Summary
Vi beskriver en enkel och billig teknik för att införa höga koncentrationen av fluorescerande och kalcium-känsligt färgämnen till neuroner eller någon neuronala tract användning av en pipett polyeten sugning.
Abstract
Retrograd märkning av neuroner är en vanlig metod anatomisk 1,2 som också har använts för att lasta kalcium och spänningskänsliga färgämnen till neuroner 3-6. I allmänhet är de färgämnen som används fasta kristaller eller genom lokal injektion tryck med användning av glaspipetter. Emellertid kan detta resultera i utspädning av färgämnet och reducerad märkning intensitet, särskilt när flera timmar krävs för att färgdiffusion. Här visar vi en enkel och billig teknik för att införa fluorescerande och jon-känsliga färgämnen till neuroner som använder en pipett polyeten sugning fylld med färglösningen. Denna metod erbjuder ett pålitligt sätt för att upprätthålla en hög koncentration av färgämnet är i kontakt med axoner hela laddningsproceduren.
Protocol
Fluorescerande dextraner har använts som anatomiska verktyg och för avbildning nervaktivitet 1-4. Fields et al, (2009) 4 publicerade ett protokoll för tillämpning av jon-och spänningskänsliga färgämnen för att axonala trakter med fokus på ryggmärgen som modellsystem. Här beskriver vi ett mer detaljerat förfarande för tillämpning av fluorescerande och / eller jon-känslig färg på de skurna ventrala rötterna, bröst rötter eller någon neuronala område av ryggmärgen för in-vitro optophysiological och morfologiska studier.
1. Typ-I-och Typ-II-pipetter
Börja med att dra två korta sektioner av polyetenslang (PE90, Clay Adams märke) över lågan av en alkohol lampa 7 för att producera pipetter med avsmalnande spetsar. En pipett (typ-I) bör vara kort (3-7 mm) med en liten spets som tätt kan hålla målet roten eller tarmkanalen (Yttre Diameter: 0,2-0,4 mm, innerdiameter: 0,1-0,3 mm). Dra sedan en andra pipett (typ-II) med en längre (8-12 cm) tunnare, skaft och en mycket fin spets (ytterdiameter: 0,2-0,3 mm; innerdiameter: 0,1-0,2 mm) som kan sättas in i typ I-pipettera så långt som dess spets. Den andra tunnare pipett används för att aspirera och införa artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) och färgämne-lösning respektive från typ I-pipett.
2. Positionering av Typ-I Pipettera
Dissekera och isolera ryggmärgen 8,9 och placera den i ett bad, superfuseras med kyld aCSF (~ 16 ° C) under hela laddningen. Placera Typ-I pipettera på en elektrodhållare (H1/12 elektrodhållare, Narishige) så att dess bakre öppning lätt kan anslutas till en spruta (1 ml U-100 insulinspruta, Becton Dickenson eller liknande) via en böjlig slang (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002; 10 cm) (Figur 1A-B).
3. Färgämne Tillämpning
- Med hjälp av sprutan först ritaaCSF i typ-I-pipett (Fig.1B; 2A) följt av axonal tarmkanalen eller rot som skall fyllas (fig. 2B). Den flexibla slangen måste sedan avlägsnas från den bakre öppningen. Typ-II-pipett är fäst till en annan spruta och sattes in i typ I-pipettera hålla axonal tarmkanalen eller rot. Använd sprutan fäst vid typ II pipett aspirera aCSF så att den kvarvarande aCSF precis täcker axonal tarmkanalen (Fig.1C, 2C-D). Sedan återkalla typ-II pipett ur typ I pipett. Övervaka aCSF nivån för några minuter för att kontrollera en god tätning på axonal tarmkanalen eller nerver (se avsnitt 3 i Felsökning för "god tätning").
- Lös färgen i aCSF eller 0,2% Triton X-100 i dubbel destillerat vatten och dra in den typ-II-pipett när uppmärksamma att inte inkludera luftbubblor. Sätt i typ-II-pipett innehållande färgämnet in i typ I-pipett och in i kvarvarande aCSF lösning (fig. 2E). Långsamt frisättafärgämnet in i aCSF med användning av varsam positivt tryck (fig. 2F). Var noga med att inte införa några luftbubblor eller orsaka förskjutning av målvävnaden inifrån spetsen. Återkalla typ-II pipett efter tillräcklig mängd färgämne har släppts (3-5 pl färgämne lösning).
4. Inkubation
Inkubera vävnaden i mörker mellan 6 till 20 timmar beroende på typen av experiment. När tillräckligt med tid har tillåtits för att fylla genom att försiktigt dra bort elektroden från vävnaden lämnar vävnaden redo för avbildning eller histologi.
Felsökning
- Om målvävnaden inte kommer in lätt in i spetsen av Typ-I-pipett eller är lös gång inuti, så spetsdiameter är fel storlek. Om detta inträffar, dra och använda en annan pipett.
- Innan du lägger färgen till aCSF i typ-I pipett, se till att tillräckligt mycket aCSF är så att den kan nås medTyp-II-pipettspets (fig. 2D). I annat fall kommer en luftspalt föreligger när färgämnet tillsätts. Om detta händer, inte lägga färgen och ta bort axonal tarmkanalen från pipetten och sedan dra den tillbaka med tillräcklig aCSF ska nås genom typ-II pipett.
- Om aCSF nivå i typ-I-pipett ökar efter det sögs med Typ-II-pipett, betyder det att tätningen med vävnaden är inte bra. Använda en annan elektrod, i annat fall färgämne kommer att spädas under märkningsförfarandet.
- Om en luftbubbla förs in i typ I pipett medan du injicerar färgämnet, rinna ut bubblan genom att föra typ-II-pipettspets nära bubblan och försiktigt applicera en svagt negativt tryck med hjälp av bifogade sprutan.
5. Representativa resultat
För att åskådliggöra en tillämpning av metoden vi samtidigt belastade motoneuroner, sensoriska afferenter och spinala interneuron med tre olika DEXTdrev-konjugerade fluorescerande färgämnen (Fig. 3A). Såsom illustreras i FIG. 3B, tre klasser av neuron är märkta, sensoriska afferenter (röd), interneuronen skjuter in i ventrala funikulus (grön) och motoneuroner (blå).
Figur 1. Schema som visar Pipettera typ I och typ-II-anordningen. (A) En Typ-I-pipett (ljusblå) placeras på en elektrodhållare, så att den är tillbaka öppning lätt kan anslutas till den böjliga elastomeren slangen (B) och in i vilken en typ-II-pipett kan införas (C).
Figur 2. Schema som visar lastning av processen motoneuroner med fluorescerande färgämnen. (A) En typ-I pipett är placerad nära den ventrala roten som skall fyllas. (B) Ett sug anbringas på pipetten för att dra aCSF i pipetten följt av roten. (C-D) Koppla bort flexibla elastomersektionen röret från bakänden av Typ-I-pipett och minska mängden av aCSF genom att applicera sug på typ-II-pipett. (E) Sätt spetsen på typ-II pipett innehåller det upplösta färgämnet i de återstående aCSF i typ I pipett. (EF) sakta fylla typ-I pipett med färg och ta sedan bort typ-II pipett.
Figur 3. Applicering av fyllningsproceduren till den isolerade mus ryggmärg. (A) Schematisk visar tre Typ-I-pipetter användes för att fylla olika neuronala klasser i ryggmärgen. Motoneuroner (blå, Cascade Blue dextran) och sakrala sensoriska afferenter (röda, Texas-Red dextran) har återfyllas genom ventrala och dorsala rötter, respektive. Fluorescein dextran användes för att ladda spinala interneuron (grön) vars axoner stiger genom ventrala funikulus (VF). 1 mg av varje dextran färgämne (10.000 MW, Molecular Probes)löstes i 6 | il destillerat vatten innehållande 0,2% Triton X-100 (B). Konfokala bild av en sektion från sakrala ur ett ryggmärgen där nervceller var tillbaka-märkt enligt A. Observera att de märkta sensoriska afferenter är främst ipsilaterala med några kontralaterala prognoser. De märkta motoneuroner är ipsilateralt till den fyllda ventrala roten medan de märkta intemeuroner är kontralateralt till den sida av fyllningen (pilhuvud). Kalibrering bar 200 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
