本文介绍的直接PCR方法能够直接从小量未纯化的植物和动物组织中进行PCR扩增。
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摘要
摘要
直接PCR方法能够从小量未纯化的样本中直接进行PCR扩增，本文以多种植物和动物组织为例进行了演示（图1）。直接PCR基于特别改造的Thermo Scientific Phusion和Phire DNA聚合酶，这些聚合酶包含一个双链DNA结合结构域，使其具有独特的性质，例如对抑制剂具有高耐受性。
基于PCR的靶标DNA检测在植物研究中具有广泛应用，包括植物基因型分析和转基因验证。传统上，从植物组织进行PCR需要先进行DNA提取步骤，该步骤可能需要使用昂贵或有毒的试剂。此过程耗时较长，并增加了交叉污染的风险1, 2。相比之下，使用Thermo Scientific Phire植物直接PCR试剂盒可无需预先提取DNA而直接检测靶标DNA。在本演示的示例中，直接从Arabidopsis植物叶片进行衍生切割扩增多态性序列分析（dCAPS）3,4。dCAPS基因分型检测可通过SNP等位基因特异性的限制性内切酶消化来鉴定单核苷酸多态性（SNPs）3。
某些植物样本在使用直接PCR方法时往往更具挑战性，因为它们含有干扰PCR反应的成分，例如酚类化合物。传统上，在这些情况下需要额外的步骤来去除这些化合物2,5。本文通过采用一种快速简便的稀释方案，随后进行直接PCR扩增，克服了这一问题（图1）。以存放15年的橡树叶片作为难处理植物的模型，因为该样本含有大量包括单宁在内的酚类化合物。
将基因导入小鼠体内被广泛用于研究基因在发育、生理及人类疾病中的作用。使用这些动物需要通过PCR等方法对转基因的存在进行筛选。传统方法通常包括一个耗时的DNA分离步骤，即从耳朵、尾巴或脚趾组织中纯化用于PCR分析的DNA6,7。然而，使用Thermo Scientific Phire动物组织直接PCR试剂盒，可在无需预先纯化DNA的情况下对转基因小鼠进行基因分型。本实验方案展示了直接从小鼠耳组织提取样本进行转基因小鼠基因分型的方法，其中以一个具有挑战性的实例进行说明：仅使用一对引物即实现了两个大小差异显著的DNA片段的扩增。
方案
1. 基因分型 拟南芥 具有直接实验方案的植物个体
- 开始直接对样本进行dCAPS基因分型分析 拟南芥 植物叶片，首先配制 20 或 50 μl 使用 Phire Plant Direct PCR 试剂盒进行 PCR 反应，具体方法如所述 表1.
- 接下来，从一个0.50 mm的打孔中切取样本 拟南芥 使用Harris Uni-Core打孔器和Harris切割垫提取植物叶片组织。牢固握住打孔器，将切割边缘压入组织，并前后旋转打孔器。
- 按压推杆，将穿孔圆片弹入PCR反应混合液中。确保样品落入PCR溶液中，且不粘附在管壁上。
- 每次取样之间，将打孔器的切割边缘浸入2% NaClO溶液中以防止交叉污染，并将推杆上下推动数次，然后用干净的纸巾擦拭切割边缘。样品之间也应冲洗切割垫。
- 接下来，使用 Thermo Scientific Piko 24 孔梯度PCR仪和 Thermo Scientific Piko PCR板，按照所述的循环条件进行PCR反应。 表2PCR 反应也可在常规 PCR 扩增仪中进行。
- PCR 反应后，离心沉淀植物材料。转移 5 μl 将上清液转移至新的微量离心管中。加入 4 μl 水 1 μl 限制性内切酶 SspI。轻轻混匀，并短暂离心以收集管底液体。将反应体系在指定温度下孵育 1 小时。 37 °C. 通过孵育使限制性内切酶失活 65 °C 20 分钟。
- 从植物组织直接扩增DNA时，PCR产物中含有植物组分和PCR衍生组分，可能干扰限制性内切酶的消化反应。因此，可能需要对产物进行稀释（例如 1:2 或 1:3 的比例稀释于水）或在后续消化前纯化 PCR 产物，例如使用合适的商业试剂盒（如 Thermo Scientific GeneJET PCR 纯化试剂盒）。
- 经限制性酶切后，将所得片段在琼脂糖凝胶上进行分析。添加 2.5 μl 加入5×上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳 10 μl 所得混合物。
2. 使用稀释法从15年生的橡树叶片中扩增特异性DNA片段
- 首先，用打孔器切取一片直径为 2 mm 的橡树叶。
- 将样品放入 Phire 植物直接 PCR 试剂盒中提供的 20 μl 稀释缓冲液中。像之前一样清洁打孔器的切割边缘和切割垫。
- 用 100 μl 移液器吸头轻轻按压管壁，碾碎叶片样品。根据植物材料的不同，有时不碾碎样品反而更有利于稀释步骤的进行。
- 将样品在微量离心机中短暂离心，使反应液全部沉降至管底。
- 上清液可直接用于 PCR 反应，或根据样品类型用无菌水稀释 1:10 或 1:100。取 0.5 μl 至 1 μl 上清液或稀释液作为模板，用于 20 μl 的 PCR 反应。反应体系的配制方法见表 1。
