Summary
Ce protocole décrit la stimulation des fibroblastes cultivés avec de faible intensité ultrasons pulsés, qui entraîne la formation d'adhésion focale et Rac1 activation en imitant l'engagement du récepteur transmembranaire matrice, le syndécane-4. Cette approche permet d'étudier une technique clinique réussie au niveau cellulaire, offrant ainsi des possibilités de raffinement de la thérapie.
Abstract
Dans les organismes multicellulaires, le comportement des cellules est dictée par des interactions avec la matrice extracellulaire. Conséquences de la matrice de l'engagement du large de la réglementation de la migration et la prolifération cellulaire, la sécrétion d'une différenciation et même. Les signaux sous-tendant chacun de ces processus complexes proviennent des interactions moléculaires de la matrice extracellulaire des récepteurs sur la surface de la cellule. Les intégrines sont des récepteurs prototypes et de fournir un lien mécanique entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette, ainsi que de lancer certaines de les cascades de signalisation dépendantes de l'adhérence. Cependant, il est de plus en plus évident que d'autres récepteurs transmembranaires fonctionner en parallèle avec les intégrines de réglementer tant l'intégrine elle-même et des signaux en aval. Le plus élégant de ces exemples est le protéoglycane transmembranaire, le syndécane-4, qui coopère avec α β 1-5 au cours de l'intégrine adhérence à la fibronectine. Dans les modèles in vivo demonstrmangé l'importance de syndécan-4 de signalisation, comme syndécane-4-souris déficientes en protéine présentent un retard de guérison due à la migration des fibroblastes 1,2 inefficace. En animaux de type sauvage, la migration des fibroblastes vers une plaie est déclenchée par l'apparition de la fibronectine que les fuites de capillaires endommagés et est déposé par les macrophages dans le tissu lésé. Par conséquent, il ya un grand intérêt à découvrir des stratégies qui améliorent la fibronectine-dépendantes de signalisation et pourrait accélérer le processus de réparation.
Les composants de l'intégrine-médiées et syndécane-4-médiée de fibronectine-dépendantes de signalisation peuvent être séparés par des cellules de stimulation avec des fragments de fibronectine recombinant. Bien que l'engagement de l'intégrine est essentielle pour l'adhésion cellulaire, la fibronectine certains signaux dépendants sont réglementés par le syndécane-4. Syndecan-4 active le signal de Rac1 propulsion 3, provoque une redistribution des intégrines 1, déclencheurs de recrutement de molécules du cytosquelette, tels que la vinculine, à focaleadhérences 4, et induit de ce fait 3 la migration directionnelle. Nous avons examiné des stratégies alternatives pour l'activation de ces signaux et a constaté que de faible intensité ultrasons pulsés (LIPUS) peuvent mimer les effets de syndécane-4 l'engagement 5. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle 30 mW / cm 2, 1,5 échographie MHz, pulsé à 1 kHz (Fig. 1) peut être appliquée à des fibroblastes en culture (Fig. 2) pour induire l'activation de Rac1 et la formation d'adhésion focale. La stimulation ultrasons est appliquée pour une durée maximale de 20 minutes, comme cette combinaison de paramètres a été jugée la plus efficace pour l'accélération de la réparation d'une fracture clinique 6. La méthode utilise des fragments de fibronectine recombinantes à s'engager α 5 β 1-intégrine, sans engagement de syndécane-4, et requiert l'inhibition de la synthèse protéique par la cycloheximide à bloquer le dépôt de matrice supplémentaire par les fibroblastes., L'effet positif oéchographie f sur les mécanismes de réparation est bien documenté 7,8, et par la compréhension de l'effet moléculaire de l'échographie dans la culture que nous devrions être en mesure d'affiner la technique thérapeutique pour améliorer les résultats cliniques.
Protocol
1. Surfaces de revêtement avec un ligand Matrice
- L'échographie sera appliquée à des cellules dans 3,5 cm de puits, soit que des plats individuels ou en tant que plaque à 6 puits. Pour les dosages biochimiques, manteau ligand directement sur le plastique. Pour immunofluorescence, le verre ébullition Lamelles trois fois dans de l'eau MilliQ et le lieu 4 lamelles dans le fond de chaque puits.
- Les surfaces vitrées doivent être transformés en dérivés pour assurer revêtement ligand efficace. Dissoudre sulfo-m-maléimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester dans du PBS à 1 mM. Ajouter 2 ml à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
- Laver les surfaces dérivés 3 fois avec du PBS.
- Manteau soit verre ou en plastique non traité dérivé avec un ligand d'intégrine. Appliquer 2 ml de 10 ug / ml intégrine ligand9, dissous dans du PBS contenant du Ca 2 + et Mg 2 + dans chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C.
- Préparer monoparticulate BSA par chauffage BSA 1%, dissous dans du PBS, à 85 ° C pendant 13 minutes. Permettrepour refroidir, puis passer à travers un filtre de 0,45 um.
- Laver ligand surfaces revêtues de 3 fois avec du PBS et le bloc avec le BSA monoparticulate pendant 30 minutes.
2. Préparation des cellules
- Pour contrôler l'environnement matriciel tout au long de l'expérience, la synthèse des protéines doit être bloquée par addition de 25 pg / ml de cycloheximide à 80% des fibroblastes confluentes pendant 2 heures.
- Rincer cycloheximide cellules traitées avec du PBS et se détacher de la fiole de culture en utilisant 0,5 mg / ml de trypsine / EDTA.
- Cellules individuelles de récolte par centrifugation à 500 xg pendant 5 minutes.
- Resuspendre les cellules dans DMEM/25 HEPES, 25 pg / ml de cycloheximide.
- Compter densité de cellules de la suspension en utilisant un hémocytomètre et diluer à 105 ml-1.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 20 minutes pour récupérer l'intégrine surface.
- Rincer les ligand-couché, BSA-bloqués puits 3 fois avec du PBS.
- Graine 2 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits.
- Allow cellules de se propager pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Stimulation ultrasons
- Réchauffez le tableau émetteur d'ultrasons et de gel de couplage à 37 ° C.
- Appliquer une goutte taille d'un pois de gel de couplage à chaque émetteur.
- Tester ce que chaque émetteur est fonctionnel en utilisant un détecteur à diode ultrasons indicateur.
- Placez les puits sur le réseau d'émetteurs. Retourne un tableau à 37 ° C, température de 5% de CO 2 et laisser s'équilibrer pendant 10 minutes.
- Allumez le signal ultrasonore.
- Le signal ultrasonore se désactive après 20 minutes, imitant le régime thérapeutique. Si les temps de stimulation plus courts sont nécessaires, les plaques doivent être supprimés du tableau à l'endroit approprié en temps des points. Dans tous les cas utiliser des plaques non stimulées comme contrôle négatif.
4. Analyse Focal Adhesion par immunofluorescence
- Pour une analyse de la formation d'adhésion focale, appliquer le signal ultrasonore de 20 minuteset puis permettre aux structures de développer pendant 40 minutes supplémentaires par le maintien des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Aspirer des médias et réparer les cellules en appliquant 2 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS. Incuber pendant 14 minutes à température ambiante.
- Aspirer le paraformaldéhyde et rincer trois fois avec du PBS, l'application de la PBS doucement vers le bas le bord du puits pour éviter la production de forces de cisaillement.
- Transférer chaque lamelle de 3,5 cm des puits dans une plaque à 24 puits pour immunofluorescence ultérieure.
- Étancher paraformaldéhyde résiduelle par application de 0,5 ml à 0,1 M de glycine dans du PBS à chacun des 24 puits. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
- Aspirer la glycine et rincer trois fois avec du PBS.
- Perméabiliser les cellules par application de 0,5 ml à 0,5% de Triton X-100 (p / v) dans du PBS. Incuber pendant 4 minutes à température ambiante.
- Aspirer Triton X-100 et rincer trois fois avec du PBS.
- Bloquer par application de 0,5 ml 3% (p / v) de BSA dans du PBS. Incuber une nuit à 4 & dpar exemple; C.
- Colorer vinculine contenant adhésion focale avec hVIN-1 anticorps dilué 1:400 dans le bloc de BSA. Incuber pendant une heure à température ambiante.
- Rincer trois fois avec du PBS.
- Appliquer fluorophore (DyLight 488) conjugué anticorps secondaire (dilué 1:200) et l'actine tache avec TRITC-conjugué phalloïdine (dilué 1:200) dans le bloc de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
- Rincer trois fois avec du PBS, et une fois avec de l'eau.
- Monter sur une lame de verre dans une position inversée à l'aide Prolongez milieu de montage d'or.
5. Quantification de Rac1 Activation par pull-down test
- Pour l'analyse de Rac1 activation, appliquez le signal ultrasonore de 20 minutes pour les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. Lors de l'évaluation des temps de réponse de plus de 20 minutes, appliquer le signal à ultrasons pour 20 minutes et maintenir les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pour le temps restant pour permettre à la réponse à se développer.
