Direct PCR tilnærming som presenteres her letter PCR forsterkning direkte fra små mengder urenset planter og dyr vev.
Direct PCR tilnærming gjør PCR forsterkning direkte fra små mengder av urenset prøver, og er vist her for flere anlegg og animalsk vev (figur 1). Direkte PCR er basert på spesielt konstruert Thermo Scientific Phusion og Phire DNA polymerase, som inkluderer en dobbel-strandet DNA bindende domene som gir dem unike egenskaper som høy toleranse for hemmere.
PCR-basert mål-DNA påvisning har en rekke bruksområder i planteforskning, inkludert plante genotype analyse og verifisering av transgener. PCR fra plantemateriale innebærer tradisjonelt en innledende DNA isolert trinn, som kan kreve dyre eller giftige reagenser. Prosessen er tidkrevende og øker risiko for krysskontaminering 1, 2. Omvendt, ved hjelp av Thermo Scientific Phire Plant direkte PCR Kit målet DNA kan lett oppdages, uten forutgående DNA-ekstraksjon. I modellen demonstrert her, eneksempel på avledet kløyvde forsterket polymorf sekvensanalyse (dCAPS) 3,4 utføres direkte fra Arabidopsis plante blader. dCAPS genotyping analyser kan benyttes for å identifisere enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs) av SNP allel-spesifikk restriksjonsendonuklease fordøyelsen 3.
Noen plante prøvene tendens til å være mer utfordrende når bruker Direct PCR metoder som de inneholder komponenter som forstyrrer PCR, som fenoliske forbindelser. I disse tilfellene er et ekstra trinn for å fjerne forbindelser tradisjonelt kreves 2,5. Her, er dette problemet løst ved å bruke en rask og enkel fortynning protokoll etterfulgt av direkte PCR amplifikasjon (Figur 1). Femten år gamle eikeløv brukes som en modell for utfordrende planter som prøven inneholder store mengder fenolforbindelser inkludert tanniner.
Genoverføring i mus er bredt brukt til å studere rollene av gener i utviklingslandpment, fysiologi og sykdom hos mennesker. Bruken av disse dyrene trenger screenet for tilstedeværelse av transgenet, vanligvis med PCR. Tradisjonelt, innebærer dette en tidkrevende DNA isolering trinn, der DNA for PCR-analyse renses fra øret, hale eller tå vev 6,7. Men med Thermo Scientific Phire animalsk vev Direkte PCR Kit transgene mus bli genotyping uten forutgående DNA rensing. I denne protokoll transgen mus genotyping oppnås direkte fra mus øret vev, som demonstrert her for en utfordrende eksempel hvor bare én primer sett brukes for amplifikasjon av to fragmenter ulik sterkt i størrelse.
Direct PCR tilnærming demonstrert her tillater PCR forsterkning direkte fra små mengder urenset prøver, noe som reduserer tiden det og forenkle arbeidsflyten for planter og dyr genotyping (figur 7). Demonstrerte også her er bruken av fortynningen protokollen i kombinasjon med Direct PCR tilnærming (figur 3). Fortynning protokollen anbefales med vanskelige prøver (f.eks alderen plante blader, plantearter som inneholder forstyrrende forbindelser) eller med lange (eller GC-rike) amplikonene. Denne protokollen er spesielt nyttig når starter en ny direkte PCR eksperimentet, noe som åpner for optimalisering av reaksjonen. Protokollen kan tjene som et verktøy for å håndtere sporadiske problemer som lave produktpriser gir grunn av forskjeller i vev materiale og / eller primere brukes. Videre, når kjører flere reaksjoner fra samme prøve, bruk av fortynningen protokoll sikrer hele prøven er ikke forbrukes i enreaksjon.
For å rense DNA fra planter for PCR, var konvensjonen til å utføre cellelyse etterfulgt av DNA isolert ved hjelp av ulike komponenter som potensielt kan forstyrre PCR-analyse 8. For spesielt utfordrende planter med høyt fenoliske innhold, tillegg av polyvinylpyrrolidon ble tradisjonelt brukt til å fjerne forbindelser som binder seg til DNA etter cellelyse 2,5. Som fremgår her, kan disse kompliserte, tidkrevende trinn unngås ved bruk av Phire Plant Direkte PCR Kit for å detektere mål-DNA. Cellelyse og DNA isolering trinn kan utelates ved hjelp de følsomme dCAPS teknikker direkte fra Arabidopsis plante blader (figur 2). Som demonstrert her, administrerer fortynning protokollen effektivt tilstedeværelsen av problematiske komponenter som kan forstyrre PCR (figur 3).
Tradisjonelt, var en forutsetning for dyrs genotyping isolasjonseffekterpå av genomisk DNA fra animalsk vev gjennom en giftig, tidkrevende prosess karakterisert ved en lang inkubasjon med proteinase K å fordøye hud og bindevev, etterfulgt av organisk løsemiddelekstraksjon, alkohol nedbør og sentrifugeringstider trinn 6,9,10. Som demonstrert her, er forenkling av denne prosessen oppnås ved bruk av den Phire animalsk vev direkte PCR Kit, slik transgene mus skal genotyping uten forutgående DNA rensing (figur 4). Eksempelet vist i denne artikkelen er spesielt utfordrende som bare en primer sett ble brukt for amplifikasjon av to fragmenter med en stor størrelse forskjell. Tross protokollens medfødte vanskeligheter, bruk av Direct PCR tilnærmingen i forbindelse med enkel fortynning protokollen ga høye utbytter av de to PCR-produkter (Figur 4).
PCR-basert mål-DNA påvisning har mange bruksområder innen forskning, inkludert genotype analyse for å identifisererollene av gener i utvikling, fysiologi og sykdom. Grunnet inhibitor toleranse av de spesialiserte DNA polymeraser kan protokollene være ferdig i minimal tid uten forutgående DNA rensing.
The authors have nothing to disclose.
For de Arabidopsis prøver og de berørte PCR primere takker vi professor Jaakko Kangasjärvi og hans gruppe, The Plant Stress Group, Plant biologi, Institutt for biovitenskap, Universitetet i Helsinki. Forsøkene med den tradisjonelle metoden ble utført av Mrs. Airi Lamminmäki.
Transgene mus prøvene ble levert av Dr. Jaana Vesterinen, Institutt for biomedisin / biokjemi, Universitetet i Helsinki.
Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat er varemerker for Shunderson Communications Inc. Alle andre varemerker tilhører Thermo Fisher Scientific Inc. og dets datterselskaper.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |