Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Summary

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 × 10

Abstract

Cultivo de hepatocitos primaria es una herramienta valiosa que ha sido ampliamente utilizado en la investigación básica de la función hepática, la enfermedad, fisiopatología farmacología, y otros temas relacionados. El método basado en la perfusión de colagenasa de dos pasos para el aislamiento de hepatocitos intactos se introdujo por primera vez por Berry y Friend en 1969 ¹ y, desde entonces, ha sufrido muchas modificaciones. La técnica más utilizada fue descrito por Seglenin 1976 ^2. Esencialmente, los hepatocitos se disocian de ratas adultas anestesiadas por una perfusión de colagenasa no recirculante a través de la vena porta. Las células aisladas se filtra a través de un filtro de 100 micras de tamaño de poro de malla de nylon, y se cultivaron en placas. Después del cultivo 4-horas, el medio se reemplazó con medio que contenía suero o suero libre, por ejemplo HepatoZYME-MSB, por el tiempo adicional a la cultura. Estos procedimientos requieren pasos quirúrgicos cultura y estéril que puede ser mejor demostrado por el vídeo que por texto. HERE, que documenta los pasos detallados para estos procesos, tanto por video y protocolo escrito, que permiten consistente en la generación de hepatocitos viables en grandes cantidades.

Protocol

1. Preparación

Todos los tampones se preparan utilizando una técnica estéril y esterilizarse por filtración utilizando un filtro de 0,22 micras Corning.

1. Preparar perfusión búfer mediante la adición de las siguientes acciones para la solución salina equilibrada de Hank (HBSS, sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} ver Tabla 1): Mg ^{2 +} (MgCl ₂₎ a 0,9 mM, EDTA a 0,5 mM, y HEPES a 25 mM.
2. Preparar perfusión tampón II mediante la adición de las siguientes acciones para HBSS (con Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} ver Tabla 1): HEPES a 25 mM.
3. Preparar buffer de perfusión II más collagenaseII: Disolver la colagenasa II (1000 U) con 300 ml de perfusión II de amortiguación y mantener la solución caliente en baño de agua antes de la perfusión. Esta solución debe ser utilizado dentro de 30 minutos debido a la actividad de la colagenasa II disminuyó con el tiempo.
4. Preparar medio completo de William: Agregue el siguienteMedio a E de Williams: L-glutamina a 2 mM, suero bovino fetal (FBS) al 5%; insulina a 100 nM, dexametasona a 100 nM, penicilina a 100 UI / ml y estreptomicina a 100 mg / ml.
5. Estos tampones debe ser calentado durante 30 minutos en el baño de agua a 42 ° C, una temperatura óptima que corresponde a una temperatura de salida en la cánula de 37 ° C.

2. Rata perfusión para el aislamiento del hígado

1. El sistema de perfusión se compone de la bomba, el tubo de silastic autoclave y un baño de agua (ver Figura 1). Pre-establecer el caudal de la bomba de perfusión peristáltica a 10 ml / min.
2. Se anestesia una rata adulta (300 g de peso corporal) con intraperitoneal (ip) cetamina (87 mg / kg de peso corporal), además de xilazina (13 mg / kg). Profundidad de la anestesia debe ser supervisada por pizca dedo del pie. Cuando la rata ya no responde a los estímulos nocivos, afeitarse el vello abdominal y preparación del abdomen con betadine y etanol. Entrar a través de una incisión en la línea media.
3. Exponerla vena portal hepática moviendo cuidadosamente las vísceras al exterior derecho de la cavidad abdominal, e insertar un angiocath 18-calibre en la vena portal hepática (ver Figura 1).
4. Conectar el tubo perfundido a la aguja e iniciar la infusión in situ a un caudal bajo (10 ml / min) con pre-calentado (37 ° C) tampón de perfusión yo.
5. Si se realiza correctamente, el hígado debe inmediatamente comenzar a blanquear. Una vez que la canulación exitosa se ​​confirma, hacer un corte en la vena cava inferior (VCI) para permitir el flujo de salida (Figura 1). Una prueba más para la canulación exitosa se puede realizar aplicando una ligera presión con el hisopo estéril de la vena cava inferior, todos los lóbulos del hígado debe rápidamente comienzan a hincharse.
6. Aumentar la velocidad de flujo de 25 ml / min. El hígado debe ser de color pálido.
7. Cambie la solución de perfusión a la perfusión tampón II, más colagenasa II sin interrupción del flujo durante 6 minutos.
<li> Periódicamente (5-10 veces durante la digestión) de ejercer presión con el hisopo para la vena cava inferior para intervalos de 5 segundos. El hígado se hincha, dando lugar a una mayor disociación celular hepática, a su vez reduce el tiempo total de digestión y aumentando el rendimiento final.
8. Después de la perfusión de colagenasa, el hígado debe comenzar a verse pesado. Diseccionar el hígado sin lugar, en un vaso de precipitados estéril previamente enfriado con 20 ml de medio completo de Guillermo, y luego llevarlo a la campana de cultivo de tejidos de células.

