Summary
mesothelial निकासी परख यहाँ वर्णित fluorescently लेबल कोशिकाओं और समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए कल्पना और मात्रात्मक डिम्बग्रंथि के कैंसर के multicellular spheroids और mesothelial सेल monolayers की बातचीत को मापने का लाभ लेता है. इस परख डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरणों मॉडल.
Protocol
1. डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल उपगोल गठन
- आरएफपी व्यक्त डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को 10% बेस मध्यम (एक कस्टम सेल संस्कृति माध्यम युक्त 199 और MCDB105 के 50:50 मिश्रण है, 10% निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% कलम strep) में सभ्य हैं. Unlabeled डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं में आरएफपी व्यक्त एक प्लाज्मिड युक्त आरएफपी के साथ कोशिकाओं transfect और आरएफपी व्यक्त की कोशिकाओं के लिए चुनें. वैकल्पिक रूप से, वायरल vectors transiently फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या कोशिकाओं के साथ एक लाल फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर डाई (Invitrogen) पूर्व सेते हैं हो सकता है.
- डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids के गठन से पहले, यह आवश्यक है कि कम आसंजन 96 अच्छी तरह गोल तल संस्कृति व्यंजन तैयार है. कम आसंजन संस्कृति प्लेटों का उत्पादन, पाली - हेमा समाधान (1 मिलीग्राम 95% EtOH में 6mg polyhydroxyethylmethacrylate) 30μl एक साथ 96 Corning सेल संस्कृति पकवान की हर अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है. 96 अच्छी तरह प्लेटें डिग्री सेल्सियस गैर humidified इनक्यूबेटर इथेनॉल, मैं लुप्त हो जाना करने के लिए 37 में incubated हैंपाली - हेमा की एक अच्छी तरह पर एक फिल्म eaving. पाली - हेमा इस फिल्म अच्छी तरह से नीचे करने के लिए संलग्न से कोशिकाओं को रोकता है, कोशिकाओं 18 निलंबन में विकसित करने के लिए मजबूर है. [वैकल्पिक रूप से, अल्ट्रा कम अनुलग्नक संस्कृति प्लेट (Corning) पाली - हेमा लेपित बर्तन के बदले इस्तेमाल किया जा सकता है.]
- कम आसंजन संस्कृति प्लेटों के बाद तैयार कर रहे हैं, डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को, गोली 900 आरसीएफ में 3 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र (Heraeus) में कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और 10% बेस के माध्यम से फिर से निलंबित एक थाली trypsinize के.
- कोशिकाओं गिनती hemocytometer का उपयोग.
- ऐसी है कि वहाँ 10% बेस मध्यम 100 50μl प्रति कोशिकाओं कोशिकाओं की एकाग्रता को समायोजित करें.
- 96 पाली - हेमा अच्छी तरह से लेपित संस्कृति पकवान की हर अच्छी तरह से करने के लिए समान रूप से निलंबित पतला सेल निलंबन की 50μl जोड़ें.
- 96 एक 37 डिग्री सेल्सियस 16 घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (समय की इस राशि या वृद्धि की जानी चाहिए और समय की राशि के लिए लेता है पर निर्भर करता है की कमी हुई अच्छी तरह से थाली सेते हैंएक विशेष सेल multicellular spheroids या वांछित प्रयोगात्मक शर्तों के) के रूप में क्लस्टर के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को एक साथ, एक अच्छी तरह में एक एकल multicellular उपगोल की अनुमति बनाने के लिए लाइन. कुछ ट्यूमर कोशिकाओं को इस अवधि के दौरान apoptosis से गुजरना है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए एक समय पूर्व apoptosis के शामिल होने के लिए चुन.
2. Mesothelial सेल monolayer गठन
- एक सेल संस्कृति हुड में एक 6 गिलास नीचे fibronectin साथ एक 5μg fibronectin / एमएल पीबीएस समाधान की 2ml पकवान की प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubating के द्वारा MatTek पकवान के कुओं पूर्व कोट. MatTek बर्तन में गिलास नीचे के ऑप्टिकल गुणवत्ता उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं.
- GFP-व्यक्त mesothelial कोशिकाओं के 10% बेस मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं. Trypsinize mesothelial कोशिकाओं की एक थाली, एक tabletop अपकेंद्रित्र (Heraeus) में नीचे 900RPM पर 3 मिनट के लिए स्पिन, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन), और 10% बेस मध्यम में फिर से निलंबित.mesothelial कोशिकाओं का यहां इस्तेमाल किया GFP पहले से ही व्यक्त किया गया जब वे प्राप्त किया गया, लेकिन unlabeled mesothelial कोशिकाओं एक प्लाज्मिड युक्त सीडीएनए GFP के साथ transfecting, या एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर डाई (Invitrogen) में preincubating कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जा सकता है.
