Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

Published: September 2, 2012 doi: 10.3791/4001
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Membrane Structural and Functional Biology Group, Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology, Trinity College Dublin

Summary

במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.

Abstract

מסלול חשוב להבנה כיצד חלבונים לתפקד ברמה מכניסטית הוא לקבל את המבנה של חלבון המטרה הזמין, באופן אידיאלי ברזולוציה אטומית. נכון להיום, יש רק דרך אחת כדי ללכוד מידע מסוג זה כפי שהוחל על חלבונים אינטגרליים בממברנה (איור 1), ואת הקומפלקסים שהם יוצרים, ושיטה שהיא רנטגן קריסטלוגרפיה macromolecular (MX). כדי לעשות גבישים באיכות עקיפה מושלמת יש צורך בו, במקרה של חלבונים בממברנה, לא יוצר בקלות. שיטה לגיבוש חלבונים בממברנה, הכרוכים בשימוש בmesophases lipidic, במיוחד את השלבים העוקבים וספוג 1-5, זכתה לתשומת לב רבה של עקב האיחור להצלחות שהיו לה בתחום הקולטן G-חלבון בשילוב 6-21 (www . Mpdb.tcd.ie). עם זאת, השיטה, יקרא להלן בטווה או שיטת שלב מעוקב lipidic, מגיע עם טכני שלואתגרים. אלה נובעים, בחלקו, בשל האופי בדרך הצמיג ודביק של mesophase lipidic שבו הגבישים, אשר לעתים גבישי מייקרו, לגדול. מניפולצית גבישים הופכת להיות קשה כתוצאה ובעיקר במהלך קצירת 22,23. בעיות מתעוררות גם בשלב שלפני קציר אשר דורש כי צלחות זכוכית הכריך שבו גדלים הגבישים (איור 2) 24,25 נפתחות כדי לחשוף את בולוס mesophase, ובו הגבישים, לקטיף, קירור וcryo-X סופו של דבר איסוף נתוני עקיפה-ray.

וריאנטים mesophase מעוקבים וספוג (איור 3) שממנה יש לי rheologies נקטפו גבישים שונים השונה המהותי 4,26. השלב מעוקב הוא צמיג ודביק דומה למשחת שיניים עבה. לעומת זאת, בשלב הספוג הוא יותר נוזל עם נטייה מובהקת לזרימה. בהתאם לכך, גישות שונות להתגבשות פתיחת הבארות containiגבישי ng גדלו במעוקב ושלב הספוג נקראים לכפי שאכן שיטות שונות נדרשות לקציר גבישים משני סוגי mesophase. פרוטוקולים לעושים בדיוק את זה כבר מעודן ומיושם בממברנה ביולוגיה מבנית ותפקודית (MS & FB) קבוצה, והם מתוארים בפירוט במאמר זה יופיטר (איור 4). דוגמאות לכך הן נתונה של מצבים שבם מסתיימים בהצלחת הגבישים וcryo התקררו. אנו מספקים גם דוגמאות למקרים בם מתעוררות בעיות שהובילו לאובדן בלתי ההפיך של גבישים ונתאר כיצד בעיות אלה ניתן למנוע. במאמר זה מציג מסופק עם הוראות שלב אחר שלב לפתיחת בארות התגבשות כריך זכוכית, לקציר ולגבישי cryo-קירור של חלבוני קרום גדלו במעוקב ובשלבים ספוגים.

