Summary
La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.
Abstract
La señalización se inicia a través del receptor de la célula T (TCR) cuando se acopla con fragmentos de péptidos antigénicos unidos por complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) las proteínas expresadas en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). El complejo TCR se compone del heterodímero ligando TCRαβ unión que asocia de forma no covalente con CD3 dímeros (los εδ y εγ heterodímeros y el homodímero ζζ) 1. Tras la participación del receptor, las cadenas ζ de CD3 se fosforilada por la quinasa de la familia Src, Lck. Esto conduce a la contratación de la familia Syk quinasa, Zap70, que luego se fosforila y activa por Lck. Después de eso, Zap70 fosforila el adaptador de proteínas LAT y SLP76, iniciando la formación del complejo de señalización proximal que contiene un gran número de diferentes moléculas de señalización 2.
La formación de este complejo, finalmente, los resultados en calcio y TRA Ras-dependientenscription activación de los factores y la iniciación consecuente de una compleja serie de programas de expresión de genes que dan lugar a la diferenciación de células T 2. Señales (TCR y el estado resultante de la diferenciación) son modulados por otros muchos factores, incluyendo la potencia del antígeno y la diafonía con co-stimulatory/co-inhibitory, quimiocinas y receptores de citoquinas 3-4. El estudio de la organización espacial y temporal del complejo de señalización proximal en condiciones de estimulación diferentes, por lo tanto, clave para entender la vía de señalización del TCR, así como su regulación por otras vías de señalización.
Uno de los sistemas modelo muy útil para estudiar la señalización iniciada por el TCR en la membrana plasmática de las células T es de cristal apoyados por bicapas de lípidos, como se describe anteriormente 5-6. Ellos pueden ser utilizados para presentar complejos antigénicos pMHC, adherencia, y moléculas co-estimuladoras a las células T-sirviendo como APCs artificiales. Por imágenes de las células T interactuar con elbicapa lipídica utilizando total de microscopía de fluorescencia interna reflexión (TIRFM), se puede restringir la excitación a 100 nm dentro del espacio existente entre el cristal y la superficie de la célula 7-8. Esto nos permite la imagen sobre todo los eventos de señalización que ocurren en la membrana plasmática. Como estamos interesados en la imagen de la contratación de las proteínas de señalización del complejo TCR, se describe una de dos cámaras TIRF sistema de imagen en la que el TCR, marcado con fluorescente de Fab (fragmento de unión del antígeno) fragmentos del anticuerpo H57 (purificada a partir de hibridoma H57-597 , ATCC, número ATCC: HB-218) que es específico para TCRβ, y proteínas de señalización, marcado con GFP, pueden tomarse imágenes simultáneamente y en tiempo real. Esta estrategia es necesaria debido a la naturaleza altamente dinámica tanto de las células T y de los eventos de señalización que se están produciendo en el TCR. Esta técnica de imagen ha permitido a los investigadores a los ligandos de imágenes individuales 9-11, así como el reclutamiento de moléculas de señalización de los receptores activados yes un excelente sistema para estudiar la bioquímica in situ 12-16.
Protocol
Procedimiento experimental:
1. Transfección con Amaxa ratón de células T nucleofector Kit
Se describe aquí la transfección de un ingenuo o in vitro, las células T activadas primaria con plásmidos de expresión que codifican moléculas de señalización marcados por las buenas prácticas agrarias, utilizando el ratón de células T Amaxa nucleofector kit. In vitro la activación de células T utilizando péptido-cargados APC esplénicas se realiza como se ha descrito antes 7. Todas las células T se utilizan en nuestros estudios expresar el TCR y que reconoce MCC péptido (88-103) unido a la molécula MHC es decir, K. La transfección se lleva a cabo esencialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, sin embargo, se presentan algunos consejos que promueven la viabilidad de las células T después de la transfección. Tanto la viabilidad y la eficacia de transfección es mucho mayor en in vitro las células T activadas que en las células no tratados previamente.
