Summary
NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.
Abstract
NADPH oxydase est une enzyme essentielle qui assure la médiation défense de l'hôte antibactérienne et antifongique. En plus de son rôle dans la défense de l'hôte antimicrobienne, la NADPH oxydase a les fonctions essentielles de signalisation qui modulent la réponse inflammatoire 1. Ainsi, le développement d'une méthode de mesure en "temps réel" la cinétique de la NADPH oxydase dérivée de génération de ROS est prévu pour être un outil de recherche précieux pour comprendre les mécanismes pertinents de défense de l'hôte, de l'inflammation et des blessures.
Granulomatose chronique (CGD) est une maladie héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections graves et de l'inflammation excessive. L'activation de la NADPH oxydase phagocytaire nécessite la translocation de ses sous-unités cytosoliques (p47 phox, p67 phox, p40 phox et) et Rac à un flavocytochrome liée à la membrane (composé d'un phox gp91 et p22 phox hétérodimère). Pertedes mutations de fonction dans l'un de ces composants résultat oxydase NADPH en DMC. Similaires aux patients atteints de CGD, gp91 phox souris déficientes en p47 phox et les souris déficientes ont une activité défectueuse NADPH oxydase phagocytaire et l'hôte altération de la défense 13, 14. En plus des phagocytes, qui contiennent les composants de la NADPH oxydase décrites ci-dessus, une variété de types de cellules expriment différentes isoformes de la NADPH oxydase.
Nous décrivons ici une méthode pour quantifier la production de ROS chez les souris vivantes et de délimiter la contribution de la NADPH oxydase à la génération de ROS dans les modèles d'inflammation et des blessures. Cette méthode est basée sur la réaction de ROS L-012 (un analogue de luminol) pour émettre de la luminescence qui est enregistrée par un dispositif à couplage de charge (CCD). Dans la description originale de la sonde L-012, L-012-dépendante chimioluminescence a été complètement abolie par la superoxyde dismutase, ce qui indique que la principale ROS détecté dans cette réaction était superanion oxyde 15. Des études ultérieures ont montré que la L-012 peut détecter les autres radicaux libres, y compris les espèces réactives de l'azote 16, 17. Kielland et al. 17 ont montré que l'application topique d'acétate de phorbol myristate, un puissant activateur de la NADPH oxydase, mené en NADPH oxydase dépendante de la production de ROS qui pourrait être détectée chez les souris en utilisant la sonde luminescente L-012. Dans ce modèle, ils ont montré que la luminescence L-012-dépendante a été aboli en p47 phox souris déficientes.
Nous avons comparé la génération de ROS dans les souris de type sauvage et NADPH oxydase déficiente en p47 phox-/ - ont 2 dans les trois modèles suivants: 1) l'administration intratrachéale de zymosan, une cellule pro-inflammatoire fongique mur produit dérivé qui permet d'activer la NADPH oxydase; 2) ligature caecale et ponction (CLP), un modèle de sepsis intra-abdominal avec une inflammation pulmonaire aiguë secondaire et des blessures, et 3) le tétrachlorure de carbone par voie orale(CCl 4), un modèle de lésion hépatique ROS-dépendante. Ces modèles ont été spécifiquement choisis pour évaluer la NADPH oxydase dépendante de la production de ROS dans le cadre de l'inflammation non infectieuse, la septicémie polymicrobienne, et la toxine induite par une lésion d'organe, respectivement. En comparant la bioluminescence chez la souris de type sauvage de p47 phox-/ - ont nous permet de définir la contribution spécifique de ROS générés par p47 phox de la NADPH oxydase contenant au signal bioluminescent dans ces modèles.
Résultats de l'imagerie de bioluminescence qui ont démontré une augmentation des niveaux de ROS dans les souris de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont indiqué que la NADPH oxydase est la principale source de production de ROS en réponse à des stimuli inflammatoires. Cette méthode offre une approche minimalement invasive pour "temps réel" suivi de la production de ROS au cours de l'inflammation in vivo.
