Summary
Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.
Abstract
Animais provar o ambiente à sua volta odorous através dos sistemas chemosensory localizados na cavidade nasal. Sinais chemosensory afetar comportamentos complexos como a escolha alimentar, predador, conspecific e reconhecimento mate e outras pistas socialmente relevantes. Neurônios receptores olfativos (ORNs) estão localizados na parte dorsal da cavidade nasal embutido no epitélio olfativo. Esses neurônios bipolares enviar um axônio para o bulbo olfatório (ver fig. 1, Reisert & Zhao 1, publicada originalmente no Jornal de Fisiologia Geral) e estender um único dendrito da fronteira epitelial de onde irradiam os cílios no muco que cobre o olfativo epitélio. Os cílios contêm o mecanismo de transdução de sinal que conduz finalmente à excitatórios influxo de corrente através dos canais de transdução ciliares, um nucleotídeo cíclico-gated canal (CNG) e um Ca 2 +-activated Cl - canal (Fig. 1). O que se seguiu depolarization desencadeia geração do potencial de ação no corpo celular 2-4.
Neste vídeo, descrevemos o uso da "técnica da pipeta de aspiração" para gravar odorante respostas induzidas a partir de ORNs. Este método foi desenvolvido originalmente para gravar de bastonetes 5 e uma variante deste método pode ser encontrado em jove.com modificado para gravar a partir de fotorreceptores de rato cone 6. A técnica da pipeta de sucção foi mais tarde adaptado para gravar também a partir ORNs 7,8. Resumidamente, após a dissociação do epitélio olfactivo e isolamento de células, o corpo de célula inteira de um ORN é sugado para dentro da ponta de uma pipeta de gravação. O dendrite e dos cílios permanecer exposta à solução do banho e, portanto, acessível a solução muda para permitir, por exemplo odorante ou bloqueador aplicação farmacológica. Nesta configuração, não têm acesso ao ambiente intracelular é obtida (sem fixador de tensão de célula inteira) e a tensão intracelular é livre de variar. Isso tudouxos a gravação simultânea do atual receptor lento que se origina na cílios e potenciais de ação rápidos disparados pelo corpo celular 9. A diferença na cinética entre estes dois sinais permite que eles sejam separados utilizando diferentes configurações de filtro. Esta técnica pode ser utilizada em qualquer tipo selvagem ou de rato knockout ou para gravar selectivamente a partir de ORNs que também expressam GFP para rotular subconjuntos específicos de ORNs, por exemplo, expressando um receptor de odorante dado ou canal iónico.
Protocol
1. A configuração de gravação
A câmara de gravação é montada num microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U com óptica de contraste de fase, que é montado em uma mesa de ar e electricamente blindado utilizando uma gaiola de Faraday. A câmara de Plexiglass gravação é composto por duas secções parcialmente separados por uma barreira e coladas sobre uma lâmina de vidro silanizado. Uma secção da câmara é usado para resolver as células, enquanto o outro é usado para o estímulo-exposição, durante a gravação de minimizar a exposição do prematuro resolvido, mas ainda não utilizadas células de odorante. A configuração de gravação é composto por uma pipeta de aspiração (ver abaixo) montado num suporte de pipeta sedimentadas e um eléctrodo de terra. A pipeta de sucção está posicionada usando um micromanipulador. Soluções de estímulo são aplicadas usando um triplo-barril tubo quadrado de vidro, com cada tubo quadrado de 0,7 mm x 0,7 mm. O vidro triplo tambor foi ligado a um sistema de perfusão rápida motorizada passo montado num manipulador (Sutter SF-77B, Warner Instruments) e entrou na câmara de registo com um ângulo de 45 °. A extremidade do cano de vidro triplo foi biselado com um ângulo de 45 °, novamente de tal forma que a face final (abertura) do vidro triplo barril era vertical para permitir o posicionamento final da pipeta.
O eléctrodo da pipeta de aspiração cheia com solução de Ringer de mamífero padrão e do eléctrodo de terra estão ligados ao andar de entrada GΩ 1 de um amplificador de patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) no modo de fixação de tensão. O sinal analógico do amplificador (de baixa passagem filtrada a 5 kHz) é mostrado em um osciloscópio digital para controlar o sinal em tempo real e também ligado a um 8 pólos do filtro de Bessel (Krohn-Hite), onde o sinal é filtrado passa baixo a 50 Hz. Ambos os sinais de baixa passagem (filtrado a 5 kHz e 50 Hz) são transmitidos a um conversor A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401), que está ligado a um computador de aquisição de dados. Os dados são gravados usando Sinal 3 ACQuisition software (Cambridge Electronic Design) a uma frequência de amostragem de 10 kHz. O sinal é registado nas duas diferentes larguras de banda para gravar primeiro o receptor actual, juntamente com os potenciais de acção sobrepostas e em seguida o receptor actual sozinho (ver Fig. 2.). O sistema de perfusão é usada para comutar rapidamente entre solução de Ringer (controle) e estímulos olfativos ou qualquer solução de composição desejada e é controlado por um PC e software de sinal 3. As soluções estão contidos em seringas de 60 ml e a taxa de fluxo é controlado pelo médico de grau de regulação de caudal intravenosos. Tipicamente, a taxa de fluxo é definida como 1 ml / min.
