Summary
Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.
Abstract
Pluripotency ve kendini yenileme embriyonik kök hücreleri iki belirleyici özellikleri (ES hücreleri) vardır. Altta yatan moleküler mekanizmayı anlamak oldukça gelişimsel biyoloji çalışmaları, hastalık modelleme, ilaç keşfi ve rejeneratif tıbbın (1,2 gözden) ES hücrelerin kullanımı kolaylaştıracaktır.
ES hücre bakım ve kendini yenileme romanı düzenleyicilerinin belirlenmesi ve tanımlanması hızlandırmak için, kantitatif Oct4GiP hücreleri kullanarak fare 3 ES hücrelerinin kendini yenileme durumunu ölçmek için floresans muhabiri bazlı analiz geliştirdi. Oct4GiP hücreleri 4,5 Oct4 geninin promotor bölgesinin kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder. Oct4 farklılaşma 6,7 sırasında ES hücre kendini yenileme için gereklidir ve son derece ES hücreleri ile ifade edilir ve hızlı bir şekilde aşağı düzenlenir. Bunun sonucu olarak, raportör hücrelerinde GFP tanımı ve floresans aslına ilişkilendirenES hücresi kimlik 5 ve floresans-aktive hücre ayırma ile (FACS) analizi yakından tek hücre seviyesinde 3,8 azından hücrelerinin kendini yenileme durumunu kontrol etmek için kullanılabilir.
RNAi ile birleştiğinde, Oct4GiP reporter assay hızlı ES hücre bakım ve kendini yenileme 3,8 regülatörleri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir. Kendini yenileme içlin diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha fazla, uygun duyarlı, kantitatif, ve daha düşük maliyetli taşımaktadır. Bu tür yüksek verimli ekranlar veya genetik epistasi analiz gibi büyük ölçekli çalışmalar için veya plakaları 384-iyi - 96 yapılabilir. Son olarak, diğer soy özel muhabiri ES hücre hatları kullanılarak, biz burada açıklamak tahlil de ES hücre farklılaşması sırasında kaderi özellikleri incelemek için modifiye edilebilir.
Protocol
1. Oct4GiP Fare ES Hücre Bakım
Oct4GiP hücreleri nazikçe Dr Austin Smith tarafından sağlandı. Onlar bir Oct4-GFPiresPac transgen 4,5 taşıyan 129/Ola farelerden elde edilmiştir. Bunlar ESGRO tam artı klonal dereceli orta (Millipore), ya da M15 ortamda jelatin kaplı doku kültür plakaları içinde muhafaza edilir: DMEM (Invitrogen)% 15 FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x olmayan ile desteklenmiş temel amino asitler (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), ve 10 uM β-merkaptoetanol.
- 30 dakika için oda sıcaklığında% 0.1 jelatin (Sigma) (0.1 ml jelatin çözeltisi / cm 2) ile kaplamak plakaları.
- Plaka Oct4GiP ~ 2 jelatin kaplı plakalar hücreler x 10 4 / cm 2.
- % 0.05 tripsin ile her iki günde bir hücre bölün.
2. Oct4GiP Hücrelerinde siRNA Transfeksiyon
Oct4GiP reporter assay en convenien olduğunuM15 orta veya levha 384-iyi (Corning veya BD) - tly jelatin kaplı düz dipli 96 yürütülmektedir. Genel prosedürü Şekil 1'de belirtilmiştir.
- siRNA-lipid kompleksleri montaj:
- 96-kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, U-alt siRNA-lipid kompleksler 96-kuyucuklu plaklar araya.
- Her bir yanı içerisinde, 10 ul OptiMem (Invitrogen) ve 0.3 ul lipofektamin 2000 (Invitrogen) karıştırmak ve 5 dk için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Lipid-OptiMem karışımına 5 pmol siRNA ekleyin ve bir 15 dakika daha inkübe edilir. SiRNA: 6ul: yağ oranı 100 pmol olduğunu.
- Bir çok kanallı pipet yardımıyla jelatin kaplı düz alt plaka U-alt plaka OptiMem yılında siRNA-lipid kompleksleri aktarın.
- 384 kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, 0.1 ul lipofektamin 2000 ve 10 ul OptiMem içinde 2 pmol siRNA kullanılarak siRNA-lipid kompleksleri hazırlanır.
Not: nihai konsantrasyon siRNATransfeksiyonlar 50 nm'dir. 3-4 biyolojik yürütmek her siRNA transfeksiyon için çoğaltır. Düz alt jelatin kaplı plaka içine U-alt plaka ve tablet olarak siRNA-lipid kompleksleri ana karışımları ayarlayın.
- Oct4GiP hücre kaplama ve transfeksiyon:
- 96-kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, Oct4GiP hücreleri toplamak ve 9 x 10 4 hücre / ml taze M15 ortam içinde yeniden süspanse bunların.
- Ayrıca, bir çok-kanallı pipet kullanılarak her biri için hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin.
