Summary
NADPH ossidasi è la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in fagociti. A causa della natura effimera dei ROS, è difficile misurare e monitorare i livelli di ROS negli animali viventi. Un metodo minimamente invasivo per la quantificazione seriale di ROS in topi viventi è descritto.
Abstract
NADPH ossidasi è un enzima critico che media difesa dell'ospite antibatterica e antimicotica. Oltre al suo ruolo nella difesa dell'ospite antimicrobica, NADPH ossidasi ha funzioni critiche di segnalazione che modulano la risposta infiammatoria 1. Pertanto, lo sviluppo di un metodo per misurare in "tempo reale" la cinetica di NADPH ossidasi derivata generazione di ROS dovrebbe essere un valido strumento di ricerca per comprendere i meccanismi pertinenti per ospitare difesa, infiammazione e lesioni.
Malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia ereditaria del NADPH ossidasi caratterizzato da gravi infezioni e infiammazioni eccessivo. L'attivazione della NADPH ossidasi dei fagociti richiede traslocazione delle sue subunità citosoliche (p47 phox, p67 phox e p40 phox) e Rac ad una membrana legato flavocytochrome (composto da un phox gp91 e p22 phox eterodimero). Perditadi funzione mutazioni in uno qualsiasi di questi risultati NADPH ossidasi componenti in CGD. Come per i pazienti con CGD, gp91 phox-carente topo e p47 phox-carenza topi hanno difettoso fagocita attività della NADPH ossidasi e di accoglienza alterata difesa 13, 14. Oltre a fagociti, che contengono i componenti sopra descritti NADPH ossidasi, una varietà di altri tipi di cellule esprimono diverse isoforme di ossidasi NADPH.
Qui, descriviamo un metodo per quantificare la produzione di ROS nei topi di vita e di delineare il contributo della NADPH ossidasi di generazione di ROS in modelli di infiammazione e lesioni. Questo metodo si basa su ROS reagire con L-012 (un analogo del luminol) per emettere luminescenza che è registrato da un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD). Nella descrizione originale della L-012 probe, L-012-dipendente chemiluminescenza è stata completamente abolita dal superossido dismutasi, indicando che il principale ROS rilevato in questa reazione era superossido di anione 15. Studi successivi hanno dimostrato che la L-012 in grado di rilevare altri radicali liberi, comprese le specie reattive dell'azoto 16, 17. Kielland et al. 17 hanno dimostrato che l'applicazione topica del forbolo miristato acetato, un potente attivatore di NADPH ossidasi, portato in NADPH ossidasi-dipendente generazione di ROS che potrebbe essere rilevata nel topo, utilizzando la sonda luminescente L-012. In questo modello, hanno mostrato che la luminescenza L-012-dipendente è stata abolita nel p47 phox-carente topo.
Abbiamo confrontato generazione di ROS nei topi di tipo selvatico e NADPH ossidasi-carente p47 phox-/ - mice 2 nei seguenti tre modelli: 1) somministrazione intratracheale di zymosan, un pro-infiammatoria della parete cellulare fungina prodotto derivato che può attivare NADPH ossidasi; 2) legatura del cieco e la puntura (CLP), un modello di sepsi intra-addominale secondaria infiammazione polmonare acuta e del pregiudizio, e 3) tetracloruro di carbonio per via orale(CCl 4), un modello di ROS-dipendente danno epatico. Questi modelli sono stati specificamente selezionati per valutare ossidasi NADPH-dipendente generazione di ROS nel contesto di infiammazione non infettiva, sepsi polimicrobica e tossina danno indotto organo, rispettivamente. Confrontando bioluminescenza nei topi di tipo selvatico di p47 phox-/ - mice ci permette di delineare il contributo specifico di ROS generato da p47 phox contenente NADPH ossidasi al segnale bioluminescente in questi modelli.
Risultati di imaging bioluminescenza che hanno dimostrato un aumento dei livelli di ROS nei topi di tipo selvatico rispetto al p47 phox-/ - topi ha indicato che NADPH ossidasi è la principale fonte di generazione di ROS in risposta a stimoli infiammatori. Questo metodo fornisce un approccio minimamente invasivo per il monitoraggio "in tempo reale" di generazione di ROS durante l'infiammazione in vivo.