A sucção na pipeta de gravação é controlada da seguinte maneira: A porta lateral do suporte da pipeta está ligado a uma linha de óleo, o qual por sua vez está ligado a um reservatório de óleo de altura ajustável. Elevando ou baixando o reservatório assegura que a pressão e, portanto, o fluxo de pipeta Ringer através da ponta do pipette é mínima e ligeiramente positivo. Sucção adicional ou a pressão pode ser aplicada por meio de um tubo ligado ao espaço aéreo de o reservatório, com um bocal na outra extremidade para sugar o corpo celular de um ORN isolado dentro da ponta da pipeta a gravação.
Os experimentos são realizados a 37 ° C, a fim de simular de perto o estado nativo fisiológico da célula. A temperatura é controlada por passagem das soluções através de uma unidade de aquecimento feito por medida, que consiste em resistências de cerâmica através dos quais os tubos de aço inoxidável, contendo as soluções são passados 10. A temperatura é monitorizada utilizando um termómetro de termopar (Fluke).
2. Soluções
Solução de Ringer de mamífero de (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 de EDTA, 10 mM de HEPES, 10 glucose. O pH foi ajustado para 7,5 com NaOH. A 10% de solução de Ringer diluída foi usado para medir a corrente de junção. Odorant soluções: acetofenona e eugenol foram preparados diariamente em solução de Ringer a partir de 20 mM stocks em DMSO.
3. Fazendo Eletrodos
- Coloque um vidro de borosilicato unfilamented capilar em um P-97 Sutter extrator micropipeta e puxe uma micropipeta com uma vela longa.
- Transfira a pipeta a um detentor micropipeta feito por medida montado num microscópio Nikon Eclipse E200, que é, por sua vez equipado com um retículo na ocular e uma faca de diamante montado móvel no palco.
- Observar a ponta da pipeta com a objectiva de 20x e utilizando o retículo de guia; escriba suavemente a pipeta com um ângulo de 90 ° com a faca de diamante feito à medida em que a pipeta é de 10 um de largura (diâmetro externo).
- Mover a faca de diamante mais em direcção à ponta e gradualmente aplicar pressão sobre a ponta da faca de diamante. A ponta de pipeta deve quebrar limpa no ponto em que foi descrito.
Alternativamente os passos 3.1 a3,4 podem ser combinados e pode ser puxada para pipetas com as dimensões desejadas directamente sem ter de cortar a ponta da pipeta, embora possa revelar difícil de puxar de modo fiável com pipetas de tal diâmetro da ponta de uma grande e arestas cortadas de forma limpa.
- Sob uma objectiva de 40x, o fogo polir a ponta da pipeta para um diâmetro interno de 5 mm, utilizando um filamento de aquecimento eléctrico. Uma vez terminado, a micropipeta está pronto a ser utilizado para a gravação de correntes de ORNs rato. A resistência pipeta aberto deve ser em torno de 1 M quando cheio de Ringer.
4. Isolamento de neurônios receptores olfativos
- Sacrificar um mouse seguindo diretrizes institucionais e regulamentos. Retire a cabeça, retire a pele que cobre o crânio e medialmente bisect a cabeça ao longo da linha média.
- Coloque os dois hemi-cabeças sob um estereomicroscópio de dissecação, retirar o septo nasal e remover os cornetos olfativos. Coloque todos os tecidos em uma caixa de Petri com c glucoseontaining solução de Ringer de mamífero.
- Descascar o epitélio olfactivo fora a cartilagem subjacente, a partir de duas conchas e transferir o tecido para dentro de um tubo de Eppendorf contendo 250 uL de Ringer. Usamos o tecido a partir de duas conchas para obter a densidade de células para a direita para o tamanho da nossa câmara de gravação. Armazenar o tecido restante a 4 ° C para uso posterior.
- Vortex tubo Eppendorf contendo o epitélio olfactivo brevemente duas vezes durante 1 segundo a uma velocidade média. Esta etapa conduz à dissociação mecânica dos ORNs do epitélio.
