Summary
En parasit-räddning och omvandling analys med THP1 infekterade celler
Abstract
Leishmaniasis är en av världens mest försummade sjukdomarna, till stor del drabbar de fattigaste av de fattiga, främst i utvecklingsländer. Över 350 miljoner människor som riskerar att smittas leishmaniasis, och cirka 2 miljoner nya fall inträffar årligen 1. Leishmania donovani är den orsakande agent för visceral leishmaniasis (VL), den mest dödliga formen av sjukdomen. Valet av läkemedel som finns tillgängliga för att behandla leishmaniasis är begränsad 2, nuvarande behandlingar ger begränsad effekt och många är giftiga vid terapeutiska doser. Dessutom har de flesta av de första läkemedlen linjens behandling redan förlorat sin användbarhet på grund av ökande flera läkemedelsresistens 3. Den nuvarande ledningen av anti-leishmanial läkemedel också allvarligt utarmas. Krävs fortsatta insatser för att berika en ny anti-leishmanial rörledning läkemedelsforskning, och denna strävan är beroende av tillgången på lämpliga in vitro screening-modeller.
In vitro promastigotes 4 och axeniska amastigotes analyser 5 används i första hand för anti-leishmanial drog screening dock inte vara lämplig på grund av betydande cellulära, fysiologiska, biokemiska och molekylära skillnader i jämförelse med intracellulära amastigotes. Analyser med makrofag-amastigotes modeller anses närmast de patofysiologiska förhållanden leishmanios, och är därför den mest lämpliga för in vitro-screening. Differentierade, icke-delande humana akuta monocytiska leukemiceller (THP1) (gör ett attraktivt) alternativ till isolerade primära makrofager och kan användas för att analysera anti-leishmanial aktiviteten av olika föreningar mot intracellulära amastigotes.
Här presenterar vi en parasit-räddnings-och transformationstest med differentierade THP1 celler infekterade in vitro med Leishmania donovani för screening rena föreningar och naturliga produkterdukter extrakt och bestämma effekt mot de intracellulära Leishmania amastigotes. Analysen omfattar följande steg: (1) differentiering av THP1 celler till icke-delande makrofager, (2) infektion av makrofager med L. donovani metacyclic promastigotes, (3) behandling av infekterade celler med testläkemedel, (4) kontrollerad lys av infekterade makrofager, (5) release / räddning av amastigotes och (6) omvandling av levande amastigotes till promastigotes. Analysen optimerades med tvättmedel behandling för kontrollerad lys av Leishmania-infekterade THP1 celler för att uppnå nästan fullständig räddning av livsdugliga intracellulära amastigotes med minimal effekt på deras förmåga att omvandla till promastigotes. Olika makrofag: promastigotes förhållanden testades för att uppnå maximal infektion. Kvantifiering av infektionen utfördes genom omvandling av levande, amastigotes räddade Leishmania till promastigotes och utvärdering av deras tillväxt genom en alamarBlue fluorometrisk analys i 96-brunnars mikroplattor. Denna analys är jämförbar med den för närvarande använda-mikroskopisk, transgent reportergen och digital-image analyser analys. Denna analys är robust och mäter endast de levande intracellulära amastigotes jämfört med reportergen och bild-analyser analys, som inte får skilja mellan levande och döda amastigotes. Dessutom har analysen har validerats med en aktuell panel av anti-leishmanial läkemedel och har framgångsrikt tillämpats på storskalig screening av rena föreningar och ett bibliotek av naturliga produkter fraktioner (Tekwani et al. Opublicerat).
Protocol
1. Underhålla och subkultur THP1 Cell Culture
- Bibehåll THP1 celler i RPMI-1640-medium (med 10% FBS och pH 7,4) vid 37 ° C i en 5% CO-2-inkubator.
- Subkultur cellerna två gånger i veckan för att förhindra att celler från mer än 1x10 6 celler / ml. Detta är viktigt för att behålla sin förmåga omvandling.
2. Underhålla och subkultur Leishmania donovani promastigotes Kultur
- Bibehåll L. donovani promastigoter (S1, sudan stam) i RPMI-1640-medium (utan natriumbikarbonat och natriumpyruvat) med 10% FBS vid 26 ° C.
