Summary
Den intraluminal midten cerebral okklusjon modell i mus er her presentert. Omfanget av cerebral infarkt er evaluert av en nevrologisk score og Cresyl fiolett flekker, en alternativ flekker til TTC, som tilbyr den store fordelen til å teste i parallelle mange interessegrupper markører.
Abstract
Hjerneslag er den tredje årsak til dødelighet og den ledende årsak til uførhet i verden. Iskemiske hjerneslag står for ca 80% av alle slag. Imidlertid er trombolytisk vevsplasminogenaktivator (tPA) den eneste behandling av akutt hjerneinfarkt som eksisterer. Dette førte forskerne å utvikle flere hjerneinfarkt modeller i en rekke arter. To hovedtyper av gnagere modeller har blitt utviklet: modeller av global cerebral iskemi eller fokale cerebral iskemi. Å etterligne iskemisk slag hos pasienter, i hvorav ca 80% trombotiske eller embolisk hjerneslag inntreffer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA), den intraluminal midten cerebral arterie okklusjon (MCAO) modellen er ganske relevant for hjerneslag studier. Denne modellen ble først utviklet i rotter ved Koizumi et al. I 1986 1. På grunn av den enkle genetiske manipulasjon i mus, har disse modeller også blitt utviklet i denne arten 2-3.
innhold "> Heri presenterer vi transient MCA okklusjon prosedyren i C57/Bl6 mus. Tidligere studier har rapportert at fysiske egenskaper sperreinnretningen som spissen diameter, lengde, form og fleksibilitet er kritisk for reproduserbarheten av infarktvolum 4. Heri, har en kommersiell silisium belagt monofilamenter (Doccol Corporation) blitt brukt. En annen stor fordel er at dette monofilament reduserer risikoen for å indusere subaraknoidal blødninger. Bruke Zeiss stereo-mikroskop STEMI 2000 ble silisium belagt monofilament innført i den interne carotisar (ICA) via et snitt i den eksterne karotidarterie (ECA) inntil monofilamentet occludes basen av MCA. Blodstrøm ble gjenopprettet en time senere ved fjernelse av monofilamentet å etterligne restaurering av blodstrøm etter lysis av en tromboembolisk blodpropp i mennesker. Omfanget av cerebral infarkt kan evalueres først med en neurologisk score og ved måling av den infarktvolum.Iskemiske mus ble dermed analysert for nevrologisk score på ulike post-reperfusjon ganger. Å vurdere infarktvolum, farging med 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) ble vanligvis utført. Heri, brukte vi Cresyl fiolett farging siden det gir mulighet til å teste mange kritiske markører ved immunhistokjemi. I denne videoen, rapporterer vi MCAO prosedyre, nevrologiske score og evaluering av infarktvolum ved Cresyl fiolett farging.Protocol
Forbigående Middle Cerebral arterieokklusjon (MCAO)
1. Kirurgi Prosedyre (Figur 1)
Forbigående midtre cerebralarterie okklusjon (tMCAO) utføres på 2 - til 3-måneder gamle hann C57BL / 6 mus (22-28g). Denne protokollen ble godkjent av IRCM bioetikkomité dyr omsorg. Kirurgiske verktøy ble sterilisert ved autoklavering (121 ° C ved 15 psi i 60 min). Mellom hvert dyr, ble de sterilisert bruke varmt limstrengen sterilisatoren (15 sek). Kirurgi bord og annet utstyr er sanitized med 70% etanol.
To timer før kirurgi, ble mus analgesized med buprenorfin (0,03 mg / kg bwip).
Figur 1A.
- Dypt anaesthetize mus med isofluran 5% og deretter opprettholde anestesi ved 2,5% isofluran. Kroppstemperatur av musene opprettholdes konstant under operasjonen med en varmepute.
- Desinfiser pels og skin med 70% etanol eller Betadine. Siden barbering produserer hår fragment utgivelsen, microabrasions og betennelse som kan påvirke slag patofysiologien, har vi ikke barbere musa pels.
- Gjør en midtlinjen hals snitt og dra forsiktig fra hverandre de myke vev.
- Under en stereo mikroskop (STEMI 2000, Zeiss), er en stump disseksjon utført for å avdekke luftrøret og trekke musklene for å finne carotisar.
- Venstre bekken carotisar (CCA) er nøye dissekert fra omkringliggende vev og CCA er midlertidig blokkeres av en midlertidig sutur (1) med 5-0 silke sutur skåret i 20 mm segmenter. Stor forsiktighet bør utvises for ikke å skade vagal nerve.