Protocol
1. Modèles animaux
- Souris: Utilisez p47 phox-/ - souris et d'âge et le sexe assortie souris C57BL6/DBA. Obtenir l'approbation pour des expériences de protection des animaux et du Comité institutionnel utilisation.
- Anesthésie: Utiliser un système d'administration continue isoflurane pour induire une anesthésie. Le système de vaporisation (VetEquip) est rempli avec de l'isoflurane (2-3%). Assurez-vous que les souris sont pleinement anesthésiés par l'observation de la respiration, le mouvement et réflexe cornéen en réponse à des stimuli externes.
- Les interventions chirurgicales: Frotter la zone chirurgicale (de table) avec de l'éthanol à 70%. Porter des gants stériles et une blouse chirurgicale propre et un masque. Préparer les souris par clipsage les cheveux et appliquer la bétadine en alternance avec 70% d'éthanol à l'endroit où l'incision sera faite. Effectuer une intervention chirurgicale sur une surface stérile et utiliser des instruments stériles. Souris Moniteur post-opératoire jusqu'à ce éveillé et se déplacer librement.
- Intratrachéale administration zymosan
- Administrer une anesthésiecomme décrit dans l'1,2.
- Désinfecter la zone chirurgicale (cou) avec de la bétadine et de l'éthanol à 70% et exposer la trachée par une dissection chirurgicale.
- Pierce trachée avec une aiguille de calibre 27 et d'injecter zymosan (St. Louis, MO) à une dose de 1 mg / g en utilisant un mg 0,5 / ul de solution (volume total de 50 pl pour une souris de 25 g) dissous dans du PBS stérile.
- Fermer cou souris enroulé avec des sutures en soie 5-0 stériles dans des conditions aseptiques.
- L'image après 4 h et 24 h.
- Ligature caecale et ponction
- Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2.
- Couper les poils dans la zone chirurgicale (abdomen) et désinfecter avec de la bétadine et de l'éthanol à 70%.
- Effectuer une laparotomie médiane et identifier le caecum.
- Ligaturer la partie distale 50% du caecum exposée avec une suture de soie 4-0 et le caecum perforation distale de la ligature avec un passage d'une aiguille de calibre 21.
- Fermer l'incision avec des sutures en soie 4-0 stériles.
- Image après 4 h et24 heures.
- Oral tétrachlorure de carbone (CCl 4) l'administration
- Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2.
- Administrer CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO) dissous dans l'huile de maïs par gavage oral. La procédure de CCl4 administration doit être effectuée dans une zone désignée conformément à l'IBC / EHS politiques.
- L'image après 4 h et 24 h.
2. L'acquisition d'une image Bioluminescent
- Initialiser le IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) système d'imagerie, réglé sur le mode de luminescence, et attendez que le dispositif à couplage de charge (CCD) pour verrouiller la température.
- Sélectionnez la durée d'exposition, binning (moyenne) et F / Stop (8) paramètres.
- Souris placer en position couchée dans la chambre d'imagerie sur une platine chauffante pour maintenir la température normale du corps. Administrer une anesthésie selon la coiffe par 1,2 alors que les souris sont dans la chambre d'imagerie IVIS.
- Administrer L-012 (20 pg / g) dissous dans du PBS stérile (10 pg / pl) par voie intraveineuse via rétro-orbitaire d'injection à chaque moment choisi pour l'imagerie.
- Capturez des images en commençant à 2 min après injection de L-012. Nous utilisons généralement une exposition de 40 sec.
3. Analyse des données en utilisant la région d'intérêt
- Analyser les données en utilisant un logiciel image vivante v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Ouvrez une image et sélectionner la mesure de la Région d'outils d'intérêt.
- Sélectionnez la région de la forme et de la taille d'intérêts sur la poitrine et / ou l'abdomen après superposition d'une image pseudo-couleur numérique (représentant la détection de photons) sur une image photographique de la souris.
- Quantifier l'intensité du signal (flux de photons) de la région d'intérêt.
4. Statistiques
- Utilisez statistique progiciel d'analyse à effectuer deux ANOVA avec correction de Bonferroni post-tests à des moments différents.