- 完成反应体系配制后，使用 Thermo Scientific Piko 24 孔梯度 PCR 仪和 Thermo Scientific Piko PCR 板，按照表 2中描述的扩增程序进行 PCR 反应。PCR 反应也可在常规 PCR 扩增仪中进行。
- PCR 反应结束后，向反应体系中加入 5 μl 5×上样缓冲液，取 15 μl 混合液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3. 使用稀释法对转基因小鼠进行基因分型
- 开始对转基因小鼠进行稀释操作时，将小鼠耳朵的 2 mm 打孔组织放入含有 Phire 动物组织直接 PCR 试剂盒所提供的 0.5 μl DNA 释放添加剂的 20 μl 稀释缓冲液中。
- 将样品在室温下孵育 2 分钟，随后在 98 °C 下孵育 2 分钟。
- 将样品在微量离心机中短暂离心，使反应液全部沉降至管底。
- 取 1 μl 上清液作为 20 μl PCR 反应的模板，PCR 反应体系的配制方法见表 3。未立即使用的上清液可转移至新管中，并在 -20 °C 下保存。
- 接下来，使用 Thermo Scientific Piko 24 孔热循环仪和 Thermo Scientific Piko PCR 板，按照表 4中描述的循环条件进行 PCR 反应。同样，PCR 反应也可在常规 PCR 仪中进行。
- PCR 完成后，向反应体系中加入 5 μl 5× 上样缓冲液，并取 15 μl 混合液进行琼脂糖凝胶电泳。
4. 代表性结果
在dCAPS技术中，通过使用对目标DNA含一个或多个错配的PCR引物，可在感兴趣的SNP位点引入或破坏限制性酶切位点。拟南芥植株个体的基因分型直接采用来自叶片穿孔样品的dCAPS技术进行。扩增产物经酶切消化后，通过凝胶电泳分析所产生的片段，以确定每个个体的基因型（图2）。
在此示例中，使用 Phire Plant Direct PCR Kit 从植物叶片穿孔样本中扩增出包含 Arabidopsis 基因组中目标 SNP 位点（G 或 A 等位基因）的 160 bp PCR 产物。上游引物在 3' 端引入一个错配碱基，使得目标 DNA 中（包含 SNP 的 A 等位基因）形成 SspI 特异性限制性酶切位点，而该酶切位点在 SNP 的另一等位基因中不存在（图 2B）。
由于植物材料（如橡树叶）含有高浓度的酚类化合物，对其进行稀释是必要的。采用本文所述的稀释方案后，通过三步法成功扩增了叶绿体DNA的297 bp片段。不同稀释倍数的橡树叶样本以及阳性和阴性对照如图3所示。
采用Phire动物组织直接PCR试剂盒进行了一项具有挑战性的实验，该实验仅使用一对引物扩增出两个大小差异显著的片段，成功获得了大量正确大小的产物，分别为转基因小鼠的1,500 bp和野生型小鼠的200 bp（图4）。杂合子小鼠中较弱的上方条带是由于两种模板（等位基因）竞争同一对引物所致；然而，基因分型结果明确无误。
采用稀释法所制备样品的稳定性也经过测试。结果表明，稀释后的样品在 -20 °C 条件下至少可保存一年。此外，反复冻融循环对反应无显著影响（图 5）。图中还显示，使用 Phire DNA 聚合酶结合直接 PCR 法对小鼠耳组织样品进行扩增的效果显著优于热启动 Taq 聚合酶与纯化 DNA 的方法（图 6）。
| 组分 | 20 μl 反应体系 | 50 μl 反应体系 | 终浓度 |
| H2O | 加至 20 μl | 加至 50 μl | |
| 2x Phire 植物 PCR 缓冲液 | 10 μl | 25 μl | 1x |
| 引物 A | X μl | X μl | 0.5 μM |
| 引物 B | X μl | X μl | 0.5 μM |
| Phire Hot Start II DNA 聚合酶 | 0.4 μl | 1 μl | |
| 样品/直接法操作 | 0.50 mm 打孔 | ||
| 样品/稀释法操作 | 0.5-1 μl |
表1. 本方案中植物PCR反应条件。
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 初始变性 | 98 °C | 5 min | 1 |
| 变性 退火* 延伸 | 98 °C X °C 72 °C | 5 sec 5 sec 20 sec | 40 |
| 最终延伸 | 72 °C 4 °C | 1 min 保持 | 1 |
表2. 本实验方案中植物PCR所用的循环条件。
* 确定与 Phire Hot Start II DNA 聚合酶配合使用的引物 Tm 值时，推荐使用 www.thermoscientific.com/pcrwebtools 上的 Tm 计算工具。对于长度 ≤ 20 nt 的引物，推荐的退火温度等于该网络工具给出的较低 Tm 值；对于长度 > 20 nt 的引物，退火温度应比该工具给出的较低 Tm 值高 3 °C。
| 组分 | 20 μl 反应体系 | 终浓度 |