- Aspirer les médias et le lieu ainsis sur la glace. Rincer les puits avec 2 ml de PBS froid et d'aspiration. Assurez-vous tout résidu PBS est éliminé en laissant les puits inclinés pendant 1 minute puis par aspiration approfondie.
- Lyse des cellules sur la glace avec 35 ul de tampon de lyse (10% de glycérol, 20 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, désoxycholate de sodium 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inhibiteur de la protéase complète) par puits. Dans cet exemple, 6 puits sont utilisés par point de temps pour générer ul 210 du lysat cellulaire. Puits plus ou moins peut être utilisé mais le volume total de lysat devraient totaliser ~ 200 pi.
- Gratter les cellules à fond avec grattoir à cellules pour assurer la lyse cellulaire complète et laisser les puits incliné pendant 1 minute pour permettre lysat à la piscine.
- Transfert à un lysat glacée de 1,5 ml microtube (mise en commun de lysats régime de traitement même) et de spin au 21000 × g pendant 2 minutes à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire de débris.
- Transfert 180 ul de lysat pour glacée de 1,5 ml microtubes contenant 130 ul de tampon de lyse et 25 pi PAK-glutathione billes d'agarose 10. Gardez en restant lysat brut à -20 ° C pour la séparation de gel ultérieur.
- Capturez Rac1 actif sur les billes d'agarose PAK-glutathion par la rotation des tubes pendant 40 minutes à 4 ° C.
- Récolte d'agarose cordon conjugue par centrifugation à 2000 xg pendant 1 minute à 4 ° C.
- Lavage bourrelet conjugués trois fois avec un tampon de lyse 500 pi, la récolte des perles par centrifugation à 2000 x g et rejeter le surnageant, après chaque lavage. Retirez soigneusement le tampon de lyse restante de lavage avec une pipette 200 pi.
- Éluer chaque échantillon en ajoutant 35 pi de tampon de chargement SDS-PAGE et incuber à 85 ° C sur un bloc de chauffage sous agitation pendant 5 minutes. Retirer billes par centrifugation à 21000 xg pendant 1 minute.
- Résoudre éluat talon par SDS-PAGE, transfert à la nitrocellulose et de la sonde pour Rac1.
6. Les résultats représentatifs
Dans ce protocole, nous décrivons l'induction de la vinculine-tacheed adhésions focales et Rac1 activité par l'échographie. Pour l'expérience d'adhésion focale, la position de référence est que les fibroblastes, réparties sur un ligand de α 5 β 1-intégrine ne forment pas vinculine contenant adhérences (fig. 3A) à moins qu'une seconde récepteur de fibronectine, syndécane-4, est engagé par addition d' ligand soluble (Fig. 3B) 3,4. Toutefois, la stimulation avec des ultrasons induit la formation d'adhésion focale dans la même mesure que l'engagement de syndécane-4 (Fig. 3C), indiquant que la stimulation par ultrasons peut se substituer à certains composants de la voie de signalisation dépendante de la fibronectine 5. Le principal obstacle à ce protocole est d'éliminer la formation d'adhésion focale, en l'absence de stimulant. L'inhibition incomplète de la synthèse protéique par la cycloheximide permettra dépôt de matrice qui est suffisant pour les cellules à l'auto-stimulation. Le surpeuplement des cellules peut aussi conduire à de bas niveau d'adhésion focale formation et une mauvaise réponse à l'échographie que la diaphonie entre la cellule-cellule et cellule-matrice contacts va compliquer une expérience qui est conçu pour isoler un seul stimulus. En tant que développement de l'analyse de base, nous montrons la même expérience, répétée avec des fibroblastes dépourvus de syndécane-4 (Fig. 4). Ces fibroblastes continuent de répondre aux ultrasons (figure 4C), mais ne parviennent pas à répondre à syndécane-4 ligand (Fig. 4B). L'expérience à l'aide SDC4 - / - fibroblastes montre que les ultrasons peuvent en effet contourner la nécessité pour les récepteurs de fibronectine certains, et illustre comment le protocole simple peut être mis au point pour obtenir des informations supplémentaires sur la voie de signalisation.
