Summary
玻璃棉过滤器已用于水性病毒集中了世界各地的研究小组。在这里，我们表明兴建玻璃棉过滤器的一个简单的方法，并展示过滤器也有效地集中水性的病毒，细菌和原生动物病原体。
Abstract
关键的第一步是在怀疑受污染的水的病原体水平评估中的浓度。浓度的方法往往是具体 的特定病原体，例如，美国环境保护局方法1， 贾第鞭毛虫和隐 1623，这意味着需要多种方法，抽样方案，如果针对多个病原体组。目前的方法的另一个缺点是可以是复杂和昂贵的设备，例如，集中病毒2 1MDS滤芯过滤器VIRADEL方法。在这篇文章中，我们描述了如何构建集中水源性病原体的玻璃纤维过滤器。经过过滤洗脱，浓缩是服从第二个浓度的步骤，如离心，文化或分子生物学方法的病原体检测和枚举。该过滤器有几个优点。建设是很简单的过滤器，可以建立一个NY大小为满足特定的取样要求。过滤器零件价格便宜，从而有可能严重影响项目预算的情况下收集大量的样品。大样本量（100到千件L）可以集中根据浊度堵塞率。高度便携和过滤器是用最少的设备，如泵和流量计，他们可以在现场实施抽样成品饮用水，地表水，地下水，农业径流。最后，玻璃纤维过滤是有效集中各种病原体的类型，所以只有一个方法是必要的。在这里，我们集中水性人类肠病毒， 隐孢子虫 ，S almonella肠炎，禽流感病毒的报告过滤器的有效性。
Protocol
1。准备玻璃棉
- 使每批过滤器前后，用10％漂白粉溶液消毒工作区。
- 戴上手套和礼服。至少20分钟，在121°C和15磅高压灭菌消毒桶。放置在无菌桶玻璃棉。
- 玻璃棉与反渗透水饱和，让浸泡15分钟。
- 排水反渗透水从桶。
- 1 M盐酸饱和玻璃棉，让浸泡15分钟。
- 从桶里漏1 M盐酸。
- 用反渗透水冲洗玻璃棉。
- 调匀。
- 使用pH试纸检查pH值和重复反渗透水冲洗直到pH值达到中性。
- 倒出用水冲洗。
- 1 M氢氧化钠饱和的玻璃棉让浸泡15分钟。
- 从桶里漏1 M氢氧化钠。
- ŕEPEAT反渗透冲洗直到pH值达到中性。
- 倒出用水冲洗。
- 玻璃棉洗衣机，而不是一个水桶，可以构建，这是类似的设计，以玻璃吸管垫圈（图1）。
- 玻璃棉完全覆盖无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的调整，以pH值6.8。
- 准备玻璃棉立即或商店使用4°C。它可以存储长达两个星期。在使用之前，确保pH值是中性的，因为它会随着时间的推移上升。如果不是中性的pH值，重新冲洗，用无菌磷酸盐缓冲液（pH值6.8）。
2。装配玻璃纤维过滤器
- 钻一个11/16英寸成男性适配器尼龙配件可以拧成的上限，PVC帽和丝锥螺纹孔。这一步是必要的，只为第一大会。此后，上限可以使用多年。适用于聚四氟乙烯尼龙接头的螺纹和螺纹瓶盖的磁带。
- 包与玻璃棉小块的PVC管。使用金属柱塞，像汽车发动机气门，包紧。包装并不需要很大的力量。包装不够紧，使玻璃棉停留在地方和渠道没有形成。然而，不要包得那么紧水可以通过过滤器，不流。适当的包装时，每分钟4至5升的流速应达到40-60磅之间的压力过滤器附有水龙头。在该协议中指定的PVC管大小，约85克洗净，每管使用填充玻璃棉。顶级的负载平衡和与水洗玻璃棉包空PVC管，直到皮管质量增加85克。
- 男性适配器尼龙件连接，插入的PVC帽聚丙烯网状。
- 铁氟龙胶带，PVC管螺纹部分。
- 对PVC帽螺丝的PVC带够IPE和标签过滤年底的流入和流出的另一端。这是很重要的，后来为洗脱步骤。这到底是贴上标签流入不要紧。