| H2O | 加至 20 μl | |
| 2x Phire Animal Tissue PCR Buffer | 10 μl | 1x |
| 引物 A | X μl | 0.5 μM |
| 引物 B | X μl | 0.5 μM |
| Phire Hot Start II DNA Polymerase | 0.4 μl | |
| 样品/稀释方案 | 1 μl |
表3. 本方案中用于动物组织PCR的反应条件。
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 初始变性 | 98 °C | 5 min | 1 |
| 变性 退火* 延伸 | 98 °C X °C 72 °C | 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec/kb > 1 kb | 40 |
| 最终延伸 | 72 °C 4 °C | 1 min 保持 | 1 |
表4. 本方案中用于动物组织PCR的循环条件。
* 确定与 Phire Hot Start II DNA 聚合酶配合使用的引物 Tm 值时，建议使用 www.thermoscientific.com/pcrwebtools 上的 Tm 计算工具。对于长度 ≤ 20 nt 的引物，建议的退火温度等于该网络工具提供的较低 Tm 值；对于长度 > 20 nt 的引物，退火温度应比该工具提供的较低 Tm 值高 3 °C。
图1. 直接PCR工作流程。 可采用两种不同的实验方案进行直接PCR。在直接法中，将极少量样本直接加入PCR反应体系中；而在稀释法中，则在PCR扩增前增加一个短暂的预孵育步骤，以从样本材料中释放DNA。
图2. 基因分型 拟南芥 利用dCAPS技术直接从叶片穿孔样本中鉴定植物个体。A) 图 2A 展示了dCAPS检测的原理。通过PCR使用含有一个或多个错配碱基的引物，可在目标DNA的SNP位点内引入或消除限制性酶切位点。PCR产物经酶切消化后，通过电泳分析所产生的片段，即可揭示每个个体的基因型。 B) 0.50 mm 的植物叶片圆片直接放入 50 μl PCR 反应。使用引物扩增包含 SNP 位点（G 或 A 等位基因）的 160 bp PCR 产物，该引物在 A 等位基因中引入一个独特的 SspI 位点。未经纯化的 PCR 产物用 SspI 限制性内切酶进行消化。消化后的片段在 3% 琼脂糖凝胶上进行分析。泳道 M 为分子量标记；泳道 A 和 G 分别对应每个样本的 SNP 等位基因。所得结果通过传统的 DNA 提取后 PCR 扩增及限制性酶切分析予以验证（数据未显示）。在进行酶切前，实验设置中包含无模板 DNA 的阴性对照反应，并与实际 PCR 反应平行地在另一块琼脂糖凝胶上电泳分析（数据未显示）。
图3. 使用橡树叶片样本的稀释方案。 采用稀释方案对橡树叶片样本中叶绿体DNA的297 bp片段进行扩增（三步法，退火温度为62 °C），在不同稀释比例（1:100、1:10、1:1和2:1）下进行，并设置阳性和阴性对照[C+：来自纯化DNA的阳性对照（Arabidopsis），C-：无模板DNA的阴性对照]。样本命名表示样本采集地点（芬兰的城镇）及样本编号。
图4. 使用一对引物及稀释法对转基因小鼠进行基因分型。 九只不同小鼠的耳组织（第1-9泳道）被放入含有DNA释放添加剂的20 μl稀释缓冲液中。在室温及98 °C孵育后，取1 μl上清液作为模板加入20 μl的PCR反应体系中。片段大小：1,500 bp（转基因型）和200 bp（野生型）。
图5. 按照稀释方案制备的样品可长期稳定保存。 小鼠耳组织样品在含有DNA释放添加剂的20 μl稀释缓冲液中孵育，随后进行反复冻融（泳道1）、在-20 °C下保存一年（泳道2），或直接用于PCR扩增（泳道3）。扩增得到的片段大小分别为900 bp、1,500 bp和3,200 bp。
图6. Phire动物组织直接PCR试剂盒的表现优于商用DNA纯化系统联合热启动Taq DNA聚合酶的方法。 采用Phire动物组织直接PCR试剂盒的稀释法，从小鼠耳组织中扩增出四个片段（0.5–1.5 kb）。作为对照，首先使用商用DNA提取试剂盒纯化DNA，并按照生产商推荐条件，利用热启动Taq DNA聚合酶对相同片段进行扩增。只有使用Phire动物组织直接PCR试剂盒时，四个扩增片段均成功获得。
图7. 各工作流程的通用比较，包含时间/消耗试剂的估算。 Thermo Scientific Direct PCR 方法与DNA分离方法、提取缓冲液方法以及PCR缓冲液方法进行了比较。每种方法在PCR步骤前所需的预估时间以红色文字标出。Thermo Scientific Direct PCR 方法在PCR前的样品制备仅需0–4分钟。在每种方法下方列出了所消耗的试剂。与其它方法相比，Thermo Scientific Direct PCR 方法消耗的试剂最少。 点击此处查看高清大图。
讨论