- Antes de comenzar, preparar 2 ml de medio suplementado células T mediante la adición de 20 l deambos componentes del medio A y B y 100 ul de suero fetal bovino (5%) para cada transfección a realizar. Equilibrar el medio en una placa de 12 pocillos en una humidificado 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante al menos una hora. Alternativamente, alícuotas de medio suplementado con 5% de suero y el componente A puede prepararse y almacenarse congelado. Si este es el caso, descongelar el número requerido de alícuotas, añadir el componente B, y realizar la equilibración.
- Pre-equilibrado del medio es muy importante, ya que la muerte celular será el resultado de la re-suspensión de células después de la transfección en medio que es frío o tiene un pH que no sea 7,2.
- A continuación, preparar la mezcla de transfección. Combinar 82 l de solución de ratón nucleofector de células T con 18 l de suplemento 2 y 5μg de ADN plásmido (concentración no inferior a 0,5 g / l). Mezclar bien tocando el tubo o con el uso de micro pipeta.
-Es importante realizar una titulación de dosis plásmido para un número fijo de células para cada construcción que se utilizará para la transfección. Para algunas construcciones más grandes, más ADN puede ser requerido. ADN debe estar libre de endotoxinas.
- Transferencia de 5 a 10 millones de células a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 600 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible con un aspirador de vacío.
- Los fabricantes recomiendan hacer girar las células en menos de 90x g, en nuestro caso, esta velocidad corresponde a 75x g. El elegido fuerza centrífuga relativa (FCR) para obtener un sedimento celular es quizás la variable más crucial, ya que la centrifugación a baja RCF se opone a los daños a la membrana celular.
- Vuelva a suspender el sedimento celular en la mezcla de transfección con suavidad y lentamente pipetear el sedimento celular hasta que no hay grandes grumos de células restantes. Normalmente, esto puede lograrse completamente aspirando las células Tediante la punta de la pipeta no más de 3-4 veces.
- Con una pipeta, transferir cuidadosamente la suspensión en una cubeta Amaxa certificada, asegurando que no hay burbujas presentes. Tapar la cubeta.
- Seleccione el programa nucleofector X-001 en el dispositivo nucleofector. Inserte la cubeta en el soporte de la cubeta nucleofector y aplicar el programa seleccionado.
- Después de electroporación de las células, lo mejor es inmediatamente la transferencia al medio de cultivo pre-equilibrio. Los fabricantes recomiendan que las células se mantienen en el medio nucleofector por no más de 15 minutos.
- Lleve la cubeta y la pre-equilibrio, medio totalmente completada la cultura a la campana. Utilizando la pipeta de plástico, y agregue aproximadamente 500 l del medio a la cubeta y transferir la suspensión de células al medio en la caída de la placa a gota.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 4 horas antes de imágenes. Células de los animales son incubadased a 30 ° C en lugar de 37 ° C. Esto ayuda a mantener su reactividad frente a antígeno.
- De tres a cuatro horas de incubación es generalmente suficiente para las células T para expresar las proteínas de la GFP detectable etiquetados. Elegimos a las células de imagen en este momento el tiempo debido a que el nivel de expresión es baja y los artefactos de la sobre-expresión debe reducirse al mínimo. Si la sobre-expresión de una proteína particular, se desea, sin embargo, las células T debe ser retirado del medio Amaxa después de 4 horas. Esto se logra de nuevo nodulizando las células a RCF baja y resuspender en preequilibrada medio de cultivo de células T suplementado con 50 U / ml de interleucina 2 (IL-2) a una densidad de 2 millones de células / ml.
