с традиционными методами отображения 10,11. Такой подход использования высокой плотности массива олигонуклеотида с возможностью обнаружить многочисленные одного полиморфизма функция (SFP) в одном тесте 12. Использование Arabidopsis Affymetrix ATH1 GeneChip массив можноанализировать около 24 000 генов. Пул F 2 лица показывает мутации по сравнению с бассейном дикого типа F 2 растения, собранные в одном разделения населения. Затем, мутация будет отображаться в области, где мутант бассейн обогащается за мутантных аллелей генотипа и, следовательно, в этом же районе дикого типа бассейн приведет обогащенные для дикого типа родитель аллелей 13.
- Геномная ДНК (3 мкг) извлекается из гомозиготных мутантов Колумбия (M3) с помощью завода Qiagen DNeasy Mini Kit и представлен на Illumina Genome Analyzer II (ГА II) 14 последовательности.
- Гомозиготных мутантов Колумбия (M3) пересекается с Ландсберг erecta для создания отображения населения.
- Отображение осуществляется на 70 до 100 F2 лиц показывает аномальным фенотипом и такое же количество F2 растений дикого типа фенотипа.
- Сбор с каждого растения лист диска (0,60 мм) с помощью дырокола.лист диска должна быть собрана из листьев одного и того же возраста обязательно иметь одинаковое количество ДНК. Образцы могут быть обработаны для геномной добыча по отдельности или группами. В этом случае, можно собрать 5-10 образцов для каждой пробирки Эппендорф, так что в конце концов, у вас будет меньше Эппендорф труб из геномной ДНК, которые должны быть извлечены.
- MasterPure листьев растений ДНК Очистка Kit (Эпицентр) используется для получения геномной ДНК. Геномной ДНК, полученной из каждого образца количественно с nanodrop.
- Такое же количество геномной ДНК из каждого образца затем собрали в общей сложности до 300 нг (~ 30 мкл) растений ДНК, добавить 60 мкл 2.5X случайное решение грунтовки [125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 12,5 мм MgCl2, 25 мМ 2-меркаптоэтанол, 750 мкг / мл праймера oligodeoxyribonucleotide (случайная октамеры)] (Bioprime комплект) и 42 мкл воды (конечный объем 132 мкл).
- Денатурации ДНК в> 95 ° C в течение 5 до 10 мин.
- Прохладный на льду.
- Для каждого denatuкрасный ДНК добавляют 15 мкл 10X смесь дНТФ с биотин дЦТФ [1 мМ биотин-14-дЦТФ, 1 мМ дЦТФ, 2 мМ дАТФ, 2 мМ дГТФ, 2 мМ дТТФ в 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ Na2EDTA] (Bioprime комплект), а в комплекте с 3 мкл полимеразы Кленова (Bioprime комплект).
- Выдержите в течение ночи при 25 ° C.
- На следующий день, добавить 15 мкл 3 М NaOAc и 400 мкл холодного 100% этанола, перемешать.
- Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 1 часа, затем вращаться 20500 мкг в течение 15 мин, удалить супернатант, и промыть 500 мкл холодного 75% этанола.
- Спиновая на 20 500 мкг в течение 10 мин.
- Гранулы сухого ДНК при 37 ° С в течение 10 минут и ресуспендируют в 100 мкл воды.
- Используйте 5 мкл проверить урожайность и качество на гель (рис. 2).
- Отправить 95 мкл маркировки реакция дикого типа и мутантных для GeneChip Arabidopsis ATH1 гибридизации генома массива.
- Массивы сканирования и. CEL файлы, полученные анализируются с помощью программного обеспечения R ( http://www.r-project.oге /).
- Установка программного обеспечения R, а затем открыть программу и вставьте следующую строку:
источник (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Затем нажмите клавишу возврата ключей будет установлен стандартный пакет Bioconductor ( http://www.bioconductor.org ). - В новую папку на рабочем столе, загрузить со следующего веб-сайта ( http://www.naturalvariation.org/methods ) файлов:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
ColLerCEL.zip файл необходимо распаковать и полученные файлы вставлен в новую папку. - Переименовать данные, полученные от вашего GeneChip эксперимент в wildtype.CEL и mutant.CEL.
- Скопируйте теперь данные GeneChip (wildtype.CEL иmutant.CEL) в папку.
- Открытое R, а) для Mac: нажмите "Разное", а затем нажмите кнопку "Изменить рабочий каталог". б) для ПК: нажмите кнопку "Файл", затем "Изменить каталог"
- а) для Mac: Выберите папку, содержащую файлы. Нажмите кнопку "Рабочее пространство", "файл рабочей нагрузки" и выберите ath1V5.RData, б) для ПК: Выберите папку, содержащую файлы выше, нажмите кнопку "Файл", затем "Загрузить рабочее пространство" и выберите ath1V5.RData.
- Открытое readCEL.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
- Открытое SFP.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
- Открытое Map.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
- В окне консоли вы увидите следующее сообщение:
Х-хромосома ограничивает Mb уг
Поиск генов ТАИР вставить ссылку
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=yИ конец = Z - Скопируйте и вставьте ссылку в ваш интернет-браузер. Появится окно, и просим, чтобы открыть или сохранить файл, вы должны выбрать сохранить. Выберите имя файла и прикрепите с расширением ". XLS", нажмите кнопку Сохранить.