本文展示的直接 PCR 方法能够直接从小量未纯化的样品中进行 PCR 扩增，从而缩短所需时间，并简化植物和动物基因分型的工作流程（图7）。本文还展示了稀释法与直接 PCR 方法联合使用的方式（图3）。对于难以处理的样品（例如 老化植物叶片、含有干扰化合物的植物物种）或扩增较长片段（或富含 GC 的片段）时，建议采用该稀释法。在启动新的直接 PCR 实验时，该方法尤为有用，有助于优化反应条件。该方法可作为解决偶发性问题的工具，例如因组织材料和/或所用引物不同而导致的扩增产物产量较低的问题。此外，在对同一样品进行多个反应时，使用稀释法可确保不会在单个反应中耗尽全部样品。
为了从植物中纯化用于PCR的DNA，传统方法是先进行细胞裂解，然后使用多种可能干扰PCR分析的组分来分离DNA8。对于多酚含量较高的难处理植物，传统上会添加聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone），以去除细胞裂解后与DNA结合的化合物2,5。如本研究所示，通过使用Phire Plant Direct PCR试剂盒检测目标DNA，可以避免这些复杂且耗时的操作步骤。利用灵敏的dCAPS技术，可直接从Arabidopsis植物叶片中扩增DNA，无需进行细胞裂解和DNA分离步骤（图2）。本研究结果表明，稀释方案能有效控制可能干扰PCR反应的干扰物质的存在（图3）。
传统上，动物基因分型的前提是从动物组织中分离基因组DNA，该过程具有毒性且耗时，通常需要长时间孵育蛋白酶K以消化皮肤和结缔组织，随后进行有机溶剂抽提、酒精沉淀和离心等步骤6,9,10。如本文所示，通过使用Phire动物组织直接PCR试剂盒可简化该流程，从而无需预先纯化DNA即可对转基因小鼠进行基因分型（图4）。本文展示的示例尤为困难，因为仅使用了一对引物来扩增两个大小差异显著的片段。尽管该方案本身具有较高难度，但结合简单的稀释步骤采用直接PCR方法，仍成功获得了两种PCR产物的高产量（图4）。
基于PCR的靶标DNA检测在研究中具有多种应用，包括基因型分析，以确定基因在发育、生理和疾病中的作用。由于特殊DNA聚合酶对抑制剂的耐受性，该实验方案可在无需预先纯化DNA的情况下快速完成。
披露
本文的制作和免费访问由赛默飞世尔科技公司赞助。
致谢
对于 拟南芥 我们感谢赫尔辛基大学生物科学系植物生物学专业植物应激研究组的Jaakko Kangasjärvi教授及其团队提供的样品和相关PCR引物。传统方法的实验由Airi Lamminmäki女士完成。
转基因小鼠样本由赫尔辛基大学生物医学/生物化学研究所的 Dr. Jaana Vesterinen 提供。
Harris Uni-Core 和 Harris Cutting Mat 是 Shunderson Communications Inc. 的商标。所有其他商标均为赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific Inc.）及其子公司的财产。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Phire 植物直接 PCR 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 次反应（每次 50 μl） |
| Phire 动物组织直接 PCR 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 次反应（每次 50 μl） |
| Harris Uni-Core 0.35 mm（粉色） | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | 数量：5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm（蓝色） | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | 数量：5/25 |
| Harris 切割垫 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | 数量：5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl（100 次反应） |
| Piko 24 孔梯度 PCR 仪 | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24 孔 Piko PCR 板 | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR 纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 | 50 次纯化 250 次纯化 |
参考文献
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