- 30 मिनट fibronectin ऊष्मायन (2.1 कदम में) के बाद, 2ml पीबीएस के साथ MatTek पकवान के कुओं धो लो.
- पीबीएस और प्लेट x10 6 5 छह अच्छी तरह से MatTek पकवान की हर अच्छी तरह से में अच्छी तरह से प्रति mesothelial सेल महाप्राण (व्यंजन). एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति mesothelial कोशिकाओं पकवान करने के लिए संलग्न करने के लिए और एक monolayer के रूप में अनुमति देने के लिए रात भर इनक्यूबेटर में MatTek पकवान सेते हैं.
3. Mesothelial सेल क्लीयरेंस परख
- साथ 96 पाली - हेमा लेपित थाली से डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids इकट्ठा pipet का प्रयोग करें.
- 6 अच्छी तरह से MatTek mesothelial सेल monolayer युक्त पकवान की अच्छी तरह से एक से मध्यम महाप्राण (व्यंजन). 2ml पीबीएस के साथ एक बार धो लें. Spheroids के साथ 96 पी से सभी जोड़ेंMatTek पकवान (~ 3x संख्या spheroids कि spheroids लैंडिंग के लिए पकवान का हिस्सा है कि imaged किया जा सकता है पर खाते में imaged किया जा जा रहे हैं) एक अच्छी तरह से करने के लिए देर हो चुकी है.
- एक औंधा widefield प्रतिदीप्ति कम से कम 8 घंटे की अवधि के लिए समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने में सक्षम खुर्दबीन के मंच पर MatTek पकवान रखें. डिश में कई स्थानों छवि के लिए एक motorized मंच का उपयोग करने के लिए, कई उपगोल मध्यनिवेश घटनाओं के साथ एक ही प्रयोग में है. हम एकीकृत सिस्टम बिल्कुल सही फोकस और कम [20x 0.75 संख्यात्मक एपर्चर (एनए)] बढ़ाई / एनए अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के साथ एक Nikon तिवारी ई उलटा Motorized widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन समय चूक का उपयोग करें, 0.52 एनए साथ एक Nikon है हलोजन transilluminator लंबे समय तक काम दूरी (LWD) संघनित्र, Nikon (<स्विचन 100 millisecond) के तेजी से उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर (GFP पूर्व 480/40, एम 525/50, आरएफपी से mCherry पूर्व उन्हें 575/50 640/50), Sutter तेजी से संचरित और epifluorescence प्रकाश पथ स्मार्ट शटमंत्रियों, एक Nikon रैखिक इनकोडिंग मोटर मंच, एक ORCA एजी हमामात्सू आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा, तापमान और सीओ 2 नियंत्रण के साथ एक कस्टम निर्मित माइक्रोस्कोप ऊष्मायन कक्ष, Nikon एनआईएस - तत्वों ए.आर. सॉफ्टवेयर संस्करण 3 ठंडा, और एक टीएमसी कंपन अलगाव तालिका.
- डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल spheroids पकवान के नीचे बसा है और mesothelial सेल monolayer के लिए देते हैं जाएगा. 8 घंटे के लिए GFP, आरएफपी और 20 के चरण छवियाँ + बातचीत / उपगोल monolayer, हर 10 मिनट, ले लीजिए.
- आरएफपी व्यक्त डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका spheroids GFP-व्यक्त mesothelial सेल monolayer में एक छेद बनाने monolayer में आक्रमण करेंगे. 8 घंटे के बाद, GFP तत्वों सॉफ्टवेयर (या छवि जम्मू के रूप में एक और उपयुक्त सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर छवियों में ब्लैक होल के अनुरेखण द्वारा छेद के आकार को मापने. शून्य समय में इसी आरएफपी छवि में अंडाकार आकृति के आकार से 8 घंटे में छेद आकार को विभाजित करके प्रारंभिक उपगोल आकार के छेद के आकार के अनुसार. यह पूर्व मेंपर्याप्त, छेद आकार केवल एक बार मापा गया था, लेकिन यह आठ घंटे के प्रयोग के दौरान कई बार मापा जा सकता है के लिए बेहतर मध्यनिवेश की गतिशीलता को समझने.
