Summary
Una herramienta útil para analizar los efectos de las drogas, factores de crecimiento y células manipuladas en un modelo animal de reparación de la herida se describe. Esta técnica utiliza las propiedades de un alcohol polivinílico (PVA) esponja para entregar y contener el tratamiento deseado y también proporcionar una plataforma para ser extirpado y analizado.
Abstract
La cicatrización de heridas es un proceso complicado, de múltiples pasos que implica muchos tipos de células, factores de crecimiento y compuestos 1-3. Debido a esta complejidad, los estudios de cicatrización de la herida son más completa cuando se lleva a cabo in vivo. Hay muchos modelos in vivo disponibles para estudiar la curación de las heridas agudas, incluyendo la incisión, el espacio de escisión, muerto, y quemaduras. Modelos muertas espaciales son los implantes artificiales, porosas que se utilizan para estudiar la formación de tejido y los efectos de las sustancias en la herida. Algunos de los modelos espaciales comúnmente usados incluyen muertas de alcohol polivinílico (PVA) esponjas, cilindros de acero de malla de alambre, los materiales expandido politetrafluoroetileno (PTFE), y el 1,2 Cellstick.
Cada modelo de espacio muerto tiene sus propias limitaciones basadas en la composición de su material y la implantación de métodos. La malla de alambre de acero modelo cilindro tiene una fase de retardo de infiltración después de la implantación y requiere una cantidad de tiempo largo antes de la granulación formación Begi tejidons 1. Las etapas posteriores de la curación de heridas se analizan mejor con los modelos de 1,4 ePTFE. El Cellstick es una esponja de celulosa dentro de un modelo de tubo de silicona que se utiliza típicamente para el estudio de las heridas humanos cirugía y herir fluido 2. La esponja de PVA se limita a los estudios de toxicidad aguda, porque con el tiempo se empieza a provocar una respuesta de cuerpo extraño que provoca una reacción de células gigantes en el animal 5. A diferencia de otros materiales, esponjas de PVA son fáciles de insertar y quitar, hechos de materiales inertes y no biodegradables y sin embargo son lo suficientemente suave para ser seccionada para el análisis histológico 2,5.
En la cicatrización de heridas de la esponja de PVA es muy útil para analizar la formación de tejido de granulación, el depósito de colágeno, la composición del fluido de la herida, y los efectos de las sustancias en el proceso de curación 1,2,5. Además de su uso en el estudio de una amplia gama de atributos de la curación de heridas, la esponja de PVA se ha utilizado también en muchos otros tipos de estudios. Se hcomo se ha utilizado para investigar la angiogénesis tumoral, la administración de fármacos y la supervivencia del injerto de células madre y 1,2,6,7. Con su gran alterabilidad, el uso previo extenso, con resultados reproducibles, la esponja de PVA es un modelo ideal para el 1,2 muchos estudios.
Aquí, vamos a describir la elaboración, implantación y recuperación de discos de esponja de PVA (Figura 1) en un modelo murino de la cicatrización de heridas.
Protocol
1. Preparación Esponja
- Esponjas Hidratacion por agitación durante la noche en 0,9% (w / v) de solución acuosa de cloruro sódico.
- Esterilizar esponjas hidratados en autoclave ellos. Para 75 ml, autoclave durante 25 minutos a 121 ° C.
Nota: esponjas de carga con un tratamiento como se describe a continuación es opcional.
- En una campana estéril con instrumentos estériles, recoger una esponja de la solución con unas pinzas. Exprimir la esponja con las pinzas y utilizar una punta de vacío para eliminar la solución tanto como sea posible de la esponja. Coloque la esponja exprimida en una placa de cultivo de tejidos, teniendo cuidado de dejar espacio entre las esponjas. Múltiples placas se puede utilizar para separar los diferentes tratamientos.
- Pipetear la solución de tratamiento directamente sobre el centro de una esponja. Presione suavemente sobre la esponja con la punta de la pipeta después la solución se ha colocado en la esponja, lo que ayuda la esponja absorben la solución. Nota: El 6mmde diámetro por 2.75 mm de espesor, las esponjas que empleamos son capaces de mantener un máximo de 25 l.
- Una vez que todas las esponjas se cargan, la placa están en puede ser almacenado en hielo hasta que se implantan en el ratón.
2. Procedimiento Quirúrgico
- Apropiadamente anestesiar a los animales y la administración preventiva de analgésicos. Todo el procedimiento dura aproximadamente 20 minutos por animal. Por unos 30 g de ratón 1,5 litros por minuto de oxígeno con 1,5% de isoflurano se utiliza para inducir y mantener la anestesia. Cuando los animales ya no es sensible a la prueba de reflejo de apuro, lugar en el cono de la nariz en posición supina. Use una rasuradora eléctrica para afeitarse de 1 pulgada por 1 pulgada área en la parte inferior ventral por debajo de la caja torácica. Limpie de corte de pelo.
- Esterilizar la zona afeitada por limpieza con betadina seguido por 70% de alcohol. Repita esta limpieza betadine, alcohol tres veces.
- Mientras mantiene la piel enseña, utiliza el bisturí para realizar una incisión vertical 1,5-2 veces el diámetrometros de las esponjas que se inserta, teniendo cuidado de no cortar a través de la cavidad del cuerpo.
- Utilizar una pinza para sujetar el borde de la piel y lentamente comenzar a separar la piel del músculo en ambos lados de la incisión utilizando tijeras Metzembaum. El bolsillo debe ir a lo ancho del ratón y de la caja torácica de las patas traseras.
- Use unas pinzas para recoger la esponja primero para ser colocado en el animal por pellizcándola de los lados. Transferir la esponja para unas pinzas rectas de modo que se mantiene desde la parte superior e inferior.