3. El aislamiento celular de los hepatocitos

1. Dentro de la campana de cultivo celular, utilizar un rascador de células para dispersar suavemente las células en medio completo de William dentro de una placa de Petri estéril.
2. Se filtra la dispersión de células a través de un poro 100 micras filtro de células de tamaño en un tubo cónico de 50 mL con el fin de eliminar los tejidos conectivos y fragmentos de tejido no digeridas.
3. Suspender las células en 40 ml de medio completo de William y centrifugar a 50 xg durante 3 min a 4 ° C.
4. Aspirar el sobrenadante, ysuavemente volver a suspender las células en medio completo 40 ml de William frío para lavar las células. Repetir la centrifugación.
5. Aspirar el sobrenadante, y suavemente volver a suspender las células con 25 ml de medio completo de William. Añadir 25 ml de solución de Percoll al 90% en PBS en el tubo y mezclar suavemente.
6. Centrifugar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar las células muertas de la parte superior del gradiente porque las células viables se mantienen en el fondo del gradiente de Percoll.
7. Suspender el sedimento celular en 30 ml de medio completo cálida de Guillermo, y luego repetir la centrifugación y vuelva a suspender el pellet de células en 20 ml de medio completo cálida de Guillermo.
8. Cuenta las células dentro de la suspensión celular utilizando un hemocitómetro y determinar la viabilidad celular por tinción con azul tripán.

4. Cultivo de hepatocitos

1. Diluir las células con medio completo caliente de William a la concentración preferida, por ejemplo, 2,5 x 10 ⁵ células / ml. Células de placas en un volumen deseado sobre placas de cultivo celular, por ejemplo. 5 x 10 ⁵ células / 2 ml / pocillo, 6 pocillos / placa, o 2,5 x 10 ⁵ células / ml 1,5 / Bueno, 12 pozos / placa. Sin revestir la placa está muy bien para cultivos de células hepáticas.
2. En una preparación típica con> 85% células viables, la densidad celular debe alcanzar aproximadamente 60-70% de confluencia, que permite el contacto célula-célula mientras se mantiene un espacio suficiente para los hepatocitos para crecer a su tamaño de la célula completa y producir una confluencia final de 90-95%.
3. Con el fin de formar una monocapa incluso de los hepatocitos, en otras palabras, para minimizar la tendencia de las células a agregarse en la zona central del pozo (probablemente debido a la parte interior del flujo de aire de incubadora de células), permiten que las placas permanecen en el interior la campana de cultivo celular durante 30 minutos antes de colocarlos en una incubadora.
4. Cultivar las células a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO _2. Después de 4-H cultivo, las células o bien podría permanecer en el mismo medio que contenía suero o sustituir el medio con suero-fmedio de REE, por ejemplo, HepatoZYME-SFM (ver Tabla 1). El medio libre de suero ayuda a mantener la morfología de las células sin efectos adversos de las hormonas cuando un medio libre de suero se utiliza.
5. Permiten a las células para recuperarse y crecer al menos una noche antes de la experimentación. Recomendamos el uso de las células de prueba dentro de 24 horas ya que esto puede ayudar a preservar la función de enzimas críticas (por ejemplo, P450).
6. Sustituir el medio de crecimiento a intervalos de 2 días, si es necesario.