2. TIRF de Microscopía
Descripción del microscopio TIRF:
- Generales de configuración: componentes ópticos fueron construidos alrededor de un microscopio de fluorescencia Olympus IX71 que originalmente estaba equipado con un módulo de Olympus TIRF. Pronto discovered efectos cromáticos en este módulo cuando un estado de alineación única no logró la colimación coincidentes para las líneas de láser de diferentes longitudes de onda. Este módulo, por lo tanto, no permitiría simultánea de imágenes TIRF con diferentes longitudes de onda de excitación, y nos dispusimos a construir un aparato de medida TIRF que minimice los efectos cromáticos en el sistema, como veremos en detalle en las secciones siguientes. El método aquí descrito fue desarrollado para la ampliación de 150 X, 1,45 apertura numérica (NA) TIRFM objetivo (Olimpo), pero funciona igual de bien para la ampliación de 60 X, versiones 1.45 NA. Para la iluminación de campo amplio, el microscopio está conectado a una fuente de luz de halogenuro metálico Lambda-XL y una rueda de filtros de excitación (Instrumentos Sutter) equipado con filtros de excitación. Para el posicionamiento automático de la etapa de la muestra con respecto al objetivo, el microscopio está equipado con una traducción motorizado XY, piezo-controlada Z etapa (ASI). Las imágenes se capturaron con dos idénticos QuAntem de electrones multiplicando (EM) cámaras CCD (Fotometría). El tamaño de píxel de las cámaras coincide muy bien con el aumento ofrecido por el objetivo de 150 X TIRF, dando una resolución final de 0,1 m por píxel. Las cámaras también ofrecen EMCCD la sensibilidad para visualizar las buenas prácticas agrarias transfectantes con bajo nivel de expresión.
- Láser: Para TIRF iluminación, un sistema de láser de 5 la entrega de un total de 6 líneas de láser (405 nm, 440, 488, 514, 561 y 640) se acopla a una fibra monomodo (Tecnologías de la Solamere). El láser de argón y 561 nm diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láser (líneas 488, 514 y 561) se encaminan a través de una fibra sintonizable óptico-acústico (AOTF) para el control de intensidad, mientras que la intensidad de los láseres de diodo (405, 440 y 640 nm) es controlada por la modulación de la tensión de sus fuentes de alimentación. La tensión en la AOTF y las fuentes de alimentación de los láseres de diodo es controlado a través de una tarjeta de adquisición de datos (CAD) junta (Medición Computación) utilizando el software MetaMorph (molelar dispositivos). La eficiencia de acoplamiento para los láseres de diodo es de 30%, mientras que las de los láseres de argón y DPSS son aproximadamente 60% debido a sus diámetros de haz más pequeñas.
- TIRF módulo: Con el fin de al mismo tiempo la imagen de la TCR y sus moléculas de señalización, según lo descrito anteriormente, era indispensable contar con la iluminación TIRF que fue corregido cromáticamente y que no requieren realineación o reenfoque en la adquisición de las emisiones de fluorescencia de diferentes longitudes de onda. TIRFM se logró utilizando través de-la-objetivo iluminación, como se ha descrito antes 17. El cable de fibra óptica que ofrece la luz del láser del microscopio fue asegurado en una lancha de fibra equipada con un soporte de fibra de XY montado sobre un riel óptico micrométrico impulsada por la Z de ajuste (Thorlabs). Para lograr TIRF iluminación, el rayo láser está enfocado en el plano focal posterior del objetivo utilizando un sistema de dos lentes (L1 (colimación lente) y L2 (lente de enfoque) en la Figura 1), de modo que el bEAM emerge colimado del objetivo. Esto asegura que todos los rayos de luz que sale del objetivo tendrá el mismo ángulo con respecto al plano de la muestra. La punta de la fibra óptica se coloca en el foco de la lente colimadora. Al mover el micrómetro a lo largo del carril óptico con respecto a la lente de colimación (dirección Z) es posible ajustar el enfoque del haz y mover la viga en posición X e Y utilizando los botones de ajuste XY. Debido a la abertura posterior muy pequeña del objetivo 150 X, hemos encontrado que para lograr TIRF, el tamaño del punto láser en el plano focal posterior necesaria para ser pequeña. Para lograr el enfoque necesario para producir el pequeño punto, las lentes de distancia focal corta eran necesarias (Keir Neumann, comunicación personal), de ahí, se utilizó una lente de enfoque con una longitud focal de aproximadamente 108 mm que se colocó en el cubo dicroico inmediatamente anterior el objetivo. La lente de colimación se colocó más cerca del divisor de haz que trajo a la TIRF iluminación. Para minimizar los efectos cromáticos deseados, hemos utilizado dobletes acromáticos (lente cromáticamente corregida hecha por fusionando elementos de lentes de dos hechos de materiales de diferentes índices de refracción) con recubrimientos antirreflectantes tanto para la colimación y lentes de enfoque (JML óptica). El enfoque puede ser verificada mediante la comprobación de que el haz colimado emerge fuera del objetivo cuando se encuentra en el centro de la abertura hacia atrás y deben formar un aprieto en el techo de la sala. La posición del punto enfocado se mueve entonces hacia el borde de la abertura (en la dirección Y), que hace que el haz para converger en el plano de imagen en ángulos grandes, y, finalmente, el ángulo crítico de reflexión total interna se logra. El uso de estos componentes ópticos, se logró la colimación simultánea para todas las longitudes de onda de 442 a 640 nm en la misma alineación. Una alineación óptica única, por lo tanto, nos ha permitido llevar a cabo TIRFM simultáneamente a través de múltiples longitudes de onda.