Pour l'expérience biochimique, nous démontrons que les ultrasons peuvent induire l'activation de Rac1, en utilisant un dosage déroulant qui est une adaptation de la méthode décrite par Del Pozo et al. 10. La précipitation des actifs Rac1 0, 10, 30 et 60 minutes après iniciation de la stimulation par ultrasons révèle que les pics d'activité à Rac1 10-30 minutes, avant de revenir à la ligne de base (Fig. 5). Buvard lysats pour vinculine assure un chargement équivalent temps entre les points. Le résultat ressemble à l'activation de Rac1 par l'engagement de syndécane-4 3, mais est légèrement plus longue que l'activation par la fibronectine. Par conséquent 8-10 répétitions sont généralement nécessaires pour obtenir des données significatives. L'activation de Rac1 est responsable de l'engagement des cellules à la formation d'adhésion focale, et naissantes adhésions focales commencent à se former à 10-30 minutes, coïncidant avec Rac1 activation. Une fois lancé, ces adhérences qui continuent à mûrir dans les plaques d'adhérence grandes figures 3 et 4.
Figure 1. La forme d'onde ultrasonore. Ultrasons comprend une intermittente 1,5 MHz signal de qu'en raison de faible amplitude (30 mW / cm <sup> 2, la moyenne spatiale, temporelle moyenne) n'a pas d'effet de chauffage.
Figure 2. Représentation schématique du flux de travail pour la préparation et la stimulation des cellules avec des ultrasons.
Figure 3. Induction échographie de la formation d'adhésion focale dans les fibroblastes. Fibroblastes sont réparties sur le fragment d'intégrine de liaison de la fibronectine (A) avant la stimulation par le fragment syndécane-4-liaison de la fibronectine (B) ou d'ultrasons (C). Après 60 minutes de stimulation, les cellules ont été fixées, colorées pour vinculine et de l'actine, et imagées par épifluorescence. Bar = 10 um.
Figure 4. Induction échographie de la formation d'adhésion focale dans les fibroblastes dépourvus de syndécane-4.
Figure 5. L'activation de Rac1 par ultrasons. Les cellules ont été stimulées pendant quelques minutes de 0, 10, 30 et 60 avec 6 puits utilisés par point dans le temps. Le montant de GTP-Rac1 présents dans les échantillons à partir d'un Rac1 déroulant bien sûr le temps de dosage a été visualisée par incubation avec des anticorps anti-Rac1 anticorps sur un western blot (image du haut). La quantification de l'intensité de la bande (moyenne de 8-10 répétitions) révèle une augmentation de Rac1ctivité résultant de signal ultrasonore à 10 et 30 minutes, avant de revenir aux niveaux de référence à 60 minutes (graphique). Les barres d'erreur représentent sem
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle un traitement qui est normalement appliqué à des patients humains peut être utilisé dans la cellule à base d'expériences. Le but ultime est de comprendre le mécanisme moléculaire d'action des ultrasons afin que la thérapie peut être affinée. Dans ce protocole, nous utilisons fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comme un système cellulaire modèle, mais l'échographie a été également été trouvé pour être efficace dans des fibroblastes primaires de prépuce humain 5, les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoblastes et les chondrocytes 6. Nous utilisons Rac1 activation comme un test biochimique par exemple, mais la méthode pourrait être utilisée aussi pour tester la réglementation de la phosphorylation de protéines ou la formation de complexes protéiques par immunoprécipitation. Pour l'exemple par immunofluorescence, nous démontrons une échographie effet sur la formation d'adhésion focale, mais la redistribution de toute molécule pourrait être examinée. Par exemple, on peut tester le recrutement de facteurs cytosoliques à la membrane plasmique, colocalisation de proteins dans des vésicules de trafic ou d'examiner l'effet des ultrasons sur l'organisation du fuseau mitotique. Jusqu'à présent, nous avons limité nous de tester la fibronectine voies dépendantes, par l'effet des ultrasons sur les cellules de collagène, ou en présence de facteurs de croissance pourrait être testé afin de dresser un tableau de la façon dont l'échographie affecte le comportement des cellules dans un environnement complexe que plus ressemble à une situation in vivo. Un plus grand défi consistera à tester l'effet des ultrasons à l'aide imagerie time-lapse, où la présence de l'émetteur qui bloque le chemin de lumière et les vibrations des ultrasons supplémentaires présents obstacles techniques. Cependant, le fait que l'application thérapeutique nécessite seulement 20 minutes de stimulation par jour suggère que l'analyse du comportement des cellules après une salve de stimulation pourrait bien être productif.
Disclosures
Andrew Harrison est un employé de Smith & Nephew UK Limited.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust 088419 subvention pour MDB et le parrainage par Smith & Nephew UK Ltd
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
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