- 推60毫升无菌磷酸盐缓冲液（pH值= 6.8）到过滤器的使用导管倾斜注射器。多余出来的另一端。
- WRAP结束与石蜡膜紧密，以避免漏水。过滤器可存储长达30天，在4°C
3。抽样
- 抽样采用循环或浸泡30分钟的项目，在0.525％的次氯酸钠（即，一个标准的家用漂白水的10％溶液）消毒管。按照排水次氯酸钠溶液与0.05％的硫代硫酸钠，加入25毫升2％的股票无水硫酸钠解决一公升逆渗透水和消除。
- 样品pH值超过7.5的水，调节pH值介于6.5和7.0用盐酸。盐酸浓度范围从0.25M到1 M。四升0.5 M盐酸一般是两个800升的样本，根据水环境的pH值和缓冲能力，足够的。使用蠕动泵或文丘里（图2）抽样过程中，注入盐酸。调节泵的转速或丘开幕，以实现目标的pH值。样线插座，使用领域的pH计测量的pH值。
- 玻璃棉过滤器堵塞，如果使用高浊度水预过滤器。 （预过滤器和其住房规格的材料清单在网上）。由于病原体可以连接到被困在预过滤的颗粒，它必须随着玻璃棉过滤洗脱（见下文）。
- 调整流速以2至4升/分钟。典型的样本量为200升和1500升之间。
- 在4°C断开玻璃棉过滤器在一个塑料无菌袋和存储长达48小时。
4。洗脱
- 贴上玻璃纤维过滤器一环站在指向样品流入年底下降到聚丙烯瓶。洗脱的样品流的方向相反。
- 推80毫升无菌的3％，牛肉膏0.05 M甘氨酸与过滤器的pH值9.5。
- 等待15分钟。
- 进入过滤器的9.5 pH值在0.05 M甘氨酸推另一无菌的3％，牛肉膏80毫升。
- 推动空气彻底的过滤器，直到泡沫过滤器入口。
- 1 M盐酸洗脱液的pH值调整到7.0和7.5之间。
- 商店洗脱液在4°C的长达24小时或在-20°C，时间较长。
- 洗脱预过滤器，如果使用。松开住房墨盒的顶部和房屋内的所有残留的水倒掉，而持有的预过滤器的地方用无菌手套的手。
- 取出从住房墨盒的预过滤器和滑入15“×6”自封袋。
- 倒入200毫升无菌的3％，牛肉膏0.05 M G甜菜碱与成袋的pH值9.5和密封拉链锁安全。
- 反转袋装预过滤几次，以确保整个表面接触牛肉膏。
- 等待15分钟，偶尔反相和按摩袋装预过滤器。
- 打开拉链锁。手柄周围的预过滤袋紧紧地挤压出尽可能多的牛肉膏和拉带无菌手套的手，预过滤器，。
- 聚丙烯瓶倒入牛肉膏洗脱液。
- 洗脱液的pH值调整到7.0和7.5 1M盐酸。
- 商店洗脱液在4°C的长达24小时或在-20°C，时间较长。预过滤洗脱液可以单独分析病原体或玻璃棉过滤洗脱液相结合。
5。代表结果
| 病原 | 水浊度（台大） | 金额种子/ L，B，C，D | 回收率（％）±1个SD | 数独立试验 |
| 肠病毒脊髓灰质炎病毒萨宾第三 | 0.5 | 500 | 81％±11 | 7 |
| 肠脊髓灰质炎病毒萨宾三 | 0.5 | 5000 | 67％±12 | 8 |
| 肠病毒脊髓灰质炎病毒萨宾第三 | 215 | 500 | 59％±32 | 7 |
| 肠病毒脊髓灰质炎病毒萨宾第三 | 215 | 5000 | 38％±22 | 6 |
| 肠病毒脊髓灰质炎病毒萨宾第三 | 447 | 500 | 56％±18 | 8 |
| 肠病毒脊髓灰质炎病毒萨宾第三 | 447 | 5000 | 63％±37 | 8 |
| 隐孢子虫 | 0.5 | 5 | 38％±14 | 7 |
| 隐孢子虫 | 0.5 | 50 | 53％±19 | 8 |