Protocol

1. המעבדה Set-up-קצירה קדם

  1. במסגרת הכנות לקצירה, למלא את הקצף היבש דיואר עם חנקן נוזלי ומניח אותו ליד מיקרוסקופ שבי קצירה היא לקחת את המקום.
  2. הצף את דיסקוס האחסון, פתח בסופו, בחנקן הנוזלי בתוך הקצף דיואר ולאפשר לה להתקרר לגמרי.
  3. Secure-Mount מייקרו בגודל שמתאים לגביש להיות שנקטף בשרביט מגנטי (איור 5). זה חשוב להיות על יד מספר השרביטים מגנטיים פנויים מראש עם מייקר mounts לספק עבור מצבים בו יש צורך כדי לקצור כמה גבישים מ1 בולוס. שרביטי חילוף צריכים להיות זמינים בכל העת.
  4. הנח micropipette, טיפים והפתרון החפוז ששמש לגידול גביש הסמוך למיקרוסקופ קצירה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לכסות mesophase וכדי למנוע התייבשות, כאשר גם הוא נפתח.
  5. האם מחברת ועט על הספסל קרוב ו / אוהמחשב לפתוח. אלה ישמשו כדי להקליט תצפיות לגבי האיכות, מראה, מיקום, מספר אחסון הדיסקוס, וכו ', של גבישים כפי שהם נקטפו, cryo התקרר והניחו באחסון.
  6. אם עוזר זמין כדי לעזור עם הקצירה שאדם צריך להבין את הפרוטוקול שיהיה ואחרי, סדר שבו הצעדים השונים יתקיימו, ותפקידם בתהליך הכולל ברור.

עם כל חומרים והציוד במקום המשימה הבאה שלנו היא:

2. זהה את הצלחות ובארות שמכילות גבישים

  1. השיטה ישירה והפשוטה ביותר למציאת גבישי harvestable היא לבדוק בארות ביד באמצעות מיקרוסקופ עם נורמלי ועם אור מקוטב מוצלב. כוונון עוצמת אור המאיר במיקרוסקופ יכול לעזור באיתור גבישים.
  2. לחלופין, imager בי צלחות מוקרנות באופן אוטומטי עם נורמלי וחצה לקטבד קל, יכול לשמש כדי לחפש גבישים.
  3. להעריך לפי עין נרשם תמונות דיגיטליות על צג מחשב.
  4. בבירור לסמן בארות אלה עם גבישים להערות קצירה ולהקליט על הגודל, איכות והמיקום של הגבישים בmesophase במחשב הנייד או במחשב.
  5. הסר את הצלחת המכילה גבישים לקציר מimager.

3. פתיחה טובה עם mesophase מעוקב. שיטה 1

הצלחות שבגבישים גדלים על ידי בשיטה טווה הן צלחות כריך זכוכית (איור 2). כדי לגשת mesophase והגבישים בו, יש צורך לפתוח גם. הדבר נעשה על ידי שימוש בכלי חיתוך זכוכית לחתוך coverglass העליון שגם חותמות שלאחר מכן ניתן להסירו.

ישנן מספר גישות לחיתוך והסרת coverglass מרחבי התגבשות היטב. אחד להשתמש מוכתב על ידי סוג oו mesophase בי הגביש נמצא גדל. זה יכול להיות שלב מאוד צמיג ודביק מעוקב (איור 3 א) או גרסתה הנזילה יותר, שלב הספוג (איור 3 ב '). במאמר זה וידאו אנו מראים כיצד לפתוח בארות ולקצור גבישים משני החומרים האלה אירוח.

  1. הנח את צלחת התגבשות כריך הזכוכית על הבמה של מיקרוסקופ אור.
  2. שימוש בכלי זכוכית ניקוד חיתוך coverglass בקלילות עם שני מעגלים קונצנטריים הממוקמים מעל spacer ורק מחוץ למתחם של הבאר. עם כלי חיתוך חדשים, ניקוד דורש לחץ המופעל מינימאלי. החלף את הכלי עם אחד חדש כאשר הלחץ הנדרש לניקוד גבוה עוד מזערי: זו מתרחשת בדרך כלל לאחר פתיחת 10 בארות.
  3. לשבור את הזכוכית במרחב שבין שני המעגלים קלעו למטרה של שחרור coverglass הפנימי. זה מייצר המון רסיסי זכוכית ואבק. נקה אותם עם טבולמגבת נייר.
  4. הסר את coverglass המשוחרר על ידי אחיזתו עם פינצטה חוד המשובח ולהטות אותה ומאת הבאר. במקרה זה, בשלב מעוקב נשאר תקוע במקום ועל כן הבסיס של הבאר.
  5. התקרבתי כדי לקבל תצוגה ברורה יותר של mesophase העוקב שהוא מוכן כעת לשימוש בקצירת גביש.