Protocol
1. Modelli animali
- Mouse: utilizzare p47 phox-/ - topi e per età e sesso-abbinato topi C57BL6/DBA. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti di cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
- Anestesia: Utilizzare un sistema continuo di amministrazione isoflurano per indurre l'anestesia. Il sistema vaporizzatore (VetEquip) è riempito con isoflurano (2-3%). Verificare che i topi sono completamente anestetizzati osservando la respirazione, il movimento, e riflesso corneale in risposta a stimoli esterni.
- Le procedure chirurgiche: Scrub l'area chirurgica (da banco) con il 70% di etanolo. Indossare guanti sterili e un abito pulito chirurgico e la maschera. Preparare i topi dal clipping i capelli e applicando betadine alternata con etanolo 70% per l'area in cui l'incisione viene effettuata. Eseguire un intervento chirurgico su una superficie sterile e usare strumenti sterili. Monitor topi dopo l'intervento fino a quando sveglio e muoversi liberamente.
- Intratracheale zymosan amministrazione
- Somministrare anestesiacome descritto in 1.2.
- Disinfettare area chirurgica (collo) con Betadine e 70% di etanolo ed esporre la trachea da dissezione chirurgica.
- Pierce trachea con un ago di calibro 27 e iniettare zymosan (St. Louis, MO) ad una dose di 1 mg / g con un 0,5 ug / ul di soluzione (volume totale di 50 microlitri per un mouse 25 g) sciolto in PBS sterile.
- Chiudi collo topi avvolti con 5-0 punti di sutura in seta sterili in condizioni asettiche.
- Immagine dopo 4 ore e 24 ore.
- Legatura del cieco e puntura
- Somministrare anestesia, come descritto al punto 1.2.
- Clip di capelli nella zona di intervento (addome) e disinfettare con betadine e il 70% di etanolo.
- Eseguire una laparotomia mediana e identificare il cieco.
- Legare il distale 50% del cieco esposta con sutura di seta 4-0 e cieco puntura distale alla legatura con un passaggio di un ago da 21 gauge.
- Chiudere l'incisione con 4-0 punti di sutura in seta sterili.
- Immagine dopo 4 ore e24 ore.
- Orale tetracloruro di carbonio (CCl 4) somministrazione
- Somministrare anestesia, come descritto al punto 1.2.
- Somministrare CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO), disciolto in olio di mais mediante sonda gastrica. La procedura di CCl4 somministrazione deve essere effettuata in un'area designata conformemente IBC / EHS politiche.
- Immagine dopo 4 ore e 24 ore.
2. Acquisizione di un'immagine Bioluminescent
- Inizializzare il IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, impostato in modalità luminescenza, e attendere che il charge-coupled device (CCD) per bloccare la temperatura.
- Selezionare il tempo di esposizione, binning (media) e f / stop (8) le impostazioni.
- Topi di luogo in posizione supina nella camera di imaging su un palco riscaldato per mantenere la temperatura corporea normale. Somministrare anestesia, come descritto al punto 1.2 con cono di naso, mentre i topi sono nella camera di IVIS imaging.
- Amministrare L-012 (20 ug / g) disciolto in PBS sterile (10 pg / pl) per via endovenosa con retro-orbitale iniezione ad ogni tempo selezionato per l'imaging.
- Cattura di immagini che iniziano a 2 minuti dopo l'iniezione L-012. Si utilizzano in genere un 40 secondi di esposizione.
3. Analisi dei dati con regione di interesse
- Analizzare i dati utilizzando un software immagine vivente V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Aprite l'immagine e selezionare la misurazione della Regione di strumenti di interesse.
- Selezionare la regione di interesse forma e dimensioni sul / o torace e addome dopo sovrapponendo una pseudo-colore immagine digitale (che rappresenta rilevazione dei fotoni) per un immagine fotografica del mouse.
- Quantificare l'intensità del segnale (flusso di fotoni) dalla regione di interesse.
4. Statistica
- Utilizzare pacchetto software di analisi statistica effettuare ANOVA a due vie con Bonferroni post-test in punti temporali individuali.