4. प्रतिनिधि परिणाम
इस उदाहरण में, हम OVCA433 डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका spheroids कि Talin-1 की तनु अभिव्यक्ति के OVCA433 spheroids को नियंत्रित करने के लिए है के mesothelial निकासी की क्षमता की तुलना में. प्रत्येक समूह से OVCA433 spheroids एक MatTek ZT mesothelial सेल monolayers युक्त डिश के लिए जोड़ा गया था. प्रत्येक समूह से छह spheroids आठ घंटे के लिए हर 10 मिनट में (चित्रा 4, 3 मूवी, मूवी 4) imaged थे. monolayer में फैल spheroids द्वारा उत्पादित छेद मापा गया और प्रत्येक समूह से छह पदों औसतन गया. चित्रा 4 से पता चलता है कि औसत निकासी Talin 1 पछाड़ना spheroids द्वारा निर्मित क्षेत्र काफी औसत नियंत्रण spheroids द्वारा बनाया क्षेत्र से छोटा था, सुझाव है कि Talin हे mesothelial निकासी के लिए आवश्यक हैVCA433 डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids.
चित्रा 1 डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस. प्राथमिक डिम्बग्रंथि ट्यूमर या तो डिम्बग्रंथि सतह उपकला या फैलोपियन ट्यूब से विकसित. ट्यूमर कोशिकाओं / समूहों प्राथमिक ट्यूमर से दूर तोड़ने और peritoneal गह्वर में इकट्ठा. ट्यूमर कोशिकाओं तो multicellular spheroids के रूप में सकल कर सकते हैं. Spheroids तो mesothelial सेल peritoneal गुहा के अस्तर monolayers के लिए देते हैं. mesothelial कोशिकाओं संलग्न डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल नीचे से बाहर रखा गया है, spheroids अंतर्निहित तहखाने झिल्ली के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है.
मूवी डिम्बग्रंथि 1. कैंसर मेटास्टेसिस. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 2.
3 चित्रा mesothelial क्लीयरेंस परख. डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids 100 incubating के गठन कर रहे हैं आरएफपी एक पाली - हेमा लेपित 96 16 घंटे के लिए अच्छी तरह गोल नीचे 37 ° C पर संस्कृति डिश में डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति व्यक्त. पाली - हेमा संस्कृति डिश के लिए संलग्न से कोशिकाओं को रोकता है, कोशिकाओं को निलंबन में रहने के लिए और एक दूसरे का पालन करने के लिए एक एकल क्लस्टर प्रति अच्छी तरह से फार्म की अनुमति है. Mesothelial सेल monolayers हैं fibronectin लेपित 6 MatTek पकवान में अच्छी तरह से प्रति 5 6x10 mesothelial कोशिकाओं चढ़ाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली incubating के द्वारा तैयार हैं. spheroids mesothelial monolayer साथ तो MatTek पकवान और दो सेल आबादी 8 घंटे के लिए हर 10 मिनट में एक Nikon तिवारी ई मैं का उपयोग imaged किया जाता हैnverted Motorized widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन समय चूक और सॉफ्टवेयर तत्वों.
2 मूवी mesothelial क्लीयरेंस परख. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Talin OVCA433 spheroids में 1 अभिव्यक्ति की चित्रा 4. क्षीणन के mesothelial निकासी की क्षमता घट जाती है. साथ और 1 Talin की तनु अभिव्यक्ति के बिना OVCA433 spheroids (लाल) करने के लिए देते हैं और एक ZT mesothelial monolayer (हरा) में आक्रमण की अनुमति दी गई. दो सेल आबादी 8 घंटे के लिए हर 10 मिनट में एक Nikon तिवारी ई उलटा Motorized widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन समय चूक और तत्वों सॉफ्टवेयर का उपयोग imaged किया गया. ग्राफ कि एक क्षीणन Talin से पता चलता हैकाफी mesothelial सेल निकासी (quantile साजिश का मतलब है पर हरे रंग की सलाखों के साथ) कम हो जाती है.