4. פתיחה טובה עם Mesophase העוקב. שיטה 2

  1. שימוש בזכוכית חיתוך ציון כלי קווים ישרים מקבילים בcoverglass לצד אחד של היטב ושמשתרע גם את עצמו. זה מאפשר גישה קלה יותר לפינצטה והסרת coverglass.

בהפגנה המסוימת הזה, coverglass סדקים בשחרור coverglass ממשטח spacer הדביק. בתהליך, coverglass משמרות בעמדה והמזרזת נפרד מהשלב מעוקב. כאשר coverglass יוסר חלק מהמזרז הולך עם זה. אנחנו נשארים עם ב חשופיםolus של mesophase ללא כל מזרז שמסביב. מייד להוסיף מזרז טריה μl 1 על גבי בולוס באמצעות micropipette למנוע mesophase מהתייבשות ועובר שינוי בשלב שעלול לגרום ניזק לגבישים. בולוס עכשיו הוא מוכן לשמש בקצירת גביש.

5. פתיחה טובה עם שלב ספוג. ללא הצלחה

שלב הספוג הוא פחות סלחני לעבוד עם בגלל היכולת שלו לזרום. אם כי תוצאות זרימה בשלב ספוג פניית ההיקף של קפילריות גם תמשוכנה את mesophase ואת הגבישים ייאבדו. דוגמה להפנינג זה מוצג בסרטון זה.

  1. קרב על שלב הספוג ולעבור קדימה ואחורה בין אור המקוטב רגיל וחצה לאיתור גבישים בשלב הספוג.
  2. במסגרת הכנות לפתיחת הניקוד היטב ולחתוך coverglass כמתואר בסעיף 3. בתהליך, coverglass סדקים. בניסיוןing כדי לפתוח גם את המשמרות הנחפזות בכיוון של הסדק וסופו של דבר זה בא במגע עם spacer. עם המזרז הולך חלק משלב הספוג ומטענה של גבישים שאבדו.

ברצף המסוים הזה, את המקטבים במיקרוסקופ לא חצו לגמרי, ואת הגבישים ניתן לראות עצמים בהירים באותו הזמן שגם התוכן שלה ויישארו גלויים.

6. פתיחה טובה עם שלב ספוג. בהצלחה

  1. קרב על שלב הספוג ולזהות גביש הוא באור מקוטב רגיל ומוצלב.
  2. ציון, לחתוך ולהסיר קטע coverglass מכסה היטב, כמו בסעיף 4.1. אור מקוטב חצה חלקי משמש למעקב אחר הגביש.
  3. להציג את ממחטת נייר יבש דרך הפתח בcoverglass ולתוך הבאר עד שפשוט נוגע בפתרון המזרז. אטומים לפתרון הזהירly עד שהוא כמעט כולו נעלם ולאחר מכן להסיר את הרקמה. זה גורם מזרז שנותר ושלב ספוג, עם הגביש עדיין במקום, לחזור בו תחת coverglass.
  4. ציון, לחתוך ולהסיר עם פינצטה שאר coverglass, כמו בסעיף 4.1. במקרה זה, בשלב הספוג מתפצל, חלק נשאר בבאר וכמה מקלות לcoverglass. הגביש הוא בבולוס על coverglass. מכיוון שקיים כיום מזרז מעט מאוד, שלב הספוג מתחיל לעבור שלב מעבר כנראה עקב התייבשות. ניתן לראות זאת כטבעת של שבירה כפולה שנודדת לכיוון מרכז בולוס. מייד להוסיף מזרז לבולוס לעצור את המעבר. בולוס הוא מוכן כעת לשימוש בקצירת גביש.