- Subkultur L. donovani promastigotes två gånger i veckan, med högsta celler koncentration i intervallet 20-25x10 6 promastigotes / ml.Caution: Alla medier och lösningar skall bringas till rumstemperatur före användning.
3. Ympning och differentiering av de THP1 cellerna i en 96-brunnars mikroplatta och 16-kammare Glass Kultur Slide.
- Framställning av en utspädd THP1 kultur med cellantal av 2.5x10 5 celler / ml från en fyra dagar gammal cellkultur (cellantal bör inte överstiga 10 6 celler / ml) i RPMI-1640 med 10% värmeinaktiverat FBS. Framställdes 20 ml kultur för varje 96-brunnsplatta och 4 ml odling för varje 16-väl kammaren objektglaset.
- Lägg forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (för differentiering av THP1) till utspädda cellkultur suspension (10 μl/20 ml kultur från beståndet av 50 pg / ml i DMSO) (slutlig koncentration PMA i utspädd celler kultur bör vara 25 ng / ml).
- För att jämföra Digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys, upprätta analyserna samtidigt i klara, flatbottnade, 96-brunnars platta och 16-kammare, glas, mikroskopisk kultur bild.
- Dispensera 200 pl THP1-PMA-behandlade celler till varje brunn eller kammare.
- Inkubera 96-brunnars pminutenresor och 16-väl diabilder kammaren i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator över natten för att tillåta nästan fullständig differentiering av cellerna.
Obs! THP1 celler, som normalt växer i suspension, är differentierade i vidhäftande makrofager.
4. Infektion av den transformerade THP1 Celler med Leishmania donovani promastigotes
- För infektion av differentierade THP1 cellkultur med Leishmania donovani promastigotes bör majoriteten av parasiter vara i smittsamma metacyclic stadiet (långa cylindriska former, ~ 5-6 dagar gammal kultur).
- En 1:10 THP1 cell parasit förhållandet är optimalt för infektionen i både digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analysen och den Promastigote-Rescue-Transformation-analys.
- Förbered en utspädd kultur av L. donovani promastigoter med en parasit räkna 2.5x10 6 parasit / ml (för THP1 celler: parasiter förhållande = 1:10) frånen 5-6-dagar gammal odling i RPMI-1640-medium med 2% FBS.
- Från steg 3,5 (efter natten differentiering av THP1 cellkultur) ta ut plattorna och diabilder kammaren, avlägsna mediet och tvätta cellodlingarna gång med serumfritt RPMI-1640-medium.
- Efter noggrann tvättning av PMA-behandlade THP1 celler med serumfritt, varm RPMI-1640 (~ 37 ° C) medium, ersätt det serumfria mediet med 200 pl av den utspädda kulturen av L. donovani promastigoter (2.5x10 6 parasiter / ml) från steg 4,3. Ställ in kontrollbrunnarna av THP1 celler utan parasiten och parasiter utan THP1 celler i varje platta och 16-väl bilder kammare.
- Efter tillsats parasit till THP1 cellkulturen, inkubera plattan och glider vid 37 ° C, 5% CO 2 för 24 timmar för att låta parasiterna att infektera de differentierade THP1 cellerna.
5. Behandling av infekterade makrofagerna med testläkemedlen / föreningar
- TestAmfotericin B, pentamidin och Miltefosine som standard mot leishmanial läkemedel för screening. Bered stamlösningar av narkotika / testföreningar i vatten eller DMSO som nämns i tabell reagens. Testa varje läkemedel förening vid 6 koncentrationer.
- Seriellt utspädd (1:5) standard läkemedel och testföreningar i en ny 96-brunnsplatta eller 2 ml rör (för kammaren objektglas) med RPMI-1640-medium med 2% FBS. De läkemedel / testkoncentrationer sammansatta i denna platta är 2X slutliga koncentrationer.
- Tvätta odlingsplattor och diabilder kammare infekterade med L. donovani promastigoter (från steg 4,5) minst 5 gånger med serumfritt, RPMI-1640-medium. Tillsätt 100 | il odlingsmedium (RPMI-1640 med 2% FBS) i varje brunn / kammare. De många tvättar krävs för att säkerställa fullständigt avlägsnande av icke-internaliserade promastigotes.