- Aparente de doble cámaraATUS: adquisición simultánea de la emisión de fluorescencia distinta derivada de dos fluoróforos diferentes se logró mediante la construcción de un sistema de doble cámara que se divide la emisión en dos rangos de longitudes de onda mediante el uso de espejos dicroicos (Figura 2). La luz emitida es reflejada desde el objetivo del puerto lado derecho del microscopio. Como la mayoría de los objetivos son corregidos al infinito (con imágenes formadas en el infinito), una lente de tubo se requiere para enfocar la imagen. Para manipular dos longitudes de onda de emisión de forma simultánea, la lente del tubo en el orificio lateral derecho se eliminó. Un adaptador personalizado que contiene c-mount temas (Sutter Instruments) fue unido y vinculado a un soporte de espejo dicroico (Edmund Optics). Espejos dicroicos que separan la emisión GFP de la de tintes orgánicos utilizados para etiquetar el TCR (Alexa546, Alexa647, etc) se instalaron en este soporte. Este módulo fue seguido en ambas trayectorias de luz por un tubo de soporte de la lente, un soporte de filtro de emisión y los tubos de extensión. LaLas lentes de tubo (TL1 y TL2 (Figura 2)) tiene una longitud focal de 180 mm. Las brechas en los tubos de extensión que conducen a las cámaras CCD EM fueron cubiertos con papel negro para proteger a las cámaras de la luz parásita. Para permitir la alineación de los dos canales, las cámaras fueron montadas en dos stands personalizados de traducción XYZ (Productos Holmarc).
A continuación se describe la forma de alinear el microscopio para obtener imágenes de dos canales simultáneos. Los pasos a seguir son la alineación de la iluminación TIRF, ajustando la potencia del láser, y la alineación de las dos imágenes de salida, utilizando sub-resolución de microesferas.
- Antes de comenzar, todos los componentes del microscopio están encendidos. El ordenador y el software se inició entonces y se garantiza que todos los componentes de hardware son reconocidos por el software.
- Para su uso como una norma co-localización, diluir 1 l de sub-resolución (0,2 micras) Fluoresbrite multi-microesferas fluorescentes en 2 ml de PBS y añadir 0,25 ml de la microesferasuspensión a cada pocillo de una II de Lab-Tek 8-bien cámaras sistema cubreobjetos (Nunc). Coloque el sistema de deslizamiento de cámara en la plataforma por encima del objetivo. Perlas que se adsorben a la copa se pone entonces en el foco.
- Uso de la alineación Y del lanzamiento fibra XYZ, la posición del haz de láser se mueve hacia el centro de la abertura posterior del objetivo. Es importante hacer esto cuando el objetivo está en la posición donde el plano de vidrio está en el foco. Si el haz no está colimado, el micrómetro Z se ajusta para lograr colimación completo. Colimación se prueba individualmente para todas las líneas de láser para ser utilizados en el experimento. En esta etapa, la potencia del láser para cada línea se mide utilizando un medidor de potencia del láser y se ajustó a 20-30 mW en cada canal.
-Las células T son extremadamente sensibles a la radiación láser, y la iluminación se limita a un total de 50 mW.