- Separer bifurkasjon av venstre interne felles carotisar (ICA) og ekstern felles carotisar (ECA). En permanent sutur (2) plasseres rundt ECA, så distalt som mulig, og en annen midlertidig sutur litt stramt (3) er plassert på ECA distalt forbifurkasjon.
- Klipp venstre ICA (4) ved hjelp av en omvendt-action pinsett for å unngå blødning. Stor forsiktighet bør utvises for ikke å skade vagal nerve.
- Klipp et lite hull i ECA (5) mellom faste (2) og midlertidig (3) suturer.
Figur 1b.
- Innføre en 12 mm lang 6-0 silisium-belagt (ca. 9-10mm er belagt silisium) monofilament sutur (Doccol Corporation) i ECA (6), helt kuttet ECA distalt for permanente sutur og invertere avstengertapp inn ICA . Sutur er tett knyttet rundt monofilament for å hindre blødning og omvendt-action pinsett er fjernet.
- Sperreinnretningen er innført for å occlude opprinnelsen til MCA i sirkelen av Willis. Stoppe sin innsetting rundt 9-10 mm utenfor bifurcation av ECA og CCA. Sperreinnretningen er blokkert og kan ikke flytte lenger. Forsiktighet må utvises for ikke å trenge gjennom pterygopalatine arterien. Sutur (3) på ECA er TIGhtly knyttet til fikse monofilament i posisjon.
- Lukk huden med en autoclip såret lukkesystem.
- Injiser 1 ml saltvannsoppløsning subkutant og plassere mus under en infrarød varmelampe under hele etter okklusjon periode (60 min).
2. Restaurering av midtre cerebralarterie Blood Flow
Før reanesthesia kan neuroscore kontrolleres for å vurdere effekten av kirurgi.
- Anesthetize musene som tidligere beskrevet og fjern autoclips.
- Litt åpne sutur (3) på ECA å tillate monofilament tilbaketrekning og blod reperfusjon.
- Permanent feste den midlertidige sutur på ECA å forhindre blodtap. Den monofilament holdes for gjenbruk.
- Fjern den midlertidige sutur (1) på CCA å gi blod resirkulering.
- Lukke såret. Musene bør få en annen 1 ml saltvannsoppløsning subkutant.
- Plasser musene under infrarød oppvarming lampe i 1 time. Etter å ha sjekket at dyret gjenvinner mobilitet, er musen tilbake til buret sitt og venstre under varmeputen og håndklær for 72 timer. Merk at bare halvparten av buret er plassert på varmeputen å tillate mus å velge deres miljø. Fordi postoperative vekttap er generelt observert, er most mat plassert i en petriskål å oppmuntre spise.
Tolv timer etter kirurgi, mottok musene en annen dose av buprenorfin (0,03 mg / kg bwip).
3. Humbug Drift
For sham operasjoner alle prosedyrer er identiske bortsett fra at sperreinnretningen ikke er satt inn.
4. Neuroscore
Nevrologiske underskudd tillate evaluering av suksessen tMCAO like etter reperfusjon og senere estimering av graden av alvorlighetsgraden av skaden. Nevrologiske underskudd scoret som tidligere beskrevet 5 </ Sup> og utført ved 1, 24, 48 og 72 timer etter reperfusjon. En utvidet seks punkts skala brukes:
- 0: normal.
- 1: mild sirkle atferd med eller uten inkonsekvent rotasjon når plukket opp av halen, <50% forsøk på å roterer motsatt side.
- 2: mild konsekvent sirkle,> 50% forsøk på å roterer motsatt side.
- 3: konsekvent sterk og umiddelbar sirkle, holder musen en rotasjon posisjon for mer enn 1-2 sek, med snuten nesten nådde halen.
- 4: alvorlig rotasjon framdrift i barreling, tap av walking eller refleks.
- 5: komatøs eller døende.