- Tillsätt 100 ul medium från serie-utspädd standardlösning mot leishmanial droger eller testföreningar till varje brunn eller kammare. Ställ in infektionented THP1 celler styr utan droger samtidigt i varje platta / kammare bild.
- Inkubera plattorna och diabilder kammare vid 37 ° C, 5% CO 2 i 48 timmar.
6. Chamber Slide färgning, fluorescensmikroskop bildsystem och bildanalys för kvantifiering av infektion och effekt av läkemedelsbehandling
- Efter en 48 timmars inkubering, tvätta kammaren sliden 3 gånger med serumfritt RPMI-1640-medium. Dra av plast kamrarna från glasen och fixera cellerna genom nedsänkning bilderna i metanol under 30 sek. Låt bilderna i bio-huva i luftflöde för torkning.
- Förbered en SYBR Green I färgningslösning (5X) genom utspädning (1:2000) beståndet (10.000 X) med vatten.
- Färga objektglasen under mörka betingelser med utspädda SYBR Green I färga lösningen under 15 min vid rumstemperatur, tvätta en gång med vatten och lämna glasen enligt luftflödet för torkning.
- Placera ett glas täckglas över staiNed bild med hjälp av monteringsmedium.
- Fånga de digitala bilderna av THP1 celler: utan infektion (blank), med infektion (kontroll), infekterade celler som behandlats med olika standard droger eller testföreningar i olika spädningar (Figur 3, 5 och 6)) med hjälp av en Nikon Eclipse 90i fluorescensmikroskop tillsammans av NIS elementet AR 3,2 programvara.
- Räkna makrofag kärnor (stora) och parasiten kärnor (små med kinetoplasten) med ImageJ (Figur 7), som är ett offentligt tillgänglig, Java-baserade bildbehandling program som utvecklats vid National Institutes of Health ( http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Uttryck data som antalet amastigotes per 100 transformerade THP1 celler.
7. Parasiten-rescue-Transformation-analys: Kontrollerad lys av L. donovani Amastigotes-infekterade makrofager
- Tvätta 96-brunnars mikroplatta från steg 5,5 tre gånger med serumfritt RPMI-1640-odlingsmedium.
- Bland olika detergenter testades vid olika koncentrationer, 0,05% SDS-behandling under 30 sekunder är optimal för kontrollerad lys (maximal cellys med minimal förlust av räddade parasiter 'lönsamhet).
- Avlägsna det serumfria mediet från varje brunn efter den sista tvättningen och tillsätt 20 pl RPMI-1640 (med 0,05% SDS) till varje brunn. Skaka plattan under 30 sekunder och tillsätt 180 pl komplett RPMI-1640 (med 10% FBS) till varje brunn.
- Inkubera plattorna vid 26 ° C under 48 timmar för omvandling av räddade amastigotes till promastigoter.
8. Kvantitativ analys av transformerad Promastigote (alamarBlue analys)
- Efter en 48 timmars inkubering vid 26 ° C, är alla de räddade levande amastigotes omvandlas till promastigoter (figur 1D). Tillsätt 10 | il alamarBlue i varje brunn i 96-brunnars pminutenresor.
- Inkubera plattorna vid 26 ° C över natten.
- Efter inkubation över natt, läs plattorna för standard fluorescens på en FLUOstar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) vid 544 nm excitation, 590 nm emission.
- Förbered dosresponskurvor (procent tillväxt mot koncentration av läkemedlet eller testföreningen) med ExcelFit (figurerna 7-9) och beräkna IC 50 / IC 90-värden från dessa kurvor (tabell 1).
9. Standardisering av THP1 celler till Parasiter Ratio
- Standardisera THP1 cellerna till parasiter förhållande för att bestämma analysens känslighet. Obs: Låg / hög parasiter siffror / infektion kan kompromissa med känslighet och selektivitet för screening.