7. קצירה וקריסטלים Cryo-קירור מהשלב העוקב

  1. ללכת הלוך ושוב בין אור המקוטב רגיל וחצה לאיתור גבישים בבולוס שלב מעוקבים גם פתוח. ב לארצף הווידאו שלו עד ארבעה גבישי birefringent ניתן לראות בשלב בולוס מעוקבים עם אור מקוטב מוצלב.
  2. השתמש רכוב cryo-הלולאה (איור 5) לחקור mesophase נחשף זה עתה לגבישים, ודולה מגבישים, ואז לצלול, כלול בcryo-הלולאה, בחנקן נוזלי בדיואר מייד עם קצירה. באופן אידיאלי, הקצירה וSnap-הקירור צריכה לקרות בתנועה רציפה ומהירה אחד. כmesophase דבקות קטנה ככל האפשר, צריך להיות שנקטף עם הגביש. מניסיוננו, cryo-protectant אין צורך בגבישים בטוו שבגר.
  3. מאחר שלא ניתן לחפש את הגביש בcryo-הלולאה מייד לאחר הקצירה לבדוק בולוס mesophase משמש לקצירה כדי לוודא שהגביש הוא כבר לא שם העיד כי הוא היה לקצור הצלחה.

8. קצירה וCryo-קירור קריסטלים מהשלב הספוג

  1. ללכת הלוך ושוב בין אור המקוטב רגיל וחצה לאיתור גבישים בבולוס שלב הספוג בבאר פתוחה. ברצף בסרטון זה גבישי birefringent רבים ניתן לראות בבולוס תחת אור מקוטב מוצלב.
  2. השתמש רכוב cryo-הלולאה (איור 5) ודולה מגבישים משלב הספוג ולצלול, הכילה בתוך או על cryoloop, בחנקן נוזלי בדיואר מייד עם קצירה. כמו בקציר מהשלב מעוקב, באופן אידיאלי, תהליך cryo-הקירור צריך לקרות מייד הגביש הוא שנקטף בזמן מועט ככל elapsing בין אירוע הקצירה בפועל וצולל לתוך חנקן נוזלי אפשרי. כשלב ספוג קטן דבקות ככל האפשר, צריך להיות שנקטף עם הגביש. כאמור, cryo-protectant אין צורך בגבישים בטוו שבגר.

9. אחסון קריסטלים בדיוארס

  1. לאחר שצלל לתוך הלולאה רכובה ני הנוזליtrogen למקם אותו באחד מחריצי החזקת דיסקוס האחסון בקצף דיואר. כל המניפולציות עשו עם הלולאה, ראש השרביט המגנטי והדיסקוס שקוע בחנקן נוזלי.
  2. רשום את המיקום ופרטים של נקטף וגביש cryo מקורר במחברת ו / או במחשב.
  3. כאשר הדיסקוס בקצף דיואר מלא או קצירה ליום השלמת העברת הדיסקוס לדיסקוס בעל נגנז באחסון או ההובלה דיואר מלא בחנקן נוזלי. גבישים ניתן להעבירה בDewars תחבורה למתקן סינכרוטרון לאיסוף נתונים עקיפים.

10. נציג תוצאות

המטרות של הקצירה וcryo-קירור התרגילים הפגינו כאן הן להעביר את הגבישים מmesophase האירוח לcryo-לולאות, כדי להפוך לזכוכית קריסטל הכרך ולמקם אותו באחסון בחנקן נוזלי בדיואר. המצב האידיאלי הוא שבו וקצירת גריו הקירור נעשה באופן כזה שאיכות דיפרקציה של הגביש נשמרה בתהליך. כmesophase קטן ככל האפשר, צריך להיות שנקטף עם הגביש. זה הוא להפוך את איתור הגביש ומרכוזו בקרן רנטגן, שהרבה פחות מאתגר, כדי להאיץ cryo-קירור עם נוף לvitrification, וכדי למזער את הפרעת פיזור רקע מmesophase במהלך איסוף נתוני עקיפה. כמה דוגמאות של דגימות cryo המקוררים שבו ויכול שלא ניתן לראות את הגביש מוצגות באיור 6. איפה הגביש לא ניתן לראות בעין זה בדרך כלל צורך להיזקק לrastering העקיף כדי למצוא את הקריסטל ומרכזה, בקרן האור לנתונים 27 איסוף.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של קרום ביולוגי מראה bilayer שומנים ובאשר arדואר נמצא מגוון של חלבונים.