5. Cresyl Violet Farging (figur 2)
Etter PBS-løsning perfusjon er hjerner raskt frosset i isopentan og lagret ved -80 °C. Muse hjerner kan også perfused med 4% paraformaldehyd (PFA) avhengig planlagte immunhistokjemi studiene. Kryostaten-kutt av koronale hjernen seksjoner (17 mikrometer) er utført. Én del av hver 30 samles på samme lysbilde å ha en representant cerebral skade. For volum kvantifisering er to lysbilder farget av Cresyl fiolett flekker og et bilde analysesystem (Scion Corporation, Frederick, MD) ble brukt til å evaluere lesjon. Skaden volum ble beregnet i vilkårlige enheter (piksler), og uttrykt som en prosentandel av den kontralaterale ikke-lesioned område for hver enkelt del. Andre lysbilder holdes ved -80 ° C i immunhistokjemi studier. Alternativt kan PFA-fast hjernen kuttes på 30-50 mikrometer ved hjelp vibratome og infarktvolum målt som anbefales av Han et al. (2009) 6.
Discussion
Ulike takts modellene er utviklet for å etterligne hjerneslag konsekvenser hos pasienter. Valget av den firetaktsmotor avhenger biologiske spørsmålet. Den intraluminal MCAO modellen etterligner en av de mest vanlige typer av iskemisk slag hos pasienter og er mindre invasiv og mer konsistent enn Tamura modellen 4,7. Det er en veldig interessant modell for neuroprotection, neurorepair og celledød analyser. Suksessen av intraluminal modellen avhenger av mange faktorer, slik som animalsk kjønn, alder og vekt, temperatur, anestesi og tidspunktet for kirurgi, som må bli kontrollert. De fysiske proprieties av sperreinnretningen (tips diameter, lengde, form og fexibility) er kritisk for konsistensen av MCAO 4. Heri, bruker vi 12 mm lange 6-0 monofilament belagt med silikon på 9-10 mm fra Doccol Corporation. Den store fordelen med denne monofilament er å redusere subaraknoidal blødninger og fordi dens lengde dekket alle ICAlengde, gjenværende blodstrøm, som kommer fra fremre og bakre kommunisere arteriene Circle of Willis og PPA, forhindres og variasjon i infarktvolum reduseres (15% av variasjonen i våre hender) 8. Sutur av CCA reduserer også variabiliteten i det infarktvolum 9.
Omfanget av hjerneskade følgende tMCAO kan vurderes ved forskjellige måter. Nevrologiske underskudd kan måles som tidligere nevnt. Imidlertid er det vanskelig å ha et effektivt tiltak ved denne måten. Omfanget av infarktet er ofte utført av TTC farging. Mer nylig, er magnetisk resonans teknikker også brukt, et spesielt interessant teknologi for neurobeskyttende behandlinger. For å forstå de underliggende cellulære mekanismene som er involvert i slag som neurorepair, celledød eller celleproliferasjon, er studiet av ulike markører ved immunhistokjemi kritisk og meget informativ. Dermed vår protocol av hjernen delen forberedelsene har den store fordelen at disse analysene, og reduserer antall mus som brukes. Videre Tureyen et al. Ti har rapportert at det er god korrelasjon mellom Cresyl fiolett flekker og TTC.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å utlevere.
Produksjon og fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en CIHR TEAM stipend # 82946 CTP, en CIHR stipend # MOP 102741, samt en Canada stol # 216684 og en Strauss Foundation. ER ble støttet av et fellesskap fra den kanadiske Heart & Stroke Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope |  Zeiss |
Stemi 2000 | |
| Fiber-Light High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | ||
| Anesthesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | CDMV | 108737 | |
| Heating blanket | Gaymar Medsearch | TP22G | |
| Infrared heating lamp | |||
| Ultra fine tweezers, style 5 | Electron Microscopy Sciences | 78320-5TI | |
| Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | |
| Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades | Electron Microscopy Sciences | 77926-5S | |
| Negative action tweezers, style KOPINC 5 | Electron Microscopy Sciences | 72850-F | |
| Dissecting scissors 5 1/2" Straight | Cedarlane | 72960 | |
| Autoclip starter set | Harvard apparatus | 34-0557 | |
| BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk | Fisher | 01-804-5 | |
| 5-0 suture | Harvard apparatus | 517763 | |
| Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H | CDMV | 6167 | |
| 12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture | Doccol Corporation | 60SPRePK5 | |
| Seringes 1ml | Fisher | 14-823-2F | |
| Needles 26G1/2 | Fisher | BD-305111 | |
| C57BL/6 mice | IRCM |
References
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia. Neuroreport. 5, 293-296 (1993).
- Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia. Stroke. 25, 165-170 (1994).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition. J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia. J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).
- Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor. Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).
- Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke. J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 131-192 (2003).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
