Summary
Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.
Abstract
Marcação retrógrada de neurónios é um método padrão 1,2 anatómica que também tem sido utilizado para carregar o cálcio e sensíveis à voltagem corantes em neurónios 3-6. Geralmente, os corantes são aplicados na forma de cristais sólidos ou por injecção sob pressão local usando pipetas de vidro. No entanto, isto pode resultar na diluição da intensidade de rotulagem de corante e reduzida, particularmente quando são necessárias várias horas para a difusão do corante. Aqui demonstramos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de corantes fluorescentes e de iões de sensível em neurónios utilizando uma pipeta de sucção de polietileno cheio com a solução de corante. Este método oferece uma maneira fiável para a manutenção de uma elevada concentração do corante em contacto com axónios em todo o procedimento de carga.
Protocol
Dextranos fluorescentes têm sido utilizados como ferramentas de anatómicos e para geração de imagens actividade neuronal 1-4. Campos et al, (2009) 4 publicou um protocolo para aplicação de íons e sensíveis à tensão corantes tratos axonais com um foco sobre a medula espinhal como um sistema modelo. Descrevemos aqui um procedimento mais detalhado para a aplicação de corante fluorescente e / ou iões de sensível para as raízes de corte ventral, raízes dorsais ou qualquer tracto neuronal da medula espinal para estudos in vitro optophysiological e morfológicas.
1. Tipo I e tipo II Pipetas
Comece puxando duas seções curtas de tubos de polietileno (PE90, Clay Marca Adams) sobre a chama de uma lamparina de álcool para produzir 7 pipetas com pontas afiladas. Uma pipeta (Tipo I) deve ser curto (3-7 mm) com uma pequena ponta que pode firmemente manter a raiz alvo ou do tracto (diâmetro externo: 0,2-0,4 mm, diâmetro interior: 0,1-0,3 mm). Em seguida, puxe uma pipeta segundo (Tipo-II) com um mais longo (8-12 cm) mais fino do eixo, e uma ponta muito fina (diâmetro externo: 0,2-0,3 mm, diâmetro interior: 0,1-0,2 mm), que pode ser inserido no Tipo I pipetar, tanto quanto sua ponta. A pipeta segundo diluente será usado para aspirar e introduzir fluido cerebrospinal artificial (aCSF) e solução de corante, respectivamente a partir da pipeta Tipo-I.
2. Posicionamento do Tipo-I Pipetar
Dissecar e isolar a medula espinhal 8,9 e colocá-lo em um banho, com superfused aCSF refrigerados (~ 16 ° C) durante todo o processo de carregamento. Coloque o Tipo-I pipetar em um porta-eletrodo (H1/12 porta eletrodo, Narishige) para que a sua abertura nas costas pode ser facilmente conectado a uma seringa (1ml U-100 seringa de insulina, Becton Dickinson ou equivalente) através de um tubo flexível (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B).
3. Aplicação Dye
- Usando a seringa, primeiro desenharaCSF para a pipeta de tipo-I (Fig.1b; 2A) seguido pelo trato axonal ou raiz para ser preenchido (Fig. 2B). A tubagem flexível deve então ser removido a partir da abertura para trás. A pipeta-Type II está ligado a outra seringa e inserido no Tipo I pipetar segurando o tracto axonal ou raiz. Usando a seringa ligado à pipeta de tipo II, aspirado aCSF de modo que o aCSF residual apenas cobre o tracto axonal (Figura 1C; 2C-D). Em seguida, retirar a pipeta de tipo II a partir da pipeta tipo-I. Monitorar o nível aCSF por alguns minutos para verificar uma boa vedação no trato axonal ou nervos (ver Seção 3 em Solução de problemas para "selo bom").
- Dissolve-se o corante em aCSF ou 0,2% de triton X-100 em água destilada duas vezes e retirá-la para a pipeta-Type II tendo em atenção a não incluir bolhas de ar. Inserir a pipeta de tipo-II contendo o corante para a pipeta de tipo-I e para dentro da solução aCSF residual (2E Fig.). Lentamente, liberteo corante no aCSF usando pressão positiva suave (Fig. 2F). Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar ou causar deslocamento do tecido-alvo a partir do interior da ponta. Retirar a pipeta do tipo II, após uma quantidade suficiente de corante foi liberado (3-5 uL de solução de corante).