- Imágenes de las perlas se adquieren utilizando TIRF Illuminationes en el modo directo. Girar el micrómetro Y-alineación en el lanzamiento de fibra de modo que el haz comienza a moverse lejos del techo hasta su ángulo con respecto a los enfoques el objetivo de ejes ópticos 90 grados. Finalmente, cuando el ángulo crítico para la TIR se alcanza, la luz láser ya no salir del objetivo. Alineación TIRF se juzga centrándose arriba y hacia abajo a través del plano del cubreobjetos. Si perlas que están flotando en solución puede ser visualizado, entonces el ángulo del haz con respecto a las necesidades normales de objetivos que se aumentó aún más. En la correcta alineación TIRF, sólo un plano óptico estará en el foco (es decir, sólo las perlas que se adsorben a la cubreobjetos). Una prueba más fino de la alineación TIRF puede ser implementado cuando las imágenes de las células T teñidas con un colorante de superficie que se han extendido sobre una superficie. (Véase el punto 3.4).
- Después de iluminación TIRF se ha logrado, los dos canales pueden estar alineadas con respecto a la otra. Centrarse en las cuentas y compare la posición de icaracterísticas dentifiable en las imágenes producidas en ambos canales. Uso de la X y tornillos micrométricos Y en un soporte de la cámara, llevar la posición relativa de las perlas en la proximidad cercana posible. Guarde las imágenes de ambos canales. Estas imágenes se utiliza como un estándar co-localización para alinear los dos canales.
- Las cámaras también tienen que estar alineadas de modo que sean parafocal con respecto a otra. Esto se logra mediante la adquisición de un conjunto de imágenes de las perlas de sub-resolución que están separados unos de otros en la dirección Z por 100 nm. Si el píxel intensidad máxima para las perlas se encuentra en el mismo plano, tanto para las cámaras, entonces son parafocal.
3. Imágenes
Una vez que el microscopio está configurado, la siguiente tarea es preparar a los cámaras de flujo de vidrio que contienen el apoyo bicapas lipídicas que presentan las moléculas de antígeno y la adhesión a lo descrito previamente 6 y luego realizar TIRFM de las células T transfectadas que interactúan con elsustrato. La bicapa publicado protocolo 5-6 Se siguió publicado excepto que los liposomas no se incubaron durante 20 minutos sobre el cubreobjetos después de la cámara de flujo fue montado. En su lugar, HBS-BSA tampón se corría en la celda de flujo inmediatamente después del montaje.
- Montar una cámara de flujo con bicapas lipídicas planas formadas sobre el cubreobjetos de vidrio que contienen Ni-NTA lípidos. Las moléculas de adhesión, la ICAM-1 (100 moléculas / micras 2), y complejos de péptido-MHC, la MCC cargado es decir, K (moléculas 5-10 micras o 2), se incorporan en la bicapa mediante sus etiquetas de histidina. La molécula CD80 estimuladoras se agrega mediante un ancla de GPI (100 micras moléculas / 2).
- Colocar la celda de flujo en la platina del microscopio y estabilizarlo. Una el fabricante suministra el elemento de calentamiento en la celda de flujo para controlar su temperatura. Coloque el objetivo en una bicapa y traer el avión de dos capas para enfocar. Habilitar calentamiento del objetivo y el flujocelular para estabilizar la temperatura de la cámara a 37 ° C.
- Transfectadas Las células T son sedimentó después de 4 horas de incubación a una velocidad de 80x g, y de re-suspendido en HBS-BSA tampón y suplementado con 10 mg / ml de H57 Fab o 20 mg / ml de H57 solo fragmento variable de la cadena (scFv) a etiquetar el TCR. Las células se inyecta entonces en las células de flujo. Imagen se realiza en la presencia continua de los Fab o scFv debido a su alta constante de disociación. Su presencia en el medio no aumenta significativamente el fondo como el campo TIRF es muy delgada.
- Condiciones de imagen están configurados de modo que la adquisición de doble canal en vivo muestra una vista previa en vivo de los canales de TCR y de las buenas prácticas agrarias que ayuda en la búsqueda de las células transfectadas. TIRF de iluminación se confirma, centrándose el plano de vidrio para detectar cualquier tinción de la membrana lateral. Si las membranas laterales no vienen a continuación, en el enfoque de la alineación TIRF es bueno. Las células transfectadas son luego fotografiada una vez o en una secuencia de imágenes para producir videos.