मूवी 3. OVCA433 (लाल) spheroids mesothelial monolayer (हरा) में हमलावर. नियंत्रण फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Talin OVCA433 spheroids में 1 अभिव्यक्ति (लाल) की मूवी 4. क्षीणन mesothelial कम हो जाती है (हरा) निकासी क्षमता. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
"Mesothelial क्लीयरेंस परख" यहाँ प्रस्तुत समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है डिम्बग्रंथि के कैंसर के multicellular spheroids और mesothelial सेल monolayers की बातचीत पर नजर रखने के महान स्थानिक और लौकिक विस्तार में. इससे पहले, कई 8-14 समूहों endpoint के assays के लिए इस्तेमाल किया था दिखाने के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को देते हैं और mesothelial सेल monolayers में आक्रमण. इस परख में है कि यह fluorescently लेबल की कोशिकाओं का उपयोग करता है mesothelial कोशिकाओं से ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए, ताकि इन दोनों सेल आबादी की गतिशीलता परख भर में निगरानी रखी जा सकता है. अद्वितीय है मध्यनिवेश की प्रक्रिया वास्तविक समय में कल्पना किया जा सकता है और मात्रात्मक के mesothelial निकासी की दर समय पर मापा जा सकता है. timelapse माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के निकट दो विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत सेल आबादी के बीच बातचीत की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, या तो mesothelial कोशिकाओं या डिम्बग्रंथि के कैंसर CE के एक छोटा सा प्रतिशतआबादी के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी और LLS एक तिहाई फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जा सकता है. समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं पर नज़र रखने के द्वारा, और प्रवास के दिशात्मकता दर की गणना की जा सकती है. Mesothelial निकासी के उच्च संकल्प विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) इस्तेमाल किया जा सकता है. फोकल adhesions mesothelial कोशिकाओं में चिह्नित कर रहे हैं, यदि ट्यूमर कोशिकाओं उत्क्षेपणशील एक्सटेंशन द्वारा mesothelial adhesions की हदबंदी नजर रखी जा सकता है के रूप में हमारे पिछले 17 प्रकाशन में वर्णित है.
इस परख के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका spheroids कि आनुवंशिक या pharmacologically आणविक तंत्र द्वारा जो डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल spheroids mesothelial monolayer स्पष्ट करने के लिए या इस प्रक्रिया के छोटे अणु inhibitors की पहचान स्पष्ट करने के लिए संशोधित किया गया है की आक्रमण क्षमता की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, परख डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की एक बहुत छोटी संख्या की आवश्यकता है, तो प्राथमिक tumor द्रव exudates से कोशिकाओं (सीमाओं नीचे देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर cytotracker रंजक (Invitrogen) साथ कोशिकाओं preincubating के द्वारा लेबल. परख भी उच्च throughput विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है. उच्च throughput आनुवंशिक या औषधीय अध्ययन करने के लिए, डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को अलग siRNA को वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है या 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में विभिन्न औषधीय inhibitors के साथ इलाज किया. Mesothelial सेल monolayers साथ 96 गिलास नीचे संस्कृति बर्तन में चढ़ाया जा सकता है, और spheroids पाली - हेमा लेपित प्लेट से 1:1 किया जा सकता है में monolayer - युक्त प्लेट को हस्तांतरित. इन कदमों के सभी स्क्रीनिंग रोबोट के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि इतना siRNAs या inhibitors के सैकड़ों एक समय में जांच कर सकते हैं.
इस परख की ताकत का के mesothelial monolayer में डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की शक्ति पर निर्भर मध्यनिवेश मॉडल करने में सक्षम हो. हमारी प्रयोगशाला कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) का इस्तेमाल किया है कि क्या यांत्रिक के लिए निर्धारितRCE mesothelial निकासी 17 को नियंत्रित करता है. हमने पाया α5 Integrin कि overexpression fibronectin लेपित एक सब्सट्रेट पर चढ़ाया कोशिकाओं का संकुचन में वृद्धि हुई है, जबकि आरएनएआई की मध्यस्थता Talin, या मायोसिन द्वितीय की पछाड़ना कक्ष 17 सिकुड़ना कम है. डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका spheroids में α5 Integrin, Talin, या मायोसिन द्वितीय downregulation के बाद से भी mesothelial निकासी की कमी हुई, हमारे TFM माप विचार कि एक सेलुलर सिकुड़ा बलों पर निर्भर घटना में mesothelial निकासी, जो में उच्च सिकुड़ा बलों के साथ कोशिकाओं को अधिक mesothelial का कारण बना समर्थन निकासी. इसलिए, mesothelial निकासी परख करने के लिए आगे intercalation घटनाओं, डिम्बग्रंथि उपगोल मेटास्टेसिस के साथ जुड़े, कि यांत्रिक बलों पर निर्भर कर रहे हैं समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यह