- 3-5 kez aşağı yukarı pipeting tarafından iyi öncesi bölünüp siRNA-lipidler kompleksleri ile hücre süspansiyonu karıştırın. Farklı siRNA Transfeksiyonlar için ipuçları değiştirin.
- 384 kuyucuklu plaklar, Pastör pipetiyle Oct4GiP hücrelerinde Transfeksiyon için 6 ila 10 x 4 hücre / ml her oyuğa ve tablet 30 ul hücre süspansiyonu.
Not: optimum hücre yoğunluğu, genellikle kaplama 3 x 10 5 hücre / cm 2, ancak may dramatik bir hücre büyüme veya canlılığını etkileyen siRNA'lar için daha fazla optimizasyon gerektirir. Düşük yoğunluklu kaplama transfeksiyon sırasında kötü hücre sağkalım yol açacaktır. Yüksek kaplama yoğunluğu yüksek hücre izdiham bağlı farklılaşması nedeniyle yüksek arka yol açacaktır. Eğer 2-4 x 10 5 hücre / cm 2 arasında gerekli test kaplama yoğunluğu.
- Orta değişikliği:
- Çok kanallı aspiratör (Corning) veya vakum değnek (VP-Scientific) kullanılarak eski orta çıkarın. Plakalar altındaki hücreleri çizmemeye dikkatli olun.
- Her gün çok kanallı pipet kullanarak taze ES hücre orta (384-de plaka için 96-plaka ve 30 ul 100 ul) ile hücrelerin besleyin.
3. FACS analizi
- Hücre ayrışma:
- Dört gün transfeksiyondan sonra, çok kanallı aspiratör (Corning) veya vakum değnek (VP-Bilimsel) kullanarak, orta kaldırın.
- 96 oyuklu plakalar için, 100μ ile bir kez hücreleri durulamal PBS.
- Iyi çok kanallı pipet kullanarak her 25 ul% 0.25 tripsin ekleyin.
- Ara sıra ajitasyon ile 5minutes için oda sıcaklığında inkübe edilir, ve görsel hücrelerin tam dekolmanı sağlamak için kontrol.
- Tripsin inaktive ve tekrarlanan pipetleme tek bir hücre süspansiyonu olarak hücreleri ayırmak için% 10 FCS ile 90 ul PBS ekleyin.
- 384-iyi plakalar için,% 10 FBS ile 30 ul PBS ile 10 ul tripsin ve soğutmadan hücreleri kesmek.
- FACS analizi:
- HTS ünitesi veya diğer benzer donanımlı FACS analizörü (örneğin Accuri veya Intellicyt gibi) ile donatılmış BD LSRII FACS analizörde GFP floresans analiz edin.
- HTS üzerinde yüksek verimlilik modu kullanın ve hücre süspansiyonu 10 ul analiz. 1.0 x 10 4 hücrelere sayısı eşiği ayarlayın.
- Ileri vs yan scatter plot hücreleri yakalamak için PMT voltaj ve eşik ayarlayın. Forw canlı hücre popülasyonu için Kapısıard vs yan scatter plot.
- GFP kanal için bir histogram grafiği oluşturun. Hücrelerinin ~% 10 sahte veya kontrol siRNA-transfekte edilmiş hücrelerde GFP-negatif olarak görünür şekilde GFP kanalda kapısı ayarlanır.
- % Farklılaştırılmış hücreler =% GFP-negatif: Her tedaviden% GFP-negatif hücreleri belirleyin. 2 kuyruklu t-testi kullanılarak deney-kontrol-siRNA transfeksiyonlar arasında% Farklılaştırılmış hücreleri karşılaştırın ve p değerleri <0.01 ile pozitif hit puan.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Oct4, Nanog ve Sox2 ES hücre kendini yenileme 6,7,9-11 bakımında kritik bir rol oynayan üç gen vardır. Şekil Oct4GiP reporter assay kolaylıkla bu faktörlerin susturmak kaynaklanan farklılaşma tespit edebilen 2 gösteri Oct4GiP ES hücreleri.
Şekil 2A ES olarak bakımı yapıldığında Oct4GiP ES hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermektedir . Şekil 2B hücreleri ileri vs yan dağılım çizim ve kontrolü-ya da-Oct4 siRNA'lar ile transfekte edilmiş hücrelerin Oct4GiP GFP kanalının histogram gösterir. Ölü hücreleri ve enkaz GFP-negatif ve arka plan artacak gibi, ileri vs yan scatter plot canlı hücreler için kapısı gereklidir. Diğer taraftan, mümkün hücre kümeleri dışlamak için ayrımcılık eş her zaman gerekli değildir. Kontrol-siRNA transfekte hücrelerinde, hücrelerin büyük çoğunluğu GFP-pozitif olmalıdır. Bariz GFP-negatif popülasyonları kontrol siRNA transfekte kuyularda varsa, başlangıç Oct4GiP hücreleri veya transfeksiyon prosedürü tehlikeye olabilir ve sonuç yorumlanabilir olmayabilir.