Zymosan è un pro-infiammatoria cellulare prodotto lieviti ed un potente attivatore di ossidasi NADPH 3. Abbiamo precedentemente dimostrato che zymosan intratracheale induce una più robusta infiammazione polmonare neutrofila e pro-infiammatorie la produzione di citochine in p47 phox-/ - rispetto al tipo selvatico topo 1. Qui, il nostro obiettivo è stato quello di confrontare generazione di ROS nei polmoni di tipo selvatico e p47 phox-/ - topi dopo sfida zymosan. A 4 ore dopo la somministrazione intratracheale zymosan, abbiamo osservato un significativo aumento emissione di fotoni sul petto nei topi di tipo selvatico rispetto al basale nonché un aumento della emissione di fotoni in rispetto al tipo selvatico p47 phox-/ - topi a 4 ore e 24 ore. Al contrario, i segnali in bioluminescenza p47 phox-/ - mice è rimasto a livello basale a 4 ore dopo il trattamento zymosan (Fig. 1 AB). Così, NADPH ossidasi sembra be la principale fonte di generazione di ROS nei polmoni in seguito alla somministrazione zymosan.
Quindi, abbiamo valutato produzione di ROS nel CLP-indotta modello di sepsi. La sepsi è una minaccia per la vita associata con la sindrome d'organo lesioni, fra cui danno polmonare acuto (ALI) e sindrome da distress respiratorio (ARDS) 4, 5. ROS-mediata pregiudizio è stato considerato un fattore importante di guida indotta da sepsi disfunzione multi-organo. Abbiamo trovato che i ROS sono aumentate significativamente sul petto (4 ore) e sopra l'addome (24 ore) in seguito CLP nei topi di tipo selvatico rispetto al basale. Tuttavia, i livelli di ROS in p47 phox-/ - mice erano simili ai livelli basali in entrambi i punti di tempo (Fig. 2 AC). Questi risultati dimostrano che la produzione di ROS nel CLP-indotta modello di sepsi mouse è NADPH ossidasi-dipendente.
Infine, abbiamo usato l'imaging bioluminescente per rilevare la produzione di ROS in un 4-indotto modalità di danno epatico CCll. CCl 4 provoca necrosi epatocellulare, ed è stato utilizzato per modellare entrambe le lesioni acute del fegato e fibrosi epatica 6. In contrasto con i modelli precedentemente descritti di infiammazione e lesioni, abbiamo scoperto che la produzione di ROS nell'addome era modesto (circa il 35%) è aumentato rispetto al basale, in p47 phox-/ - topi a 4 ore dopo la somministrazione CCl 4. Tuttavia, l'entità di CCl 4-ROS indotta generazione era significativamente maggiore nei topi di tipo selvatico che in p47 phox-/ - mice (Fig.3 AB). Questi dati suggeriscono che sia la generazione p47 phox contenente NADPH ossidasi-dipendente e indipendente dal ROS si verificano in CCl 4 acuta indotta da danno epatico.
Figura 1. Produzione di ROS nei polmoni dopo il trattamento zymosan. A) Rappresentante bioluminescence l'imaging di produzione di ROS. Notare che, oltre al petto, luminescenza è rilevabile sull'addome in entrambi di tipo selvatico e p47 phox-/ - topi e luminescenza addominale è invariata dal trattamento zymosan. B) conta di fotoni dal petto di tipo selvatico e p47 phox-/ - topi dopo una singola iniezione intratracheale (IT) di zymosan. L'imaging bioluminescenza è stata eseguita al basale, 4 h, e 24 h. Emissione di luce dalla regione di interesse sul petto è stato identificato utilizzando l'indicato pseudo-colore scala. I risultati sono presentati come media ± SE, n = 6-9 per gruppo, * = p <0.05. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Rilevamento ROS dopo CLP. A) l'imaging bioluminescenza Rappresentante di produzione di ROS, BConta fotoni) dal petto, e C) conta di fotoni dall'addome di tipo selvatico e p47 phox-/ - mice al basale, 4 ore, e 24 ore dopo CLP. I risultati sono presentati come media ± SE, n = 4-5 per gruppo, * = p <0.05. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Produzione di ROS in addome dopo CCl 4 indotta da danno epatico. A) l'imaging bioluminescenza Rappresentante di produzione di ROS e B) conta di fotoni dall'addome di tipo selvatico e p47 phox-/ - mice al basale, 4 ore, e 24 ore dopo somministrazione orale CCl 4 trattamento. I risultati sono presentati come media ± SE;. N = 4-5 per gruppo, * = p <0,05 Clicca qui per ingrandire la figura
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Discussion
Misurazione "tempo reale" di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in animali viventi può essere ottenuto utilizzando sonde fluorescenti e chemiluminescenza. Mentre sonde fluorescenti soffrono avente deboli segnale-rumore 12 rapporti, la tecnica di imaging descritta è più sensibile per la rilevazione di emissione di luce dopo una reazione chimica di ROS con il luminol substrato a base di L-012. Come tutte le tecniche di imaging bioluminescenti, questa metodologia è limitata dalla lunghezza d'onda dipendente assorbimento della luce e dispersione di organi e tessuti. Questi esperimenti sono stati focalizzati sulla creazione di adeguate condizioni sperimentali per la misura di ROS in tipo selvatico e p47 phox-/ - mice. L'uso di questi topi geneticamente modificati ci permette di differenziare ROS generato da p47 phox contenente ossidasi NADPH da ROS generati da altre vie.