Zymosan est un produit pro-inflammatoire des cellules de levure mur et un puissant activateur de la NADPH oxydase 3. Nous avons montré précédemment que zymosan intratrachéale induit une inflammation des poumons plus robuste neutrophiles et la production de cytokines pro-inflammatoires dans p47 phox-/ - par rapport au type sauvage souris 1. Ici, notre objectif était de comparer la génération de ROS dans les poumons de type sauvage et p47 phox-/ - souris à la suite défi zymosan. A 4 heures après administration intratrachéale zymosan, nous avons observé une augmentation significative de l'émission de photons sur la poitrine chez les souris de type sauvage par rapport au scénario de référence, ainsi qu'une augmentation de l'émission de photons dans de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont à 4 h et 24 h. En revanche, les signaux de bioluminescence en p47 phox-/ - souris sont restées au niveau de référence à 4 h après le traitement zymosan (Fig.1 AB). Ainsi, la NADPH oxydase semble be la principale source de production de ROS dans les poumons après l'administration zymosan.
Ensuite, nous avons évalué la production de ROS dans le modèle de septicémie CLP-induite. Le sepsis est un syndrome potentiellement mortelle associée à des organes cibles des blessures, y compris une lésion pulmonaire aiguë (ALI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) 4, 5. ROS médiée par des blessures a été considérée comme un facteur important dans induite par le sepsis dysfonction d'organes multiples. Nous avons constaté que les ROS ont été considérablement augmenté au cours de la poitrine (4 h) et sur l'abdomen (24 h) à la suite CLP souris de type sauvage par rapport à la valeur initiale. Cependant, les niveaux de ROS en p47 phox-/ - ont étaient similaires aux niveaux de référence à des points temporels deux (Fig.2 AC). Ces résultats montrent que la génération de ROS dans le modèle CLP-induite septicémie souris est NADPH oxydase dépendante.
Enfin, nous avons utilisé l'imagerie par bioluminescence pour détecter la production de ROS dans un CCl 4-induite mode de lésions hépatiquesl. CCl 4 provoque une nécrose hépatocellulaire, et a été utilisé pour modéliser à la fois une atteinte hépatique aiguë et 6 fibrose hépatique. Contrairement aux modèles décrits précédemment de l'inflammation et des blessures, nous avons constaté que la production de ROS dans l'abdomen était modeste (environ 35%) a augmenté par rapport au départ de p47 phox-/ - souris à 4 heures après l'administration de CCl 4. Cependant, l'ampleur de CCl 4 induite par les ROS génération était significativement plus élevée chez les souris de type sauvage que dans p47 phox-/ - ont (Fig.3 AB). Ces données suggèrent que l'p47 phox génération contenant du NADPH oxydase dépendante et indépendante de ROS se produire dans CCl atteinte hépatique aiguë 4-induite.
Figure 1. Production de ROS dans les poumons après le traitement zymosan. A) représentant bioluminescenCE imagerie de la production de ROS. Notez qu'en plus de la poitrine, la luminescence est détectable sur l'abdomen à la fois de type sauvage et p47 phox-/ - souris et la luminescence abdominale est inchangée par le traitement zymosan. B) comptages de photons de la poitrine de type sauvage et p47 phox-/ - souris après une seule injection intra-trachéale (IT) du zymosan. Imagerie par bioluminescence a été initialement réalisée, 4 h et 24 h. Émission de lumière à partir de la région d'intérêt sur la poitrine a été identifié en utilisant la pseudo-couleur indiquée échelle. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 6-9 par groupe, * = p <0,05. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Détection de ROS suite CLP. Une imagerie) représentant la bioluminescence de la production de ROS, BComptages de photons) de la poitrine, et C) comptages de photons de l'abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 h, et 24 h après CLP. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 4-5 par groupe, * = p <0,05. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Production de ROS dans l'abdomen après CCl 4-lésions hépatiques induites. Une imagerie) bioluminescence Représentant de la production de ROS et B) comptages de photons de l'abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 heures et 24 heures après l'administration orale CCl 4 traitements. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SE;. N = 4-5 par groupe, * = p <0,05 Cliquez ici pour agrandir la figure
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Discussion
"En temps réel" la mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS) chez les animaux vivants peuvent être obtenus en utilisant des sondes fluorescentes et chimiluminescence. Tandis que les sondes fluorescentes comportant souffrent de faiblesse de signal sur bruit 12, la technique d'imagerie décrit est plus sensible à la détection de l'émission de lumière à la suite d'une réaction chimique de ROS avec le substrat à base de luminol L-012. Comme toutes les techniques d'imagerie bioluminescente, cette méthode est limitée par absorption de la lumière de longueur d'onde dépendant et se dispersent par les organes et les tissus. Ces expériences ont été concentrés sur l'établissement de bonnes conditions expérimentales pour la mesure du ROS en type sauvage et p47 phox-/ - souris. L'utilisation de ces souris génétiquement modifiées permet de différencier ROS générés par p47 phox de la NADPH oxydase contenant du ROS générés par d'autres voies.