Şekil 2C den% Farklılaştırılmış hücreleri (% Farklılaştırılmış hücreleri =% GFP-negatif hücreler) grafik gösterir kontrol, Oct4-, Nanog-ve Sox2-siRNA transfekte hücreler.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Oct4GiP reporter assay Taslağı.
Şekil 2. Oct4GiP reporter assay Nanog, Oct4 veya Sox2 suskunluğu neden ES hücre farklılaşması algılayabilir. A) E14Tg2a (yabani tip, siyah çizgi) ve Oct4GiP (yeşil hat) hücreler FACS analiz edildi. GFP-kanalının histogram Oct4GiP hücreleri GFP-pozitif olduğu. B) Oct4GiP hücreleri Kontrol-ya da-Oct4 siRNA ile 96-kuyucuklu plaklar içinde transfekte edilmiş ve transfeksiyondan FACS 4 gün sonra incelendi gösterir. İleri Transfekte edilmiş hücrelerin GFP-kanalının yan saçılım histogram vs gösterilmiştir. C) Oct4GiP hücreleri ile transfekte edildi Kontrol-,-Nanog, Oct4-, veya-Sox2 siRNA. % Farklılaştırılmış Hücreler% 4 gün transfeksiyondan sonra hücreler GFP-negatif tespit edildi ve + / ortalama olarak çizilmiştir - ortalama standart hata (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif Oct4GiP reporter assay kantitatif kendini yenileme vs farklılaşma derecesini ölçebilirsiniz. Böyle morfolojisi tabanlı 12 ve proliferasyonu / deneyleri yaşayabilirliği bazlı gibi diğer yöntemler kullanılabilir, ile karşılaştırıldığında, daha yüksek verim ve hassasiyet yanı sıra ES hücresi durumunu daha doğrudan bir ölçüm sunmaktadır. Bu yüzden de, büyük ölçekli ekranlar ve genetik epistasi analizi için son derece uygundur. Nitekim, biz ve diğerleri başarıyla genom RNAi ekranlar 3,8 için Oct4GiP reporter assay kullandık. Bütün deneyler gibi, ancak, aynı zamanda sınırlamaları vardır. Bu sadece doğrudan ya da dolaylı olarak Oct4 teşvik edici aktivite düzenleyen genler incelemek için, ve sahte-sonrası transkripsiyonel GFP tanımı, stabilite, veya fonksiyon bozukluğuna genlerin tanımlanması olabilir kullanılabilir. Bu nedenle, ek testler ya da alkalin fosfataz boyama 13 (Millipore, SCR004) ve immünfloresan boyama ve kantitatif RT gibi ikincil ekranlar,Pluripotency belirteçlerin-PCR 3,8,12,14 bu yöntem elde edilen sonuçları doğrulamak için gereklidir.
Oct4GiP reporter assay verimli gen suskunluğu dayanır. Etkili ve verimli siRNA'lar siRNA transfeksiyonlar testin başarısı için anahtardır. Sadece siRNA Transfeksiyonlar ile reporter assay of kullanımı tarif olmasına rağmen, aynı zamanda test sessiz veya ilgi olarak artmış genleri için DNA Transfeksiyonlar ile gerçekleştirilebilir. DNA transfeksiyon verim siRNA'lar göre daha düşüktür ve genellikle fenotip mukavemeti azaltabilir.
Ne bu protokol tanımlanmıştır yanı sıra, Oct4GiP reporter assay de olumsuz biçimde kendini yenileme düzenleyen genlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için değiştirilebilir. Bu durumda, hücreler siRNA'lar ile transfekte edilebilir ve farklılaşmasını koşulları kültürlenmiştir. Kendini yenileme olumsuz düzenleyicilerinin susturma kendini yenileme geliştirmek ve d olabilir GFP, kışlayanbenzer olarak geçerli protokol açıklanan FACS tarafından etected.
Oct4GiP raportör hücrelerin yanı sıra, bu tür Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) ve Rex1-GFP 19 hücreleri gibi ES hücresi spesifik arttırıcılar olarak, kullanılan diğer reporter hücre hatları, ayrıca üretilen edilmiştir. Ayrıca, aynı stratejisi ile ES hücresi kendi kendine yenilenmesi ve bakım incelemek için kullanılabilir. Bu ES hücre işaretleyici gen promotor aktivitesi ve özgüllük hissedilir bir fark yoktur, çünkü Ancak, bu muhabir hücre hatları arka plan seviyesi ve duyarlılık açısından farklı davranırlar ve böylece birbirlerini tamamlayacaktır. Son olarak, diğer soy özel muhabiri ES hücre hatları kullanarak, bizim strateji ES hücrelerinin kader özellikleri incelemek ve memeli erken gelişimi için bir in vitro model olarak ES hücre kullanımını kolaylaştırmak için değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz okuma ve yazma düzenleme için Brad Lackford teşekkür ederim. Bu araştırma, Çevre Sağlığı Bilimleri, Sağlık İntramural Araştırma Programı Z01ES102745 National Institutes (GH) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