- Standardisera THP1 celler till parasiter förhållandet genom att följa protokollet som beskrivits ovan för THP1 celler sådd och Leishmania promastigote infektion (avsnitt 3 och 4) med undantag för användning different förhållanden av THP1 celler till parasiter som 1:1,25, 1:2,5, 1:5 och 1:10.
- Ställ in experimentet både 16-kammare bild (för bildanalys) och 96-brunnsplatta (för parasit-räddning analys) format för att jämföra parasiten räddnings-och bild-analyser analys.
10. Standardisering av olika tvättmedel för kontrollerad cellysering
- Det primära syftet med detta experiment är att optimera protokollet för kontrollerad lys av THP1 cellerna för att uppnå maximal / komplett THP1 celler lys utan att väsentligt påverka lönsamheten för de räddade amastigote parasiter.
- Testa olika detergenter såsom Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 och SDS vid olika koncentrationer och olika löptider för behandling (Figur 2).
- THP1 celler till parasiter förhållandet är 1:10 och andra villkor är lika som ovan avsnitt 1-8.
- Testa 0,05% SDS behandling längre för olika behandlingstids att ytterligare optimera det styrda cellys.
Representative Results
En kvantitativ analys gjordes för både digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys för 24, 48, 72 och 96 timmar efter läkemedelsbehandling
I den direkta metoden räkning, infektion av L. donovani-infekterade makrofager (THP1 celler) beräknades genom följande ekvation:
De amastigotes (bestämd genom att räkna amastigotes kärnor) / 100 transformerade THP1 celler (bestäms genom räkning räknas vid THP1 cellkärnor) (Figur 7) är ett mer rättvisande mått för att analysera effekten av olika standard eller testföreningar än andelen smittade THP1 celler , som rapporterats i vissa tidigare papper, eftersom detta antal är direkt relaterad till totala effekten av föreningar, antingen genom en minskningi parasiter i makrofagceller eller total borttagning av parasit från makrofager cells.Infection beräknades från digitala bilder av infekterade THP1 celler som behandlats med olika standard droger i olika spädningar för olika tidsintervall (figur 10 och tabell 1). Den avläsning för Digital-bildanalys-Direct-räkning-analysen var amastigotes infection/100 omvandlades THP1 celler, medan avläsning för parasiten-Rescue-Transformation-analys var relativt fluorescensenheter (RFU), vilket är direkt proportionell mot antalet levande Leishmania amastigotes räddats från de infekterade makrofager och förvandlas till promastigotes. Den alamarBlue analysen används rutinmässigt för Leishmania promastigotes mot leishmanial drog screening.
Analysen var initialt standardiserad och optimerad för kontrollerad lys av Leishmania-infekterade THP1 celler. Målet var att optimera förutsättningarna för rengöringsmedel Treatment, vilka ger nästan fullständig lys av THP1 celler med minimal effekt på livsduglighet räddade amastigotes. Figur 1 visar en mikroskopisk vy av den fullständiga analysprotokollet. Intakta THP1 celler infekterade med Leishmania amastigotes kan ses i figur 1A. Figur 1B visar lys av THP1 cellerna efter detergentbehandling. Visar räddade Leishmania amastigotes, som delvis har omvandlats till promastigoter och Figur 1D Figur 1C visar nästan fullständig omvandling av amastigotes till promastigotes och deras efterföljande spridning. Tillväxten av dessa transformerade promastigoter kan kvantitativt övervakas med tillsats av alamarBlue och mätning av fluorescens på en mikroplattläsare. Behandling med NP-40 (figur 2A) och Triton X-100 (fig. 2B) lyserade de infekterade THP1 cellerna, men även påverkade livskraften ochomvandling av de räddade amastigotes. Behandling med Tween 20 (figur 2C) och Tween 80 (figur 2D) orsakade inte optimal lys av THP1 celler resulterar i en ofullständig rädda amastigotes vilket framgår av lågt antal transformerade promastigotes. Behandling med 0,05% SDS i 30 sek (figur 2E) gav nästan fullständig lys av Leishmania-infekterade THP1 celler och påverkade inte livskraft och omvandling av räddade amastigotes. Ytterligare optimering visade att behandling av celler med 0,05% SDS i 20-30 sekunder gav högsta undsättning av livskraftiga Leishmania amastigotes (Figur 2F). I efterföljande experiment, sek behandling med 0,05% SDS under 30 användes. Förfarande för SDS-behandling är densamma för ett eller flera plattor. I flera plattor, var SDS-behandling genomfördes kolumn för kolumn med en multikanalpipett. Serumfritt medium avlägsnades från alla 8 brunnar i en kolumn av plattan och 20 & mu, L av 0,05% SDS tillsattes i 8 brunnar i samma kolumn och späddes efter 30 sekunder med RPMI-1640 med 10% FBS. Under initial standardisering av analysen, plattorna kontrollerades i mikroskop för icke-internaliserade promastigoter. Minst fem tvättningar var nödvändiga för att avlägsna parasiter innan steg 5 för behandling av infekterade makrofagceller med standardföreningar och tre tvättvätskorna var nödvändiga före steg 7 i SDS-behandling. Sålunda, tvättades cellerna 8 gånger och inga synliga icke internaliserade promastigoter återstod före kontroll lys av infekterade celler THP1.