איור 2
איור 2. צלחת טעונה בהמלוא ונחתם 96-גם זכוכית כריך התגבשות. כל באר מכיל פתרון מזרז 1 μl שלב מעוקב 50 nl ו. למען בהירות, השלב מעוקב כבר מוכתם בסודאן אדומה והפתרון המזרז כולל כחול מתילן. מעיון 5.

איור 3
איור 3. גבישים של חלבוני קרום גדלו בmesophase lipidic.. השלב מעוקב עם גביש של bacteriorhodopsin מח halobium. B. שלב הספוג המכיל גבישים של ויטמין B12 קולט / טרנספורטר, BtuB, מE. coli. מעיון 25. השלבים העוקבים וספוג שמנוגדים appearances כמובן מאליו על ידי השוואת לוחות A ו-B בשלב מעוקב מאוד צמיג ושומר על צורתו המקורית. זה לא יזרום. הדבר בולט במיוחד בקצוות של בולוס mesophase בעלי מראה מחוספס. על פי חוזה, בשלב הספוג הוא הרבה פחות צמיג ועושה זרימה. לפיכך, שלב הספוג מצליח לשמר את צורתו המקורית והקצוות לא אופייני חלקים. מזרזים הכוללים Jeffamine, 400 PEG, 2-methyl-2 ,4-pentandiol, pentaerythritol propoxylate, butanediol וhexanediol, יכול לגרום למעבר מהעוקב לשלב הספוג 4,26.

איור 4
איור 4. תרשים הזרימה המסכם את השלבים הכרוכים בייצור, הקצירה וcryo-הקירור של גבישי חלבון קרום טווה גדלו-(). רק צעדים אלה שמוקפים באדום המקווקוקו, ותאר בפירוט ב( ב '), מכוסה במאמר זה יופיטר. לוח הוא מעיון 3. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. Cryo-לולאה ריקה רכוב על סיכה שנערכה במקום בשרביט מגנטי. נופים מורחבים של הסיכה () ומייקרו-Mount (ב) לכלי חשוב זה לקצירה וcryo-קירור מוצגים. הלולאה הריקה בסוף מייקר ההר בB היא 30 מיקרומטר בקוטר. למרות שלא נבדקו סוגי לולאה אחרים בהרחבה, אנו מוצאים כי MiTeGen לולאות עבודה הראתה היטב את שני השלבים העוקבים וספוגים.

איור 6
גבישי האיור 6. נקטף וcryo מקורר של חלבוני קרום בcryo-לולאות כפי שנצפה עם מיקרוסקופ באונליין בסינכרוטרון beamline., ב. דוגמאות של גבישים נקטפו (caa3 מונואמין ציטוכרום 34 (א), kinase diacylglycerol, DgkA (ב)) שבו הגבישים (חץ כחול) נראים דרך mesophase cryo המקורר בcryo-לולאה. דוגמא ג בי הגביש נקטף אינו גלוי בmesophase cryo המקורר בcryo-לולאה. הטיפ של הלולאה מזוהה עם חץ אדום. Mesophase cryo מקורר הדבקות מזוהית עם חץ כחול.