| 哭泣ptosporidium孢子虫 | 215 | 5 | 40％±16 | 7 |
| 隐孢子虫 | 215 | 50 | 30％±6 | 6 |
| 隐孢子虫 | 447 | 5 | 33％±13 | 8 |
| 隐孢子虫 | 447 | 50 | 28％±11 | 8 |
| 沙门氏菌 | 0.5 | 5 | 29％±24 | 7 |
| 沙门氏菌 | 0.5 | 500 | 56％±16 | 8 |
| 沙门氏菌 | 215 | 5 | 32％±24 | 7 |
| 沙门氏菌 215 | 500 | 34％±11 | 6 | |
| 沙门氏菌 | 447 | 5 | 34％±18 | 8 |
| 沙门氏菌 | 447 | 500 | 31％±24 | 8 |
- 浊度单位
- 作为基因组拷贝/ L，肠列举的qPCR
- 小隐孢子虫的卵囊免疫荧光作为列举
- 沙门氏菌列举文化为菌落形成单位
表1。玻璃羊毛浓度不同的水浊度和病原菌密度。
| 病原 | 水样中的位置 | 金额种子/ L 一 | ％RECO很 |
| 禽流感H5N2病毒 | sundi湖，安克雷奇市镇 | 2500 | 42.9％ |
| 禽流感H5N2病毒 | 明托单位，费尔班克斯北极星自治市镇 | 2500 | 36.7％ |
| 禽流感H5N2病毒 | Portage的山谷，安克雷奇市镇 | 2500 | 7.8％ |
| 禽流感H5N2病毒 | 波特沼泽，安克雷奇市镇 | 2500 | 41.5％ |
| 禽流感H5N2病毒 | 湖边的柳树，育空地区的Koyukuk市镇 | 2500 | 15.5％ |
- 定量PCR测定基因拷贝/ L，
表2。玻璃禽流感病毒的羊毛含量在阿拉斯加从五个地点使用的水。
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图1图玻璃棉洗衣机。这可以用来代替一个桶，节约时间的冲洗。概念是类似玻璃吸管洗衣机。
图2。酸注射液由蠕动泵玻璃毛过滤。请注意样线之间的水龙头和玻璃棉过滤泵管引入酸的“T”连接器。 pH值的调整是必要的，只有水取样的pH值> 7.5。
玻璃棉过滤器有效地集中从水的浊度水平和病原体的密度（表1）广泛的病原体。为了测试这一点，20升脱氯自来水混合干淤泥壤土（0，1.27，或2.75克/升），浊度达到期望的水平，然后种植在不同密度的病原体。水传递是通过玻璃纤维过滤器，并列举了在洗脱液浓缩病原体，这个值是在％的回收率计算的分子。入水，也就是％的回收率计算的分母，接种病原菌的数量决定先播种到负洗脱液病原体，然后列举的病原体。负洗脱液准备通过一个过滤器的非种子选手20公升的样品和洗脱。量化负洗脱液接种的病原体，避免病原体列举的差异可能导致玻璃棉过滤器创建矩阵的差异。这一步的重要性，通过定量PCR定量病原体时，讨论在蓝波提尼等。3。 20公升的阴性对照样品，通过玻璃棉过滤，以确定有没有可能混淆％的回收率计算的本地病原体目前集中。 10微米的名义孔径预过滤器瓦特使用时≥215 NTU的浊度水平。
脊髓灰质炎病毒定量实时定量PCR，使用二次浓度和核酸提取程序和引物和探针描述在蓝波提尼等。3。隐孢子虫是在最后集中由脊髓灰质炎病毒的二次浓度过程中创建的样本量（FCSV）量化。卵囊免疫（MeriFluor 隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测试剂盒，经络生命科学公司，辛辛那提，俄亥俄州）的可视化。 沙门氏菌 XLD琼脂上的电镀量化的FCSV的（Remel，列涅萨，KS）和计数菌落形成单位。