Digital Bildbehandling och direkt räkning
De digitala bilderna av Leishmania-infekterade THP1 celler fångades på Nikon Eclipse 90i fluorescerande mikroskop efter färgning med SYBR Green I. Både makrofag kärnor och intracellulär Leishmania kärnor med karakteristisk kinetoplasten DNA observerades under fluorescerande filter (Figur 3). Vidare var de bilder av infekterade THP1 celler också fångas i DIC. När båda bilderna slogs samman, var konturerna av THP1 celler med intracellulära amastigotes ses tydligare (Figur 4). ImageJ programvara användes för att analysera dessa bilder. ImageJ är public domain, Java-baserade, bildbehandling program som utvecklats vid National Institutes of Health ( http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ har utformats med en öppen arkitektur som ger utbyggbarhet via Java plugins och makron inspelningsbara. Anpassad förvärv, analys och bearbetning plugins kan utvecklas med hjälp ImageJ: s inbyggda redigerare och Java-kompilator. För differentiell räkning av THP1 celler kärnor och parasiter kärnor från ImageJ var bilden öppnas i ImageJ. Celltalsräknare hittades i Analysera alternativet plugin av programvaran. Bilden initieras och cellräknaren typ 1 valdes för THP1 cell kärnor och celltalsräknare typ 2 valdes för parasit kärnor (Figur 3). Differentiell räkning gjordes för minst 200 THP1 cellkärnor och de intracellulära amastigotes närvarande i dessa THP1 cellkärnor. En jämförelse av parasit-räddning analys och bildanalys metod gjordes för att utvärdera infektivitet THP1 celler med olika makrofag:. Promastigotes förhållanden (Figur 4) Figur 5 visar skillnaden smittsamhet i THP1 celler vid olika makrofag: promastigote förhållanden. Båda metoder visade jämförbara resultat och makrofag: promastigote förhållande 1:10 gav optimala och reproducerbara smittsamhet.
När villkoren för parasite-rescue/transformation analys och digital bildanalys optimerades var användbarheten av dessa analyser utvärderades för anti-leishmanial läkemedelsscreening. De Leishmania-infekterade THP1 celler behandlades med olika koncentrationer av standard enNTI-leishmanial droger nämligen amfotericin B, pentamidin och miltefosin för olika tidsintervall allt från 24 till 96 timmar. Experimentet för parasiten räddade / transformationstest gjordes i tre exemplar och experimentet för direkta celler räkna metod gjordes i duplikat. Figur 6 visar mikroskopiska bilder av kontrollen infekterade, kontroll infekterade obehandlade och Leishmania-infekterade, behandlade THP1 celler. De dosresponskurvor framställdes från parasiten-räddning och transformationstest (koncentration av läkemedlet kontra transformerade parasiter) och bildanalys analysen (antal amastigotes/100 THP1 celler) (fig 7-9). IC 50 av läkemedlen beräknades genom ExcelFit och presenteras i tabell 1. Digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys visade jämförbara resultat. Digital-bildanalys-Direct-räkning-analys var mindre optimal under de första tidpunkterna 24 och 48 timmar drog treatments, medan parasiten-Rescue-Transformation-analys visade resultat stämmer bättre överens med de rapporterade värdena vid alla tidpunkter under 24-96 timmar efter läkemedelsbehandling. Denna skillnad i resultat med digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys kan bero på förekomst av icke-viabla amastigotes under tidiga perioder av läkemedelsbehandling inom digital-bildanalys-Direkt-räkning -analys.