Discussion

במאמר זה וידאו שהראינו כיצד גבישים גודלו בmesophase lipidic נקצרים וcryo התקררו בתכשיר לשימוש באיסוף נתונים עקיפים וסופו של דבר לקביעת מבנה. Mesophase האירוח יכול להיות שלב מעוקב הצמיג ודביק או שלב הספוג יותר נוזלי 4. איך את צלחות כריכי הזכוכית נפתחות ואיך את הגבישים נקצרים מאוד תלוי בסוג mesophase. לכן חשוב לדעת איזו משני אחד לא עוסק בבעוד מועד. זהותו של שומני האירוח והמזרז בשימוש הן חשובה בהקשר זה, ואת המראה הפיזי של בולוס mesophase בגיבוש גם יכול לשמש כדי להבדיל ביניהם (איור 3). מסיק משני סוגי mesophase הומחש במאמר זה.

קציר גבישים קטנים מmesophase lipidic בצלחות זכוכית כריך הוא תהליך קפדני שדורש זמן, מיומנות, experience, סבלנות ויד יציבה. חשוב להניח בצד את הכמות מתאימה של זמן לקצירה ולהקים את המעבדה כך שכל האספקה ​​והציוד הם בהישג יד מראש. אדם שני, שיסייע בקצירה אינו הכרחי אך מומלץ. אותו האדם יכול לעזור באספקת לוחות מסומנים מראש לאדם עושה קצירה, כמו גם הצבת לולאות רכובות cryo מקוררים עם גבישים נקטפו לתוך דיסקוס האחסון. העוזר יכול גם לשחק תפקיד חשוב בתמיכה בתיעוד תצפיות על הגבישים בוצעו במהלך הקצירה שעשויה להוכיח מכריע במהלך איסוף נתוני עקיפה. בהעדרו של עוזר, מכשיר קול המופעל שמע הקלטה יכול לשמש יתרון לתיעוד.

בעקבות הפרוטוקול המתואר במאמר זה יעזור לי המציג והפעלה עם קצירת גביש. עם זאת, חשוב להבין, שהתהליך אינו פשוט וכי practice נחוץ לפני ההשקה לקצירת גבישי חלבון קרום יקרים ערך. לכן מומלץ שצלחות בדיקה עם גבישים של חלבונים שאינם יקרים במיוחד שהתנסו בראשון. זה יספק את החניך עם ניסיון רב ערך בחיתוך זכוכית, הסרת רסיסי זכוכית, מרים coverglass מרחבי mesophase, תוך שימוש בתכונת הקיטוב במיקרוסקופ כדי לראות גבישים ולעקוב אחריהם במהלך קציר, ולבסוף טיפול בסוגים השונים של mesophases וקציר מהם. המרקם של mesophase, ובהרחבה את הקלות שבה ניתן לקצור גבישים, משתנה עם זמן במהלך התגבשות. לכן חשוב לתרגל קצירה עם גבישים פחות יקרים אבל עם אלה שגדלו באותם תנאים כמו אלה יקרים יותר. זה אפשרי לגדל גבישים של Lysozyme וthaumatin ידי בטווה או שיטת שלב מעוקב lipidic 28 ואלה צריכים להיחשב כנעלי ספורט בדרך של צובר היכרות עם חומרים ואת השיטה. כדאי גם לשקול לעבוד עם mesophase חלבון החופשי ראשון ללמוד מהגחמות שלו.

הנהלים הפגינו כאן היו הכל נעשה ב20 נוח ° C או בסמוך לכך. זה אפשרי לגדל גבישים ידי בשיטה טווה בטמפרטורות נמוכות יותר. לפיכך, monoolein כשומני אירוח במדינת שלב metastable ניתן להשתמש ב 4 ° C 1,2,29,30. אלטרנטיבה היא להשתמש 7.9 MAG תוכנן באופן רציונלי להתגבשות טמפרטורה נמוכה 31. אנחנו עושים crysallogenesis טמפרטורה נמוכה באופן שגרתי עם מטרות חלבון קרום מסוימות. במקרה זה, גידול גביש והקציר נעשה בהליכה, ב4 ° C מקרר. עובד בתנאים כאלה, יש אתגרים משלו לא פחות מזה הוא הצורך בלבוש חם ונוח.