5. Los resultados representativos

Las condiciones descritas regularmente generar cosechas de células de 1,0 x 10 ⁸ células por preparación de un hígado de rata. La viabilidad de los hepatocitos medidos por exclusión con azul tripano fue consistentemente dentro del rango de 88 ~ 96%.

Como se muestra en la Figura 2, el agregado hepatocitos y clúster forma después de la siembra de 4 horas. Mayoría de las células aisladas se aplanan y se extendió en el crecimiento de monocapa típica. Por 24 horas, los bordes de las células se definen, superficie de las células es bastante suave, y gotas de lípidos son visibles. Las células tienen de uno a tres nucleolos, de forma redonda, situada en el centro de las células, y el tamaño de visualización núcleos coherente entre las células (Figura 2).

Figura 1. Un diagrama de la perfusión del hígado. Un angiocath 18-calibre se inserta en la vena porta del hígado, a continuación, un tubo perfundido está conectado a la aguja. Una vez que la canulación exitosa se confirma, hacer un corte en la vena cava inferior (VCI) para permitir el flujo de salida.

Figura 2. Morfología de los hepatocitos en cultivo a través del tiempo (4 horas a 24 horas), aumento x 200. Después se cultivaron durante 24 h, las células se extienden en el crecimiento de monocapa típica, y las uniones entre las células son lineales.

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
HBSS (sin Ca 2 + y Mg 2 +)	Invitrogen	14174
HBSS (con Ca 2 + y Mg 2 +)	Invitrogen	14025
E medio de Williams	Invitrogen	12551-032
Colagenasa II	Worthington	LS004176
Cell colador (100 m)	BD	352360
HepatoZYME-SFM	Invitrogen	17705
Percoll	Sigma	P4937
Angiocath (18-calibre)	BD	381705

Tabla 1.

Discussion

Cultivo primario de hepatocitos es un modelo in vitro utilizado para estudiar diversos aspectos de la fisiología y la patología del hígado. Por ejemplo, la cultura primaria se utiliza para evaluar la expresión y función de las enzimas que metabolizan las drogas incluyendo los citocromos P450, el metabolismo de drogas, las interacciones fármaco-fármaco, y los mecanismos de citotoxicidad y genotoxicidad ^3-7. El protocolo que describe el aislamiento y cultivo de las células hepáticas de ratas es una adaptación de los informes anteriores de Aiken et al. ^{8, 2,9,10} y otros con algunas modificaciones. Las condiciones que se describen constantemente generar hepatocitos viables de hasta 1,0 x 10 ⁸ células por la preparación con la viabilidad celular entre 88 ~ 96%. Los siguientes son otros pasos críticos:

1. Como con cualquier protocolo que describe el cultivo de células, el aspecto más crítico es evitar la contaminación de patógenos bacterianos o fúngicos mediante el uso de técnicas asépticas estrictas ^11.
2. Desmosomas, también conocido como adherentes macula, es una estructura de célula especializada para la adhesión célula-célula. La integridad de la desmosoma requiere calcio, y se descompone por EDTA y medios libres de calcio. La colagenasa enzimas se puede disociar el desmosoma, que conduce a las celdas de aislamiento hepáticas. Por lo tanto, la perfusión usa Ca ^{2 +} medio libre y, posteriormente, Ca ^{2 +} medio rico que contiene Ca ^{2 +} dependiente de la colagenasa, para la digestión.
3. Tratamiento con colagenasa adecuada es absolutamente crucial para la preparación de los hepatocitos. La velocidad de flujo de perfusió tampón II más colagenasa II debe ser mantenido a 25 ml / min. Las causas más comunes de cultivo de hepatocitos éxito incluyen: 1) los pobres disociación celular, lo que podría deberse a las reservas de perfusión inadecuada calentado a 37 ° C y / o la velocidad de perfusión lenta, y 2) la muerte celular, que could ser debido a la digestión colagenasa excesivo.
4. Tenga cuidado al cambiar los medios de comunicación después de la primera de 4 h la cultura, ya que los hepatocitos son relativamente frágiles y pueden dañarse fácilmente o perturbado por el contacto directo; pipeta sólo por el lado del bien, y nunca directamente sobre las células.