परख पर विचार करने के लिए कुछ सीमाएँ हैं. सबसे पहले, क्रम में multicellular spheroids के रूप में करने के लिए, कोशिकाओं को कम से कम 6 घंटे के लिए निलंबन में संवर्धित किया जाना चाहिए. अगरकोशिकाओं को मैट्रिक्स के बिना जीवित करने में असमर्थ संपर्क अपनी मंजूरी की क्षमता समझौता हो जाएगा रहे हैं. दूसरा, यह डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं है कि वर्दी, कॉम्पैक्ट multicellular spheroids फार्म का उपयोग करने के लिए फायदेमंद है. यदि डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को ही ढीला समूहों के रूप में, वे अलग mesothelial monolayer युक्त पकवान लेपित प्लेट polyHEMA से हस्तांतरण में तोड़, अलग आकृति और आकार कि परिवर्तनशीलता डेटा को जोड़ना होगा spheroids पैदा हो सकता है. तीसरा, अगर इस्तेमाल कोशिकाओं विषम हैं, यह अतिरिक्त परिवर्तनशीलता monolayer में बनाई गई छेद के आकार के लिए जोड़ देगा. यह एकाधिक दोहराने (10-20/sample) के आठ घंटे बाद मध्यनिवेश की हद तक में परिवर्तनशीलता के कारण कुओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. Assays में यहाँ वर्णित है, अच्छी तरह से स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर (OVCA433) और mesothelial (ZT) सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया. इस परख अधिक प्रासंगिक चिकित्सकीय, जलोदर द्रव से रोगियों के प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं, इस्तेमाल किया जा सकता है. यह determ दिलचस्प होगाine अगर इन विट्रो mesothelial सेल निकासी क्षमता में नैदानिक परिणाम के साथ संबद्ध है. इसके बाद के संस्करण की सीमाओं पर विचार करने के लिए जब प्राथमिक नमूनों का उपयोग विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, के रूप में प्राथमिक उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या एक सीमित कारक है. इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि इस परख प्रदर्शन से पहले mesothelial monolayer की अखंडता की जाँच करें. mesothelial monolayer की और तय किया जा सकता है सेल सेल जंक्शन प्रोटीन के लिए दाग करने के लिए सुनिश्चित करें कि mesothelial सेल जंक्शनों बरकरार हैं.
अंत में, mesothelial निकासी परख आसानी से विशिष्ट प्रयोगात्मक सवालों का जवाब करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. यहाँ, हम ईसीएम घटक है कि डिम्बग्रंथि और mesothelial कोशिकाओं गिलास नीचे संस्कृति बर्तन का पालन करने के लिए, तथापि, अन्य ईसीएम घटकों कोलेजन और laminin सहित इस्तेमाल किया जा सकता है की अनुमति देता है के रूप में fibronectin इस्तेमाल किया. इसके अलावा, अन्य कोशिका प्रकार है कि तहखाने झिल्ली fibroblasts सहित, के अंतर्गत पाया जाता है, इस प्रयोगात्मक व्यवस्था करने के लिए जोड़ा जा सकता है, भूमिका का आकलन करने के लिएmesothelial 9,19,20 निकासी में इन सेल प्रकार की. अन्त में, mesothelial कोशिकाओं (जैसे अग्नाशय, स्तन, आदि) के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अन्य प्रकार की बातचीत को भी इस परख का उपयोग कर मॉडलिंग किया जा सकता है. और यह कैंसर की कोशिकाओं और एक endothelial monolayer के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है, इस परख का उपयोग करने के लिए intravasation या तरल पदार्थ का स्त्राव (इसी तरह के assays में वर्णित किया गया है: 15,16,21-27) की नकल है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में Nikon इमेजिंग सेंटर, विशेष रूप से जेनिफर वाटर्स, से लारा Petrak और वेन्डी सामन, प्रशिक्षण के लिए और उनके timelapse सूक्ष्मदर्शी का उपयोग धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए रोजा एनजी और अचिम Besser धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम एनआईएच 5695837 अनुदान (एम. Iwanicki) के और GM064346 JSB द्वारा समर्थित किया गया था, डॉ. मरियम और शेल्डन जी Adelson मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन (JSB के लिए) से एक अनुदान द्वारा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 10082 | |
| Pen-Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15070 | |
| 96 well plates | Corning | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus Instruments | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek Corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Microscope | Nikon Instruments | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon Instruments | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon Instruments | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma Technology Corp. | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter Instrument Co. | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon Instruments | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | Custom Made | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon Instruments | Version 3 |
References
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