Figur 1. En mikroskopisk bild av Leishmania donovani amastigotes räddnings-och omvandling till promastigotes. A - Vidhäftande THP1 celler infekterade med Leishmania amastigotes, B - vidhäftande, infekterade THP1 celler efter kontrollerad lys C - transformerade Leishmania donovani promastigotes från amastigotes räddade från infekterade THP1 makrofagceller D - Tillväxt och spridning av transformed Leishmania donovani promastigotes.
Figur 2. Optimering av kontrollerad lys av infekterade THP1 celler för att uppnå maximal räddning av levande Leishmania donovani amastigotes och deras omvandling till promastigotes. Analys av lys av THP1 celler och räddning av amastigotes från Leishmania-infekterade THP1 celler med olika rengöringsmedel. Två koncentrationer (0,05% och 0,1%) för tvättmedel och två tidsperioder (30 sek och 60 sek) för behandling testades. RFU = relativa fluorescens enheter. Varje stapel representerar medelvärdet av dubbla observationer. [A] NP-40 behandling orsakade lys av THP1 celler och också påverkat lönsamheten för de räddade amastigote parasiter. [B] Triton X-100 treatment orsakade lys av THP1 celler och också påverkat lönsamheten för de räddade amastigote parasiter [C] Tween 80 orsakade partiell lys av THP1 celler för att rädda amastigotes. [D] Tween 80 orsakade partiell lys av THP1 celler för att rädda amastigotes. [E ] SDS-behandling orsakade nästan fullständig lys av THP1 celler och påverkade inte livskraft räddade amastigotes på 0,05% / 30 sek. [F] Behandling med 0,05% SDS i 20-30 sekunder orsakade nästan fullständig lys av THP1 celler och räddade livskraftiga parasit amastigotes att omvandla till promastigotes. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Fluorescerande digital bild av en differentierad THP1 cell infekterad in vitro med Leishmanien donovani amastigotes. Den karakteristiska kDNA kan också ses med varje parasit kärna. Den makrofag kärnan (mN) (1) och parasiten kärnorna (pN) (2) kan vara differentiellt märkta och differentiellt räknades med ImageJ analysprogram för kvantitativ utvärdering av infektionen. Kvantifieringen utfördes som antal amastigotes/100 THP1 celler.
Figur 4. Jämförelse mellan digital-bildanalys-Direct-räkning-analys (nedre panelen) och Parasit-Rescue-Transformation-analys (övre panelen). Den makrofag: promastigote förhållande 1:10 gav optimala infektion. Båda visade jämförbara resultat. Parasiten-räddning test visade vissa bakgrundsvärdena. Varje stapel visar medelvärdet av dubbla värden.
Figur 5 THP1 celler infekterade med Leishmania promastigotes av olika THP1:. Promastigote förhållande. De kvantitativa resultaten som antalet amastigotes/100 THP1 celler presenteras i figur 4.
Figur 6. Digitala bilder (Fluorescent + DIC) av THP1 celler infekterade med Leishmania donovani amastigotes efter behandling med vanliga anti-leishmanial läkemedel för olika tidsperioder. Resultat kvantifierades som antal amastigotes/100 THP1 celler och används för att beräkna procent tillväxt jämfört med obehandlade kontroller och bestämma IC 50-värden.
Figur 7. Jämförelse av digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys för anti-leishmanial drog screening (Amophotericin B). De infekterade makrofagerna behandlades med olika koncentrationer av standard mot leishmanial läkemedel för olika perioder. IC 50 (pg / ml) värden beräknades från dosresponskurvan av Excelfit. Klicka här för att se större bild .