4. Incubação
Incubar o tecido no escuro entre 6 a 20 horas, dependendo do tipo de experiência. Uma vez que o tempo suficiente tiver sido autorizado para o enchimento, suavemente afastar o eléctrodo a partir do tecido de deixar o tecido pronto para imagiologia ou histologia.
Solução de problemas
- Se o tecido alvo não entra facilmente para dentro da ponta da pipeta de tipo-I ou é solto, uma vez dentro, em seguida, o diâmetro da ponta é o tamanho errado. Se isto ocorrer, puxar e utilizar uma pipeta diferente.
- Antes de adicionar o corante para a aCSF na pipeta de tipo I, certificar-se que aCSF suficiente permanece de modo que ele pode ser alcançado com oTipo II-pipeta (Fig. 2D). Caso contrário, uma abertura de ar irá existir uma vez que o corante é adicionado. Se isso acontecer, não adicione o corante e retire o trato axonal da pipeta e depois desenhá-la de volta com aCSF suficiente para ser alcançado pela pipeta Tipo-II.
- Se o nível de aCSF nos aumentos de tipo-I de pipeta-se depois aspirado com a pipeta de tipo II, isto significa que o selo com o tecido não é boa. Utilizar um eléctrodo diferente, caso contrário, o corante será diluído durante o procedimento de etiquetagem.
- Se uma bolha de ar é introduzido na pipeta Tipo I durante a injecção do corante, escorrer para fora da bolha com o avanço do tipo II estreita ponta da pipeta para a bolha e suavemente a aplicação de uma pressão negativa fraca utilizando a seringa em anexo.
5. Os resultados representativos
Motoneurônios Para ilustrar uma aplicação do método, simultaneamente carregados, aferentes sensoriais espinhais e interneurônios com três DEXT diferenteran-conjugados corantes fluorescentes (Fig. 3A). Como ilustrado na fig. 3B, três classes de neurônios são rotulados; aferentes sensoriais (vermelho), interneurônios projetando no funículo ventral (verde) e motoneurônios (azul).
Figura 1. Esquemático, mostrando Pipetar tipo I e tipo II de montagem. (A) Um tipo I pipeta (luz azul) é colocado sobre um suporte de eléctrodo de modo que é volta de abertura pode ser facilmente ligado ao tubo de elastómero flexível (B) e em que uma pipeta de tipo-II pode ser inserido (C).
Figura 2. Esquemático, mostrando o processo de carregamento de motoneurônios com corantes fluorescentes. (A) Uma pipeta tipo I é colocado perto da raiz ventral para ser preenchido. (B) A sucção é aplicada à pipeta para desenhar aCSF para a pipeta seguido pela raiz. (C-D) Desligar a tubagem de elastómero flexível a partir do servidor de Tipo I pipeta e reduzir a quantidade de aCSF mediante a aplicação de sucção, para a pipeta-Type II. (E) Introduza a ponta da pipeta-Type II contendo o corante dissolvido na aCSF restante na pipeta de tipo-I. (EF) Lentamente encher a pipeta tipo I com o corante e depois remover a pipeta-Type II.
Figura 3. A aplicação do procedimento de enchimento para o cabo de rato isolado da coluna vertebral. (A) esquemático, mostrando a três Tipo I pipetas usadas para encher diferentes classes neuronais na medula espinal. Motoneurônios (azul; Cascade azul dextrano) e sacrais aferentes sensoriais (cor vermelha;-Texas Red dextran) foram backfilled através das raízes ventral e dorsal, respectivamente. Fluoresceína dextrano foi usado para carregar interneurônios espinhais (verde) cujos axônios ascender através do funículo ventral (VF). 1 mg de cada corante dextrano (MW 10.000; Molecular Probes)foi dissolvido em 6 de água destilada uL contendo 0,2% de Triton X-100 (B). Imagem confocal de uma secção do cordão sacral da medula espinal de um em que os neurónios foram retro-rotulado como descrito em A. Note que os aferentes sensoriais rotulados são principalmente ipsilateral com um projecções poucos contralateral. Os motoneurónios rotulados são ipsilateral à raiz ventral cheia ao passo que os interneurónios rotulados são contralateral ao lado do preenchimento (ponta de seta). Barra de calibração 200 um.
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Discussion
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Acknowledgments
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