玻璃棉过滤器是在有效地集中禽流感病毒（见表2）。低致病性禽流感病毒（H5N2型）从几个地点在阿拉斯加和入水播种％的回收率计算，描述ABOVE。中学浓度为脊髓灰质炎病毒;病毒核酸程序进行了定量PCR定量使用的引物和探针Spackman 等4。
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Discussion
玻璃棉过滤器已使用的几个研究小组3,5,6集中精力从各种水源，如成品饮用水，地下水8,9，10地表水，海水，废水12人的肠道病毒，农业径流13。在这里，我们报告的过滤器也有效的禽流感病毒以及细菌和原生动物病原体沙门氏菌 （伤寒沙门）和隐孢子虫 ，分别在集中。 deboosere 等。最近还报道了玻璃羊毛浓度禽流感病毒14。
过滤器是有利的，因为它们是廉价，高度便携，在水矩阵的广泛使用，有效地集中水性病原体的种类很多。他们可以构建任何大小，取决于研究的需要。经过消毒离子，过滤器外壳可重复使用。
玻璃棉过滤器，但是，这样做有其局限性。与任何病毒浓度的方法，对病毒吸附（如，1MDS过滤，CUNO公司公司，梅里登，电脑断层）electropositively收取媒体的依赖，过滤器的有效性取决于环境水的pH值。在我们的实验室中，我们选择了截止pH值7.5，水的pH值以上向下调整，通过不断注入0.25 M盐酸在采样滤波器的输入线。未经调整pH值较高的pH值水域进行采样，但在过滤器的有效性3的成本。另一个限制是保质期。我们已经表明的过滤器保存在4°C的六个星期，病原体的浓度效果不下降（未发表资料）。尽管如此，储存时间较长，没有经过测试，保守，以确保数据的质量，我们不使用30天以上的过滤器。通常，过滤器的需要。在一些countrie的另一个潜在障碍s是获得在以前的文件中指定的法国源玻璃棉。最近，我们证明标准unfaced玻璃纤维绝缘同样有效，这很容易从硬件或家装店（见材料清单在网上）。
对于所有的实验中，重要的是要运行的控制，两套设备的空白，以确保玻璃棉过滤器并没有在施工期间和恢复控制污染，以确保过滤器的工作设计。这些管制是必要的任何水性病原体浓度的方法。
使用玻璃纤维过滤器可以附加到一个水龙头，打开水龙头一样简单或如采样泥沙的河流，在远程位置需要泵，调节pH值，和一个预过滤器，以防止堵塞复杂的。对于我们的研究小组，使用玻璃纤维过滤器的最大好处是成千上万的水样收集和分析的能力人类和牲畜的病原体不会更加昂贵，13,15复杂的方法是可行的环境中的病原体的数量和分布上产生的数据，。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢叙述视频威廉·T·埃克特。发展的玻璃棉协议的一部分是在威斯康星州的水和卫生审判肠溶风险（WAHTER研究）资助，由美国环保署STAR格兰特R831630。 A.穿过，A. Ramey，和B Meixell阿拉斯加样品收集来自美国地质调查局的财政支持。任何贸易，产品或公司名称的使用仅是描述目的，并不意味着美国政府认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
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