Figur 8. Jämförelse av digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys för enNTI-leishmanial drog screening (Pentamidin). De infekterade makrofagerna behandlades med olika koncentrationer av standard mot leishmanial läkemedel för olika perioder. IC 50 (pg / ml) värden beräknades från dosresponskurvor av Excelfit. Klicka här för att se större bild .
Figur 9. Jämförelse av digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys för anti-leishmanial drog screening (Mitefosine). De infekterade makrofagerna behandlades med olika koncentrationer av standard anti-leishmanial läkemedel för olika tidsperioder. IC 50 (ig / ml)-värden beräknades från dos-responskurvorna från Excelfit.Klicka här för att se större bild .
| Testläkemedel | 24 tim a | 48 tim en | 72 timmar en | 96 tim a | ||||
| IACA B | PRTA c | IACA B | PRTA c | IACA B | PRTA c | IACA B | PRTA c | |
| Amfotericin B | 0,24 ± 0,03 | 0,17 ± 0,01 * | 0,12 ± 0,04 | 0,20 ± 0,07 | 0,06 ± 0,01 | 0,06 ± 0,01 | 0,11 ± 0,03 | 0,10 ± 0,03 |
| Pentamidin | > 10 | 2,55 ± 1,16 * | 2,88 & plusmn; 0,58 | 1,43 ± 0,91 | 1,24 ± 0,35 | 1,52 ± 0,16 | 0,71 ± 0,63 | 0,98 ± 0,33 |
| Miltefosin | 0,38 ± 0,02 | 0,19 ± 0,08 * | 0,24 ± 0,06 | 0,30 ± 0,08 | 0,36 ± 0,02 | 0,16 ± 0,06 | 0,21 ± 0,15 | 0,17 ± 0,10 |
Tabell 1. Jämförelse av digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys för anti-leishmanial drog screening. De infekterade makrofagerna behandlades med olika koncentrationer av standard mot leishmanial läkemedel för olika perioder. IC 50 (ig / ml)-värden beräknades från dos-responskurvorna från Excelfit (figurerna 7-9) en Timmar efter läkemedelsbehandling,. B. IACA = Bildanalys och direkt räkningAnalys c PRTA = Parasit-Rescue and Transformation analys. Angivna värden är IC 50 (koncentration av läkemedlet som orsakar 50% inhibering i parasit tillväxten) som | ig / ml och är medelvärdet ± SD av minst tre experiment. * Statistiskt skild (<0,05) jämfört med IC 50-värden med IACA.
Discussion
Det finns flera metoder för anti-leishmanial drog screening baserad på makrofag-amastigote modeller. Analyser kan göras med makrofager som samlats in från värddjur nämligen peritoneala exsudatceller (PEC), perifert blod monocyt celler (PBMC) 6 eller benmärg-härledda makrofager (BMM) eller i monocytiska cellinjer, såsom mus (J774 och RAW264.7 ) 7 och humant (THP1, U937, HL-60) 8 monocytiska celler. Analyserna, som använder dela värdceller, måste se till att störande effekter av läkemedel aktivitet på både parasiten och värdceller nummer beaktas. De differentierade primära makrofager som samlats in från olika källor, såsom möss och råttor är icke-delande i naturen, men dessa cellberedningar kanske inte har homogena cellpopulationer. Monocytiska celler-härledda cellinjer är homogena till sin natur och är en bättre modell för makrofag-amastigote-screening. Av olika monocytiska cellinjer, differentiated THP1 celler (human akut monocytisk leukemi cellinje) kan bilda en icke delande monolager och erbjuda ett attraktivt alternativ till primära isolerade makrofager.