Anche se NADPH ossidasi funzionale contenente p47 phox èuna delle principali fonti di ROS, altre isoforme di NADPH ossidasi esistono, e ulteriori ROS generatrici di sistemi, tra cui la xantina ossidasi e la respirazione mitocondriale, in grado di produrre ROS. NADPH ossidasi e altri ROS che generano percorsi possono avere effetti importanti e interattivo su difesa ospite antimicrobica e vie di segnalazione a valle che modulano l'infiammazione e lesioni 7-10. Con l'imaging bioluminescenza, siamo stati in grado di misurare la cinetica di produzione di ROS in vivo e per delineare il contributo di NADPH ossidasi a livelli di ROS in diversi modelli infiammatori.
Un limite di questo metodo si riferisce alla risoluzione spaziale di bioluminescenza. Anche se si può misurare la luminescenza all'interno di specifici compartimenti anatomici (ad es., Torace, addome), è difficile localizzare il sito anatomico di luminescenza a livello dell'organo. In ognuno dei nostri modelli sperimentali abbiamo scelto 3 punti di tempo per le misurazioni bioluminescenti: di base, 4 ore, e 24 ore. Non sappiamo se bioluminescente di imaging in grado di identificare piccole differenze di generazione di ROS oltre intervalli più brevi di analisi o se la relazione tra la produzione di ROS e vivo bioluminescenza è lineare. Di questioni che richiedono ulteriori studi. Nei modelli utilizzati per questi studi, abbiamo il sospetto che le cellule fagocitarie, neutrofili e macrofagi reclutati, sono i principali responsabili per la produzione di ROS attraverso il sistema phagocyte NADPH ossidasi. Gli studi futuri in cui sono esauriti specifici tipi cellulari o chimere ossee sono generati in grado di fornire ulteriori conoscenze sui livelli relativi di produzione di ROS da diverse popolazioni cellulari. Un'altra potenziale limitazione di studi utilizzando L-012 è che altri radicali (oltre ROS) può reagire con questa sonda luminescente, riducendo specificità per il rilevamento ROS in alcune circostanze.
Dopo l'iniezione zymosan, la mancanza di produzione di ROS in p47 phox-/ - topi indica che NADPH ossidasi èla principale fonte di ROS in questo modello di infiammazione polmonare. CLP è uno dei più comuni modelli animali di sepsi 11 e imaging bioluminescenza rivelato aumentato segnali ROS sia nel polmone e addome che erano ossidasi NADPH-dipendente. In contrasto con la zymosan e modelli CLP, ROS sono stati aumentati nell'addome sia di tipo selvatico e p47 phox-/ - topi rispetto al basale, ma in misura maggiore nei topi di tipo selvatico, indicando che CCl 4 induce la produzione di ROS da p47 phox - contenente ossidasi NADPH e altri meccanismi.
In sintesi, i nostri dati mostrano che una luminol-based metodo di imaging bioluminescenza per la rilevazione di ROS può essere strumento importante per la ricerca in materia di regolazione e le conseguenze della produzione di ROS in vivo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH RO1 AI079253 e Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
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