4. Procesamiento de imágenes y análisis de datos
El software genera imágenes de las dos cámaras en un solo marco. La salida de cada cámara es de 512 x 512 píxeles, por lo que la imagen de salida es de 1024 x 512 píxeles de tamaño. Las primeras imágenes que se divide en cuadros individuales correspondientes a las dos cámaras. Las imágenes de resolución sub-cuentas de los dos canales se superponen y los parámetros de alineación se determinan. Una característica específica a nuestro sistema es una rotación grado 1 de un canal con respecto a la otra (ver Figura 3). La fuente más probable de esta rotación es la tribuna de la cámara. Después de esta rotación transformaciones lineales más relativos en X e Y deben ser realizados para alinear perfectamente las perlas con respecto a la otra. Las imágenes de perlas se obtienen en cada experimento para determinar los parámetros precisos para alinear los dos canales. Estas transformaciones lineales y de rotación se aplica luego a todo elimágenes y, a continuación están sujetos a los algoritmos de segmentación y análisis de co-localización.
5. Los resultados representativos
El sistema aquí descrito se puede adaptar para estudiar aguas abajo de señalización de cualquier receptor en la membrana plasmática. Es particularmente informativa en el estudio de la señalización del TCR, porque la señalización se produce en grupos ópticamente resueltos llamados TCR microclusters o en endosomas como se describió recientemente 18. Si la señalización se produjeron en los grupos sub-resolución de los receptores o en un-agrupados receptores experimentos adicionales tendría que hacer para interpretar los datos. Como se mencionó antes, las cadenas CD3 del complejo TCR someterse a la fosforilación por la quinasa familia Src Lck sobre el compromiso del TCR por péptido-MHC complejos. La cadena CD3 fosforilada, se movilizan de la quinasa de la familia Syk Zap70. Visualización de la contratación de Zap70 por lo tanto se informa sobre el estado de fosforilación de la cadena CD3. La fuerza de la estimulación de TCR puede alterarse mediante el uso de péptidos mutados en los residuos de contacto TCR. Estos péptidos son llamados ligandos peptídicos alterados (MTA). Un experimento representativo se muestra en la Figura 4, donde los péptidos agonistas robustamente recluta Zap70 a microclusters TCR mientras que la menor potencia péptido T102L falla para reclutar Zap70 a TCR microclusters, demostrando que la cadena CD3 no se fosforila en este caso. Podríamos llegar a esta conclusión porque teníamos que observar sólo la contratación de Zap70 a las agrupaciones de TCR que fueron detectados fácilmente por TIRFM. Un algoritmo de segmentación automática se utiliza para contar el número de ZAP70 microclusters por celda. También se muestra en la película es complementaria de la imagen simultánea de TCR y Zap70 asociado fluorescencia. Tenga en cuenta la naturaleza dinámica de lamelipodium.
<br /> Figura 1. Imagen y esquemática de la costumbre lanzamiento TIRF. El panel A muestra la fotografía del lanzamiento TIRF como instalado en el microscopio, y el panel B es un esquema de la puesta en marcha TIRF demostrando la trayectoria de la luz. El esquema y la imagen que muestra la posición de la lente colector, el divisor de haz, el lanzamiento de fibra con X, Y y Z ajustes, la L1 lente de colimación, y la lente de enfoque L2 instalado en el cubo dicroico y el objetivo TIRF. El recuadro muestra la lente de enfoque instalado en el cubo dicroico.
Figura 2. Imagen, y esquemática del sistema de cámara dos. El panel A muestra la fotografía del sistema de cámara dos como adjunta al microscopio, y el Panel B es una representación esquemática de la misma. El esquema y la imagen muestra la posición del objetivo, espejo, dicroicos, lentes de tubo TL1 y TL2, las emisiones de los filtros F1 y F2, las dos cámaras C1 y C2 en las camisetasheredero se encuentra con su respectiva X, Y y Z ajustes.