Den makrofag-amastigote-screening kan göras på flera sätt. Klassisk mikroskopisk utvärdering baserad på direkta cell och parasit räkna 9 är arbetsintensiv. Frånvaron av automatisering begränsar användbarheten av denna analys. Räkning av celler är tidsödande och kan ge felaktiga bestämning av IC50-värden eftersom bestämning av parasit livskraft genom ett färgningsprocedur är svårt. Många fluorescerande färgämnen och monoklonala antikroppar kan användas för flödescytometriska analyser 10, 11, men dessa analyser är också begränsade på grund av mindre känslighet och begränsning av tidsintervallet av läkemedel-behandling endast en dag. Det finns flera reporter gen analyser tillgängliga för att kvantifiera tillväxten av intracellulära amastigotes 12,13,14. En automated screening kan vara möjligt med användning av reportergener, men dessa analyser har också vissa nackdelar. Först, majoriteten av dessa analyser kräver läkemedelsselektion för att upprätthålla episomalt uttryck av reportergenerna, vilket inte kan vara perfekt för en drog screening experiment. Det sätt på vilket reportergenen införes kan också påverka de fysiologiska egenskaperna hos parasiten och påverkar screeningen. Om reportergenen är den del av en episomal plasmid, kan den relativa produktionen av reporter beror på kopietalet av transfekterad plasmid (som varierar från cell till cell) snarare än på aktiviteten hos läkemedlet 14. Vissa reporter parasiter som är transformerade parasiter inte behöver selektivt tryck för att bibehålla reportergenen, men kan det vara biologiska följder antingen genom att störa den genomiska arkitekturen eller bara genom närvaron av de främmande proteinerna reporter 15. I vissa baserade reporter gen analyser, finnsfrågor om känslighet och bakgrundsaktiviteten 16. Viktigast kan många av de uttryck reporter genen analyser, speciellt en med GFP reporter gene15, skiljer inte mellan de levande och döda intracellulära amastigotes. Analyser baserade på luciferas reportergen kan urskilja mellan levande och döda intracellulära amastigotes, men substrat och cell-lyseringsbuffert för dessa analyser är dyra för storskalig screening 17. För att övervinna dessa nackdelar och begränsningar av tidigare makrofag-amastigote-baserade screeningsanalyser, har vi utvecklat och optimerat denna parasit-räddning och omvandling analys. Denna analys är baserad på THP1 celler, som har god homogenitet och är icke-delande i naturen, som värdceller.
Parasiten-rescue-Transformation-analys analys som beskrivs här är jämförbar med analys baserad på digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning av de intracellulära amastigotes. Lysrör och DIC mikroskopi, digitala image analyser från ImageJ för differentiell räkning av makrofager kärnor och parasiten kärnorna har ytterligare förfinat mikroskopräkning analysen. Fånga bilder i lysrörsbelysning filter och differential interferens kontrast (DIC) filter har förbättrat kvaliteten på den digitala bilden för mer exakt räkning av de intracellulära parasiter. Både lysrör och DIC bilder kan slås samman för att erhålla digitala bilder med tydliga konturer makrofagcellinjer och fluorescerande intracellulär kärnor. Den makrofag kärnor och parasiten kärnorna kan differentiellt igen med ImageJ. Därför är både digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys har potential för automatisering och tillämpning på storskalig screening. De kritiska stegen i Parasite-Rescue-Transformation-analys är: (a) upprepade tvättningar av THP1 cellkulturer efter exponering för Leishmania promastigotes att säkerställa nästan fullständig borttagning av icke-praktikantOrealiserade promastigotes och (b) styrd lys av de infekterade THP1 cellerna med SDS. Båda stegen kan också styras med automatisering och bör inte kompromissa med genomströmning av analysen. Det andra steget av tvättar, efter exponering av infekterade Leishmania THP1 celler testläkemedlen / föreningar avlägsnar de återstående icke-internaliserade parasiter, om något. Parasiten-rescue-Transformation-analys erbjuder betydande fördelar jämfört med befintliga mikroskopiska, reportergen och bild-analyser analys. Analysen är enkel, robust, och reproducerbar, kan automatiseras för storskalig screening och bör därför ha viktig tillämpning vid screening av stora bibliotek föreningar för nya anti-leishmanial läkemedelsforskning. Vidare kan analysen också användas för att utvärdera smittsamhet av kliniska, liksom, laboratorieisolat av Leishmania in vitro.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den NCNPR-USDA-ARS vetenskaplig enighet nr 58-6408-2-0009, CDMRP beviljande av bidrag # W81XWH-09-2-0093 från US Army Medicinsk forskning och Materielverk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H.
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