Bien que la NADPH oxydase fonctionnel contenant p47 phox estune source majeure de ROS, d'autres isoformes de la NADPH oxydase existent, et d'autres systèmes de génération de ROS, y compris la xanthine oxydase et la respiration mitochondriale, peut produire des ROS. NADPH oxydase et d'autres ROS génératrices de voies peuvent avoir des effets importants et interactive sur les défenses de l'hôte aux antimicrobiens et les voies de signalisation en aval qui modulent l'inflammation et des blessures 7-10. En utilisant l'imagerie par bioluminescence, nous avons pu mesurer la cinétique de la production de ROS in vivo et de délimiter la contribution de la NADPH oxydase à des niveaux de ROS dans différents modèles inflammatoires.
Une limitation de cette méthode concerne la résolution spatiale de la bioluminescence. Même si nous pouvons mesurer la luminescence dans les compartiments anatomiques spécifiques (par ex., Thorax, abdomen), il est difficile de localiser le site anatomique de la luminescence au niveau des organes. Dans chacun de nos modèles expérimentaux nous avons choisi 3 points dans le temps pour les mesures bioluminescentes: base, 4 h, et 24 h. Nous ne savons pas si bioluminescente imagerie permet d'identifier de petites différences dans la production de ROS sur de plus courtes intervalles d'analyse ou si la relation entre la génération de ROS in vivo et bioluminescence est linéaire. Ces questions exigent une étude plus approfondie. Dans les modèles utilisés pour ces études, nous pensons que les cellules phagocytaires, les neutrophiles et les macrophages recrutés, sont principalement responsables de la production de ROS par le système de la NADPH oxydase phagocytaire. Les futures études dans lesquelles des types cellulaires spécifiques sont épuisés ou chimères os sont générés pourraient fournir des connaissances supplémentaires sur les niveaux relatifs de production de ROS de différentes populations cellulaires. Une autre limite potentielle d'études utilisant L-012 est que les radicaux d'autres (en dehors de ROS) peuvent réagir avec cette sonde luminescente, réduire la spécificité pour la détection des ROS dans certaines circonstances.
Après injection de zymosan, le manque de production de ROS dans p47 phox-/ - ont indique que la NADPH oxydase estla principale source de ROS dans ce modèle d'inflammation pulmonaire. CLP est l'un des modèles animaux les plus courantes de la septicémie et de l'imagerie par bioluminescence 11 a révélé une augmentation à la fois des signaux ROS dans les poumons et l'abdomen qui sont NADPH oxydase dépendante. Contrairement à la zymosan et modèles CLP, ROS ont été augmentés dans l'abdomen de deux de type sauvage et p47 phox-/ - ont rapport aux valeurs initiales, mais à un degré plus élevé chez les souris de type sauvage, ce qui indique que la CCl 4 induit la production de ROS par p47 phox - contenant de la NADPH oxydase et d'autres mécanismes.
En résumé, nos données montrent que la méthode à base de luminol bioluminescence d'imagerie pour la détection des ROS peut être un outil précieux pour la recherche sur la réglementation et les conséquences de la production de ROS in vivo.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le NIH RO1 AI079253 et le ministère des Anciens Combattants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
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