Figura 3. El uso de sub-resolución perlas para alinear los dos canales. Los paneles A y B muestran superposiciones de cuentas sub-resolución antes (A) y después (Grupo B) de alineación. El panel A muestra que uno de los canales se hace girar con respecto al otro. Los paneles C y D son una subsección de las imágenes en A y B. Grupo E muestra una imagen del canal de superposición de dos células sin tratamiento. Parámetros de alineación utilizados en el panel D se aplica a la imagen se muestra en el panel de aviso F. cómo el lamelipodium de los dos canales está perfectamente alineado en el panel F y no en el panel de E. barra Escala 4 micras para todos los paneles.
Figura 4. Zap70 contratación de TCR microclusters en respuesta a las minas terrestres antipersonal diferentes. In vitro activado y T Las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica Zap70 fusionado a GFP y se incubaron en vidrio soportada de Ni-NTA bicapas que contienen 6 moléculas / 2 micras de péptido cargado Su-etiquetados-es decir, K, 100 moléculas / 2 micras de Alexa647 conjugado Su-etiquetados ICAM- 1 y 100 micras moléculas / 2 de GPI-ancladas CD80. Los péptidos cargados se indican en el recuadro. ICAM-1 se refiere a las celdas de bicapas que contienen moléculas / 100 micras 2 de Alexa-647 conjugado Su-etiquetados de ICAM-1. De dos canales de adquisición simultánea microscopía TIRF se realizó en la presencia continua de Alexa546 conjugado H57 fragmento Fab (sin bloqueo) para teñir el TCR. Las celdas eran imágenes hasta una hora después del contacto inicial con la bicapa. El número de racimos por ZAP70 células se analizaron mediante un software de clúster conteo automatizado. Al menos 40 células se analizaron en cada caso. Barra de nivel 2 micras para todas las imágenes.
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Figura 5. Alineación del sistema de cámara utilizando dos tipos diferentes de dos cámaras. Este panel muestra la superposición alineada de cuentas sub-resolución de imágenes utilizando el sistema de dos cámaras en las dos cámaras tienen diferentes tamaños de pixel (verde: 6,45 m de tamaño de píxel fotografiada a hurgar en la basura 2x2 y rojo: talla 16 m pixel fotografiada sin binning). El recuadro muestra la vista ampliada de la caja cuadrada en el centro del campo. Barra de escala 5 micras.
Película Complementario. Zap70 contratación de microclusters TCR en respuesta al péptido agonista. In vitro activado y las células T fueron transfectadas con un plásmido que codifica Zap70 fusionado a GFP y se incubaron en vidrio soportada de Ni-NTA bicapas que contienen 6 moléculas / 2 micras de péptido cargado Su-etiquetados-es decir, K, 100 moléculas / 2 micras de Alexa647 conjugado Su-etiquetados moléculas ICAM-1 y 100/2 micras de GPI-ancladas CD80. De doble canal simultáneo de uncquisition microscopía TIRF se realizó en la presencia continua de Alexa546 conjugado H57 fragmento Fab (sin bloqueo) para teñir el TCR. Un campo de las células transfectadas fue fotografiada repetidamente 40 veces con una resolución de tiempo de 10 segundos por fotograma. Barra de nivel 2 micras. Haga clic aquí para ver la película complementaria .
Discussion
Se describe aquí un sistema de señalización en el estudio de antígenos específicos de células T primarios de ratón utilizando TIRFM vidrio y apoyadas bicapas lipídicas artificiales como vehículos blindados. La técnica se basa en las buenas prácticas agrarias con éxito la expresión de proteínas etiquetadas en estas células. Transfección de células T es siempre una tarea difícil. Típicamente, la entrega de electroporación o genes utilizando retrovirus o lentivirus se utilizan. Una técnica no es superior sobre el otro, ambos tienen sus limitaciones y ventajas. Encontramos que la electroporación tiene las siguientes ventajas: 1) No se requiere que las células se dividen activamente como se requiere para los retrovirus, pero no lentivirus, y 2) El nivel de expresión puede ser controlada mediante la variación del tiempo, las células se incuban antes de imágenes. El mayor inconveniente es que nos resulta muy difícil expresar las proteínas que son de gran tamaño en las células primarias. Hemos presentado un método que nos da la viabilidad celular muy bueno después de la electroporación. Como resultado, es serían aplicables-le a su utilización para lograr mediada por siRNA silenciamiento de los genes.