- Colocar a solução de Ringer que contém os ORNs dissociados na câmara de gravação. Remover grandes pedaços de tecido, também presentes na suspensão utilizando fórceps finos.
- Deixe os ORNs contentar com 20 min antes de começar superfusão contínua com campainha e avançar para as gravações.
5. Gravações
- Reduzir o eléctrodo de sucção ligada à linha de óleo para a câmara de registo e regulComeram a altura do reservatório de óleo para estabelecer uma pressão ligeiramente positiva na ponta da pipeta. Isto pode ser feito por meio da observação restos celulares por exemplo, afastando-se (pressão positiva), ou no sentido (pressão negativa) da pipeta. Tente não contaminar a ponta da pipeta com restos celulares.
- Digitalizar a câmara de registo para uma ORN isolado que pode ser reconhecido pela sua morfologia bipolar típica utilizando uma ampliação de 20-40x. Mova o eletrodo de registro na proximidade do corpo celular ORN. Começar a chupar suavemente, de modo que o corpo da célula entra na ponta da pipeta. Cuidadosa e lentamente continuar a aplicar sucção enquanto o corpo da célula inteira é arrastado para a ponta da pipeta de aspiração, saindo da dendrite e cílios exposta à solução do banho. Para imagens de ORNs sugado e formas de pipetas ver 7,11. Certifique-se de que uma vez que não é aplicada sucção, o ORN não se move dentro ou para fora da pipeta. Se for assim, ajustar a altura do reservatório de óleo de acordo.
- Usando omicromanipuladores, mover a pipeta de aspiração a partir da secção que contém os ORNs estabeleceram para a secção de gravação da câmara. Coloque cuidadosamente a pipeta de aspiração em frente do tubo 3 de cano para a troca da solução. A pipeta de aspiração deve ser colocada suficientemente próxima da abertura do tubo 3 de cano, de modo que a ORN está exposto a um fluxo laminar, evitando assim a turbulência de mistura e para alcançar permuta solução rápida. A troca solução é conseguida através de um reforço da interface entre correntes paralelas de solução que flui através da ponta da pipeta de aspiração. O curso de tempo da troca solução é, tipicamente, de cerca de 20 ms, a corrente medida a partir da junção evocada por pisar a célula entre as soluções de composição iónica diferente (ver Fig. 2.). As soluções são fornecidas por gravidade.
6. Resultados representativos
Figura 1.) A neurônios receptores bipolares no bulbo olfativo. B) As máquinas de sinal de transdução, em última análise, os cílios excitatórios conduz a corrente de influxo. A despolarização provoca consequente geração do potencial de acção no corpo celular.
A Figura 2 mostra a velocidade e a fiabilidade da troca da solução. A pipeta foi em degraus do normal em 10% Ringer diluída para 100 ms e a corrente de junção resultante da concentração do ião dissimilar foi gravado. Traço preto é a averaiva de cinco ensaios, vermelho traçar seu SD. A pequena alteração em SD durante a troca de solução demonstra a fiabilidade de troca de solução de teste para teste e a falta de excesso de ruído em qualquer fluxo de solução.
A Figura 3 mostra uma resposta eugenol induzida a partir de um ORN usando a técnica da pipeta de aspiração. A ORN foi exposto a 100 uM eugenol durante 1 segundo, como indicado pela barra acima do gravação. Na fig. 3A (preto traço) a corrente do receptor foi filtrada a uma largura de banda de 0-50 Hz para exibir apenas o receptor actual Fig.. 3B mostra a mesma gravação, filtrado agora no grande largura de banda de 0 - 5000 Hz (vermelho traço) também exibem potenciais de acção (APs, indicada por setas). A inserção mostra o traçado de uma mesma escala de tempo expandida para visualizar os APs de forma mais clara no início da resposta.
![Figura 4.]("files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg)
Figura 4. Família Dose-resposta de um ORN eugenol-responsive (A). Eugenol foi utilizada em concentrações variando desde 0,3 uM a 100 uM, a duração do estímulo foi de 1 s e vestígios foram filtradas a 0 - 50 Hz. Um aumento progressivo da concentração odorante conduziu a uma resposta maior e mais rápido, que também mais lentamente uma vez terminada a exposição odorante foi terminada.
ORNs pode exibir um padrão de resposta oscilatória durante estimulações longas, em concentrações odorant intermédios (Fig. 4B). Aqui um acetephenone ORN (3 uM) responsivo foi estimulado durante 8 segundos. Depois de uma resposta rápida e transiente de pico no início da estimulação de uma série de pequenas, as respostas recorrentes são observados. A largura de banda de gravação foi de 0 - 50 Hz.
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Discussion
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH DC009613, o Programa de Ciências Humanas Fronteiras e um Morley Cuidados Fellowship (a JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
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