- Откройте файл ". XLS", где Вы можете найти координаты для мутантов (результат наглядно представлены на рисунке 3).
- В подключенных области в собранном Illumina читает мутантного генома определить конкретные переходы EMS 4 место среди одиночных нуклеотидных полиморфизмов. Дополнение мутантного фенотипа путем трансформации гена дикого типа (типов) с использованием стандартных процедур 15.
4. Представитель Результаты
На рисунке 1 показан подход, используемый для идентификации мутантных секреторного пути с помощью конфокальной микроскопии скрининга. На рисунке 2 показан типичный подготовки меченой геномной ДНК гибридизации для массива. На рисунке 3, типичный результат ожидается после анализа данных, полученных из GeneChip Arabidopsis массива генома ATH1 представлен.
Рисунок 1. Arabidopsis трансгенных растений, экспрессирующих ssGFPHDEL (ER маркер) (1) культивировали производить достаточное количество семян для лечения EMS (2). Семена обрабатывают EMS затем были посеяны для создания M1 растения (3). Каждое растение представляет M1 различные линии и семена были собраны отдельно от каждого из них. М2 семена высевают на ½ MS субстрата (4), а затем обследование на наличие дефектов в морфология ER с помощью конфокальной микроскопии (5). Во время обследования мы обнаружили растения, которые сохраняются дикого типа ER морфологии (6) и растений, которые показывают, дефектный фенотип ER (7). Эти растения были выращены для получения M3 поколения и подтвердить фенотип (8). Геномная ДНК из растительных M3 была использована для Solexa Illumina последовательности (а). То же самое растениебыл также использован для скрещивания с Лер-масс для получения F2 населения отображения (б).
Рисунок 2. Bioprime случайных реакций маркировки (5 мкл 100 мкл) были загружены на агарозном геле 1%. Переулок от бассейна дикого типа F2 растений, а полоса Ъ из числа мутантных растений F2. (Маркера составляет 1 Kb ДНК лестница-N3232, от NEB).
Рисунок 3. Фигура представляет собой пример отображения Кол-0 мутация использованием GeneChip Arabidopsis ATH1 генома массива гибридизации. Мутация в этом примере находится на разделителями хромосомы 1, вертикальные полосы. Горизонтальных полос представляют пороги обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали конфокальной микроскопии скрининга для идентификации endomembrane мутантов. Этот подход можно легко распространить и на другие органеллы клетки, для которых конкретные флуоресцентные маркеры белка имеются. Экран на основе идентификации мутантов, которые показывают, аномальным распределением флуоресцентный маркер или в целевой органелл или органеллы, которые не должны содержать маркер. Соответственно, эти мутанты представляют население, в которых либо способность к органелл subcompartimentalize маркер находится под угрозой или мутанты, которые не могут правильно перемещать маркер между органеллами. Во время обследования мы заметили, что некоторые мутанты показали фенотип на ранних стадиях развития еще в течение 7 дней после прорастания, однако, другие показали, фенотип только в более поздней стадии развития. Хотя это может быть связано с рядом причин, в том числе развитие зависит от экспрессии мутировавшихаллель (ы), это говорит о том, что растения должны быть рассмотрены на разных стадиях роста (по крайней мере, от 7 до 14 дней), чтобы гарантировать, что потенциально интересных мутантов, не отбрасываются.
Подход, описанный в этом протокол позволяет отображать гена в относительно короткое время по сравнению с классическим способом отображения. На самом деле, сбор достаточного количества особей F2 населения для GeneChip массива требуется относительно небольшое количество времени по сравнению с F2 растений, необходимых для классической тонкой отображения процедуры. Однако, есть важные шаги, которые должны быть соблюдены. Отбор образцов F2 населения показывать или не показывать фенотипа должна проводиться осторожно, так как добавление даже небольшого количества растений с неправильным фенотипом по ошибке может привести к ошибкам в конечном результате. В основном это связано с тем, что население F2 используется для грубой отображение очень мало. По этой причине, выбор растений, что СПЭее показывать или не показывать фенотипа должна проводиться каждый раз, когда в тот же день после всходов. Это потому, что, как уже отмечалось выше, появление фенотип может быть связано с ростом. Еще один важный момент, чтобы рассмотреть внимательно посмотреть на следующее поколение данных postalignment, которые созданы программами, которые дают нам важную информацию, как процент читает содержащие вариант. Теоретическое значение ожидается гетерозиготных варианте составляет около 50%, это означает, что 50% из последовательностей будет содержать вариант, а для гомозиготном варианте, составляет примерно 100%. К сожалению, ситуация после postalignment могут быть далеки от теоретического значения, на самом деле процент читает содержащие вариант для гетерозиготных может варьироваться от 20 до 80%, а от 60 до 100% гомозиготных 16. Поэтому, чтобы не пропустить ключевой одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), важно, чтобы не отказаться от мутантов с менее чем 100% процент повторнообъявления вариант.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем, поддержка со стороны химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке, Министерство энергетики США (награда номер DE-FG02-91ER20021) и Национальный научный фонд (MCB 0948584) (FB). Мы благодарны г-жа Карен птица для редактирования рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K.
- Maple, J., Moller, S. G.
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