- Use pinzas para sujetar el borde de la piel y levantar de manera que la esponja se puede insertar. Introduzca lentamente la esponja tratando de evitar el contacto con la piel o el músculo debajo, como la esponja será difícil de mover, una vez que éste haya tocado el tejido. Repita el procedimiento para todas las esponjas.
- Una vez que todas las esponjas se han insertado, el lugar dos o tres suturas para cerrar la incisión. Utilice un par de pinzas para sujetar ambos lados de la incisión juntos y enhebrar la Sutuvolver a través de ambas capas de piel. Apriete el primer tiro lo suficiente como para cerrar los bordes de la piel. Termina el nudo cuadrado, con un mayor distancia de la otra dirección, esta vez tirando del nudo. Luego atar dos nudos más cuadrados para terminar la sutura (Figura 2). Coloque suturas adicionales para cerrar la incisión entero. Otros métodos de unión de la herida puede ser utilizado como Dermabond, los clips de la herida, o grapas.
- Retirar los animales de un sistema de seguimiento de la anestesia y mientras que la conciencia se reanuda. Animal debe comenzar rápidamente y volver a deambular antes de la operación la movilidad. Asegurarse de que son capaces de alcanzar suficiente alimento y agua. Algunos alimentos humedecido puede ser colocado en la parte inferior de la jaula para ayudar en la recuperación. Continúe controlando los animales diariamente para detectar signos de angustia o malestar, y comprobar el sitio de la incisión para la infección, la inflamación y la dehiscencia. Tome las medidas oportunas si alguna complicación a la recuperación se encuentran.
3. Inyección opcional
- Para inyectar la esponja con una solución deseada, primero determinar la cantidad de la sustancia para administrar al ratón. La sustancia tiene que estar concentrados para que el volumen de inyección es menor que la mitad del volumen total de la esponja puede contener.
- Preparar una jeringa para la inyección (para los ratones que usamos una aguja 28 G).
- Colocar el animal para recibir las inyecciones bajo anestesia.
- Cuando el animal ya no responde a la prueba del pellizco de la inyección se puede dar.
- Para dar a la inyección de introducir la aguja en un ángulo de 45 ° a fondo la piel en el centro de la esponja. A continuación, introduzca la aguja en la esponja sólo se va a mitad de caminoa través de su espesor. El objetivo consiste en inyectar en el centro exacto de la esponja.
- Para comprobar para asegurarse de que la aguja está en la esponja, levante lentamente la aguja en posición vertical. Si la aguja está en la esponja, la esponja debe moverse hacia arriba con la aguja.
- Poco a poco se inyecta en la esponja y retire la aguja. Si hay esponjas múltiples que requieren inyecciones es posible que parte del líquido inyectado será empujado fuera de los sitios anteriores de inyección.
4. Esponja de eliminación
Nota: Durante el retiro de las esponjas, manejar la esponja con mucha precaución. Evitar penetrar la esponja con los instrumentos quirúrgicos y evitar el sangrado excesivo en la esponja, evitando las arterias principales en todo el tejido circundante.
- Después de que el animal es sacrificado, retire la esponja mediante la celebración de la piel con unas pinzas y hacer una incisión cerca de la esponja.
- Separar cuidadosamente las esponjas de la cápsula que rodea un ª evitar la cosecha tejido extra que rodea a la esponja. Para los ensayos, tales como la administración de fármacos o la morfometría, menos precisión se requiere para la escisión.
5. Los resultados representativos
Esponjas eliminados pueden ser almacenadas bajo condiciones diferentes dependiendo del tipo de análisis que se realiza. Para el corte, las esponjas recuperados se pueden incrustar en un medio para la congelación como la temperatura óptima de corte (octubre) compuesto o colocado en formol al 10% para la inclusión y corte en bloques de parafina (Figura 3 A y B). Los mejores resultados para seccionar se obtienen cuando la esponja se corta por la mitad a través del diámetro y embebidos cortado superficie hacia abajo (Figura 4A y B). Las secciones de la esponja debe tomarse de modo que todo lo ancho de la esponja está presente. Figura 3A muestra dos esponjas, la esponja izquierda se ha incrustado / seccionada incorrectamente y la esponja derecho fue procesada correctamente.
ent "> Para el análisis, esponjas pueden ser colocados en un tubo Eppendorf y se almacenó a -20 ° C hasta que esté listo para su procesamiento para el ARN y cuantitativos en tiempo real esponjas análisis de PCR debe ser colocado en un tubo Eppendorf, flash congelado y almacenado a. - 80 ° C. Además, un conservante ARN, tales como RNAlater de QIAGEN, se puede utilizar para estabilizar el ARN para el almacenamiento seguro a temperaturas más altas. fluido de la herida puede ser recogida por exprimir las esponjas en un tubo, y reuniendo el fluido desde Esponjas múltiples para obtener una muestra representativa. células vivas, como fibroblastos, macrófagos y linfocitos, también se puede extraer de las esponjas. Después de la retirada del animal, esponjas pueden ser lugar en un medio apropiado para el tipo deseado de células. esponjas pueden ser procesada para liberar las células por física (es decir picado) o enzimática (es decir, colagenasa) métodos.
Figura 1. Deshidrataciónted PVA esponja discos en tres tamaños diferentes.
Figura 2. Imagen de ratón de cicatrización de heridas modelo que muestra la posición de la herida lateral y cuatro esponjas de PVA.
Figura 3. (A) tinción H & E a 4x y (B) tinción tricrómica a 10x de esponjas embebidas en parafina de sección.
Figura 4. (A) Imagen de la corte de esponja en la mitad a lo largo del diámetro. (B) PVA medio esponja, incrustado en el lado cortado hacia abajo octubre
Discussion
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención R01-HL088424; Veteranos premio al mérito de Asuntos de PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
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