También describe aquí un personalizado dos canales simultáneos microscopio TIRF adquisición que se cromáticamente corregida y no requiere alineación separado para diferentes longitudes de onda. Estas capacidades, sin embargo, están disponibles comercialmente. Nuestro sistema se basa en los principios de la microscopía TIRF publicado por expertos en la materia y es más barato que las alternativas comerciales. Una posible crítica de nuestro diseño es que estamos usando el mismo ángulo de incidencia para las longitudes de onda de excitación diferentes. Esto daría lugar a una profundidad de penetración diferente TIRF para longitudes de onda de excitación diferentes. Creemos que estos efectos son pequeños debido a que la onda evanescente es un campo de forma exponencial en descomposición y la profundidad del campo TIRF es una función lineal de longitud de onda. Fluoróforos cercanas a la superficie del vidrio experimentará ninguna diferencia en la intensidad de láser entre las dos longitudes de onda. Para fluoróforos cerca de la PEnetration profundidad, la diferencia de intensidad será 1,3 veces para las dos longitudes de onda 488 y 640 nm y plegado 1,15 para las dos longitudes de onda 488 nm y 561. El mismo sistema puede ser usado en conjunción con técnicas de resolución súper que hacen uso de iluminación TIRF.
También se ha descrito un sistema de dos cámaras, que es hecha a la medida. Al igual que el sistema TIRF, aparatos similares también están disponibles comercialmente. Nuestro sistema ofrece flexibilidad para cambiar los filtros dicroicos y, lo que permite su uso con diferentes combinaciones de longitudes de onda. El inconveniente de nuestro sistema es el grado de una rotación necesaria para alinear las dos imágenes. Este problema se puede resolver mediante el uso de soportes de la cámara que se piezo impulsado y ofrecen grados de rotación de la alineación. También hemos aplicado con éxito un sistema de cámara dos en este microscopio, en la que las cámaras son diferentes y tienen diferentes tamaños de pixel. Un sistema como este podría ser útil si se necesita la sensibilidad en un canal y un gran dyrango dinámico en otro, los cuales rara vez están disponibles en la misma cámara. Se utilizó la Fotometría HQ-2 cámara en binning 2x2 que nos da un tamaño de píxeles efectivos de 12,9 m con la Fotometría Quant-EM cámara que tiene un tamaño de píxel de 16 micras. Un 180 mm de longitud focal de lente del tubo se utiliza para la Quant-EM y un 145 mm de longitud focal del objetivo tubo fue utilizado para la cámara HQ-2. El HQ-2 se controla mediante el software Metamorph y el Quant-EM se controla a través de software de micro-manager en un equipo distinto en el modo de disparo externo. El disparo externo se proporciona a la cámara Quant-EM con una salida digital de la medición a bordo del CAD de computación, que se llevó a cabo como un disparador adicional en la configuración de configure iluminación de Metamorph. La relación de las distancias focales de las lentes del tubo coincide con la proporción de los tamaños de pixel eficaces. Una alineación representativo se muestra en la Figura 5.
Disclosures
Todos los animales utilizados en estos experimentos se mantuvieron en un libre de agentes patógenos medio ambiente, y los experimentos fueron aprobados por los Institutos Nacionales de Salud Animal y el empleo.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud. Estamos muy agradecidos a Juan Huppa y Mark Davis para que nos proporciona el scFv de H57 se utilizan en estos estudios. RV gustaría dar las gracias Keir Neumann útil para el debate durante el desarrollo de esta técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells | Lonza Inc. | VPA-1006 | |
| PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit | Life Technologies | K2100-05 | For endotoxin free DNA preps |
| Amaxa Nucleofector Device | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Recombinant Murine IL-2 | PeproTech Inc | 212-12 | |
| Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm | Polysciences, Inc. | 24050-5 | |
| Lab-Tek II 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155409 |
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