השלב הבא בתהליך הכולל של קביעת מבנה באמצעות crys macromoleculartallography הוא לאסוף נתונים עקיפים על גבישים נקטפו וSnap-התקרר כפי שמודגם במאמר זה. במבוגר טווה גבישים הם בדרך כלל קטנים. עם זאת, איסוף נתונים עקיפים שימושי היה אפשרי בגבישים בעלי ממד מקסימום של 20 מיקרומטר 9. לצורך כך, מייקרו קרן ה-X קרינת סינכרוטרון משמשת ונמצאת במוקד המאמר יופיטר נפרד בסדרת 32,33 זה.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ישנם רב שתרמו לעבודה זו ורובם מן הקרום המבני קפריי וקבוצת ביולוגיה פונקציונלית, שניהם חברים בעבר ובהווה. לכל, ובמיוחד לJingquan טאן וג'וזף ליונס, אנו מרחיבים את התודה וההערכה החמה שלנו. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מקרן המדע אירלנד (07/IN.1/B1836), המכונים הלאומיים לבריאות (GM75915, P50GM073210 וU54GM094599), ועלות FP7 ופעולות Curie מארי (CM0902 וPIEF-GA-2009 -235612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curved tweezers Sigma F4142 Tool
Disposable pipette tips Gilson Various Disposable
Foam dewar Spearlab FD-500 Tool
Glass and metal waste containers Daniels Healthcare DD479OL Tool
Harvesting loops MiTeGen Various Tool
Harvesting microscope Nikon SMZ1500 Tool
Lab notebook Various NA Tool
Magnetic push button sample loading wand Hampton Research/Molecular Dimensions HR4-729/MD7-411 Tool
Original Puck (for use with ALS-style robots only) Crystal Positioning Systems CP-111-035 Tool
Pipetting devices Gilson Various Tool
Precipitant solutions Various Various Reagent
Puck Bent Cryo-Tong Crystal Positioning Systems CP-111-030 Tool
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod Crystal Positioning Systems CP-111-029 Tool
Purified water Millipore Reagent
Safety goggles Various NA Tool
Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) Crystal Positioning Systems CP-111-015 Tool
Shipping dewar Taylor-wharton CX100 Tool
Tissues NA NA Disposable
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) Silverline Tools (Yeovil, UK) 633657 Tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
  2. Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes. Biochemistry. , Forthcoming (2012).
  3. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
  4. Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
  5. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
  6. Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  7. Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. Science. 330, 1091-1095 (2010).
  8. Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 485, 400-404 (2012).
  9. Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547-551 (2012).
  10. Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335, 851-855 (2012).
  11. Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist. Science. 322, 1211-1217 (2008).
  12. Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature. 482, 552-556 (2012).
  13. Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485, 321-326 (2012).
  14. Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469, 175-180 (2011).
  15. Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  16. Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science. 318, 1266-1273 (2007).
  17. Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex. Nature. 469, 236-240 (2011).
  18. Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature. 475, 65-70 (2011).
  19. Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature. 485, 395-399 (2012).
  20. Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  21. Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic. Nature. 485, 327-332 (2012).
  22. Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).
  23. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. , (2011).
  24. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
  25. Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).
  26. Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization. Structure. 16, 1003-1009 (2008).
  27. Cherezov, V. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron. 6, 587-597 (2009).
  28. Caffrey, M. A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).
  29. Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system. J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).
  30. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
  31. Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. Rational design of lipid for membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).
  32. Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. , e1712 (2010).
  33. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase. J. Vis. Exp. , e4000 (2012).
  34. Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase. Nature. 10, (2012).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 67 התגבשות צלחות זכוכית כריך GPCR קצירה, LCP mesophases lipidic קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן חלבון קרום
קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Boland, C., Aragao, D.,… More

Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (67), e4001, doi:10.3791/4001 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter