הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Summary

ההגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) היא assay במבחנה לחקר גיור פריון ומחסומי מתח ומינים. זה גם יכול לשמש כבדיקת גילוי פריונים.

Abstract

פריונים הם גורמים מזהמים שגורמים ספג המוח המסיר תמיד הקטלני (TSE) בחיות ובני אדם ^9,18. חלבון הפריון יש שני isoforms השונה, חלבון שאינו מדבק מארח בקידוד (PRP ^C) וחלבון המדבק (PRP ^Sc), איזופורם חריג מקופל של PRP ^{C 8.}

אחד האתגרים של עבודה עם סוכני פריונים הוא תקופת הדגירה הארוכה לפני התפתחות סימנים קליניים לאחר חיסון מארח ^13. זה מנדט מסורתי מחקרי אסיי לבעלי חיים ארוכים ויקרים. יתר על כן, את התכונות הביוכימיות וbiophysical של PRP ^Sc מאופיינות גרוע עקב מצבי הצבירה קונפורמציה ויוצאת הדופן שלהם.

PRP ^Sc יכול לזרוע את ההמרה של PRP ^C כדי PRP ^Sc במבחנה ^14. PMCA היא טכניקה במבחנה שלוקחת אדוהntage של יכולת זו באמצעות מחזורי sonication ודגירה כדי לייצר כמויות גדולות של PRP ^Sc, בקצב מואץ, ממערכת המכילה כמויות עודפות של PRP ^C וכמויות זעירות של זרע PRP ^{Sc 19.} טכניקה זו הוכיחה את היעילות לסכם את הספציפיות מינים וזן של PRP ^Sc המרה מPRP ^C, לחקות הפרעות מתח פריון, וכדי להגביר את הרמות נמוכות מאוד של PRP ^Sc מרקמות נגועות, נוזלים, ודגימות סביבתיות ^{6,7,16, 23.}

פרטי נייר זה פרוטוקול PMCA, כולל המלצות לצמצום זיהום, שהניב תוצאות עקביות, וכימות תוצאות אלה. גם אנחנו דנים כמה יישומי PMCA, כולל דור ואפיון של זני זיהומיות פריון, הפרעות מתח פריון, וזיהוי של פריונים בסביבה.

Protocol

1. הכנת הציוד

1. השתמש Misonix 3000 או 4000 sonicator Misonix (Farmingdale, ניו יורק) מחובר לThermo Electron Neslab אמבטית EX-7 מים (Newington, NH) כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס Sonicate את הדגימות ב200 רצועות μl בעלי קירות דקים PCR צינור עם כובעים כיפה מתקבלים מThermo Scientific (Waltham, MA).
2. Sonicator מותג חדש דורש "פריצה" תקופת ההפעלה רציפה ^9. פריצה של חודשי תקופה מורכבת של פרץ 40-sec sonication ומחזורי דגירה 10-דקה עם רמת המשרעת להגדיר עד 10. אדם צריך להתבונן בשחיקה לאורך פני השטח של טיטן microplate הצופר (1 איור, לוח ב '). המים זורמים ייראו עכורים לבן עקב שחיקה של טיטניום microplate הצופר. החלף את המים מדי יום.
3. ההגברה של PRP ^Sc תשתנה לאורך קרן microplate. יעילות ההגברה הטובה ביותר PRP ^Sc ניתן לקבל בתוךברדיוס של 5 סנטימטר ממרכז microplate הקרן (ראה תרשים 1, לוח ג').
4. סיבוב אחד PMCA מורכב 144 מחזורים. כל מחזור מורכב מsonication 5 שניות ודגירת דקות 10. זה בערך כרוך ל24 שעות בכל סבב של PMCA.
5. תפוקת החשמל של sonication, מוצגת בלוח הבקרה של sonicator, משתנית עם המספר של צינורות הנמצאים במדף של sonicator והטמפרטורה של מים זורמים מאמבט מי PCR. ודא שהמים מתאזנים על 37 מעלות צלזיוס, ולא למלא יותר מ 30% ממתלת הצינור של sonicator (1 איור, לוח C). מורח את צינורות PCR דרך קרן microplate. יש שורה אחת לפחות של חלל ריק בין רצועות צינור PCR ולאפשר לא יותר מארבעה צינורות המחוברים יחדיו לרצועה (1 איור, לוח C).
6. כוחו של sonication הוא קריטי להגברת לחץ פריון מוצלחת. בעוד sonicating, להתאים את המשרעת ליש כוח תפוקההנע בין 155 ~ 170 ואט. במעבדה שלנו ברמת הכח מוגדרת לשישה ושבעה לMisonix 3000 ו Misonix 4000, בהתאמה.
7. השתמש במים מזוקקים באמבט המים כדי להימנע מצבירת כתמי מים קשים. חלף שבוע מים זה. במהלך מחזורי הדגירה וsonication, עיבוי מים יתרחש בתוך מכסת צופר microplate. כדי למנוע התעבות, לצרף פנקס חום אקווריום קטן לחלק העליון של תיבת המארז של sonicator כפי שמוצג באיור 1, לוח א '

2. הכנת הדוגמות

1. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי אוניברסיטת קרייטון ומשתמשים ועדה ולעמוד במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. לפני כל אוסף רקמות, החיה חייבת להיות מורדמת וtranscardially perfused באמצעות פוספט קר כקרח שנאגר תמיסת מלח עם 5 מ"מ בEDTA pH 7.4 להסיר דם מהמוח ולהימנע מהעיכוב שלתגובת PMCA ידי דם ^7. איסוף רקמות חיות במהירות באמצעות טכניקת aseptic ויש כלי נתיחה ייעודיים עבור כל זן פריון. לאחר נתיחה, הנח את הרקמה בצינור microcentrifuge מ"ל 1.5, פלאש להקפיא אותו על קרח יבש, ולאחסן אותו ב-80 ° C עד הומוגניות.
2. כדי להכין את מצע PMCA פתרון (PRP ^C), הומוגני מוח אוגר אינו נגוע (האו"ם BH) לפתרון 10% משקל / נפח (W / V) עם חיץ המרת קרח קר (ראה חלק 3) באמצעות מטחנת רקמת Tenbroeck. בעוד מאחד, להיזהר לא להכניס אוויר בתוך המטחנה להימנע מוגזם קצף מהפתרון. הבהר את הפתרון על ידי צנטריפוגה XG ב 500 למשך 30 שניות וaliquot supernatant ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. חנות ב -80 ° C עד שימוש נוסף.
3. כדי להכין את פתרון זרע PMCA (PRP ^Sc), הומוגני חומר זיהומיות (מוח, טחול, בלוטות הלימפה, רקמות אחרות או אדמה מזוהמת) כדי 10% פתרון w / v עם wate הקר כקרחr וaliquot הפתרון ב 0.6 צינורות microcentrifuge מ"ל. חנות ב -80 ° C עד שימוש נוסף.

3. הכנת מאגר המרות

1. שוקל 0.5093 גרם של טריטון X-100 בנפח בקבוק 50 מ"ל (תוצאה היא 1% ריכוז סופי של טריטון X-100) (סיגמה אולדריץ GmbH; Steinheim, גרמניה).
2. הוסף פרוטאז אינהיביטור Tablet אחת שלם (Roche Diagnostics GmbH; מנהיים, גרמניה).
3. הוסף 0.0931 גרם של EDTA (זה יביא לריכוז סופי של 5 מ"מ EDTA) (Mallinckrodt ייקר Inc; Phillipsburg, ניו ג'רזי).
4. התאם את ה-pH ל 7.4 עם 1N NaOH.
5. התאם נפח 50 מ"ל עם פוספט של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS) (Mediatech Inc; Manassas, VA).
6. סנן את הפתרון דרך קרום ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45 עם מנגנון סינון ואקום. חיץ ההמרה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בחודש.

4. הגברה של זני פריוני שימוש PMCA

1. לדלל את זרע PMCA לתוך מצע PMCA ביחס של 1:20 (5 μl תמהיל כלומר מזרע PMCA ו95 μl של מצע PMCA) לתוך צינור PCR. הסר ולאחסן aliquot μl 15 ב-80 ° C לבקרת unsonicated; שליטת unsonicated זה ישמש לכמת הגברת PRP ^Sc דרך עיכול proteinase K (קי) ואחריו הניתוח מערבי כתם (WB). שליטת unsonicated נוספת יכולה להיות שנוצרה על ידי נחת aliquot μl 15 שניות על 37 מעלות צלזיוס למשך PMCA התגובה. מינימום שלוש חזרות נדרש למטרות סטטיסטיות.
2. נושא שארית המדגם (70 μl) לסיבוב אחד של PMCA כמתואר בתרשים 1, לוח א 'Shake צינורות כל 5 hr כדי למנוע התעבות מים על כובע הכיפה של צינור PCR.
3. הצינורות של המדגם צריכים להיות סובבים למטה ועדינות vortexed (נזהר שהפתרון אינו נכנס כיפה) לפני הפתיחה אחרי כל הליך כדי להבטיח homogeneity ולמנוע אפשרות של זיהום.
4. לPMCA הסידורי (sPMCA) של זני תקופת דגירה קצרים (כלומר ח.י. TME, HaCWD, או 263K), לדלל את החומר בsonicated יחס של 1:20 ידי העברת 5 μl של מדגם sonicated מסיבוב אחד ל95 μl של נגוע טרי המוח homogenate (איור 2, לוח ב ').
5. לsPMCA של זני תקופת דגירה ארוכים (כלומר ד.י. TME, 139H, 22CH, 22AH, או ME7H), לדלל את חומר sonicated ביחס של 1:1 על ידי העברת 50 μl של מדגם sonicated מסיבוב אחד ל50 μl של נגוע טרי המוח homogenate (איור 2, לוח ב ').
6. הסרת שתי 15 aliquots μl מתערובת sonicated דילול בעבר (מצעדי 4.4 או 4.5) ולאחסן את אחד מהם ב-80 ° C והשני על 37 מעלות צלזיוס (פתרוני בקרה unsonicated לPMCA סיבוב השני). להכפיף את השרידים לPMCA סיבוב שני.
7. הליך זה ניתן לחזור ללא הגבלה זמן. במעבדה שלנו, אנחנובצע עד 15 סיבובי PMCA, עם מאפייני הזן שנותרו ללא שינוי.
8. PK לעכל את הדגימות. לWB טיפוסי, לערבב 5 μl של קי μl 80 מיקרוגרם / מ"ל ​​עד 5 מתוך מדגם (פתרון זה יהיה ריכוז PK סופי של 40 מיקרוגרם / מ"ל) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הוסף 10 μl של חיץ טעינת ג'ל. פתרון זה מרתיח למשך 10 דקות. בואו הפתרון להתקרר ולטעון 10 μl לג'ל.
9. כדי לחשב את ההצלחה של הגברה לבצע ניתוח WB על דגימות PK-מתעכלים להעריך את הכמות המוגברת PRP ^Sc ידי ההשוואה לאחד, פקדי unsonicated ^20,21 תרשים 2, לוח C או לסכומים ידועים של PK-מעוכלים רקומביננטי PRP.

5. הימנעות מזיהום צולב

שלבים קריטיים יש לנקוט כדי למזער את הזיהום צולב ואת המופע של תוצאות חיוביות שגויות עקב דה נובו היווצרות של מוצרים עמידים פרוטאז.

שימוש בערכה ייעודית של כלי נתיחה (כלומר מלקחיים, פינצטה, מספריים) לאיסוף דגימה לכל זן פריון.

לפני מאחד מוחות נגועים כדי לשמש כמצע PMCA, נגב את pipettes באקונומיקת 1%. משרה המדף של sonicator PCR הצינור, homogenizers רקמות, ומדפי אחסון צינור PCR באקונומיקת 1% למשך 10 דקות ולשטוף היטב במים מזוקקים.

לכסות את אזור העבודה עם שתיין Versi-יבשת מעבדת טריה בכל פעם מדגם חדש הוא להיות homogenized, ניסוי PMCA חדש הוא להיות מוכן, או כאשר aliquoting בין סיבובי sPMCA.

השתמש בכפפות בכל פעם חדשות דגימות חדשות מטופלות (במיוחד בעת העברת aliquots בין סיבובי sPMCA).

השתמש פרצי sonication קצרים לכל מחזור PMCA. המחזורים של sonication 5 שניות בשילוב עם דגירת 10 דקות מספיקים כדי להגביר פריונים מבלי ליצור דה נובו PRP ^{Sc 1,20,21,23,24.} כמעבדות אחרות הראו, הגדלהזמן sonication, הגדלת המשרעת sonication, ולהרחיב את מספר מחזורי PMCA מגדילה את ההסתברות לדה נובו PRP ^Sc היווצרות ^2.

Representative Results

הגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) משמשת כדי להגביר PRP ^Sc במבחנת ^{7, 12, 14, 19, 24.} הגברת ^Sc PRP מוצלחת מוצגת על ידי עלייה בעוצמת להקה על כתמים מערביים של חלבון פריון קי העמיד (נודד בין 19 ו 30 kDa לזני פריוני אוגר-derived) כפי שמוצג באיור 3. העלייה בעוצמת הלהקה שלה לאחר PMCA מציין הגברה של חומר ^Sc PRP קי העמיד. הגברה מוצלחת של החלבון המופק מאוגר הפריונים, HaCWD וד.י. TME, מוצגת בניתוח WB של איור 3 על ידי השוואת עוצמות הלהקה לפני (נתיבים 5 ו 7) ואחרי (4 נתיבים ו6) PMCA.

PK עיכול של PRP ^Sc אחרי ניתוח WB מראה להקה מקבילה לחלבון הפריון די, מונה, וunglycosylated, בהתאמה עליונה, אמצעית ותחתונה. כמה זני פריון יכולים להיות מובחנים על ידי eleניידות ctrophoretic. לדוגמה, יש הבדל של שני kDa בהגירה בין זני פריוני TME dy HaCWD ו. (איור 3, נתיבי 1 ו 2, בהתאמה).

הגברת איכות גבוהה PRP ^Sc מושגת על ידי ^{1 PMCA, 7, 12, 19, 23, 24.} נאמנות גבוהה זה בהגברת PMCA הוא נצפה על ידי הגירת electrophoretic דומה של זני פריוני PMCA מוגברים-(HaCWD וד.י. TME) בהשוואה לזרעים המקבילים שלהם (איור 3; נתיבים 1 ו 4 ו 2 ו 6 לHaCWD וד.י. TME, בהתאמה).

אם אין זיהום צולב או דה נובו היווצרות ^Sc PRP מתרחשת, הניתוח של דגימות דמה WB בקרת PMCA צריך להישאר ברור לאחר עיכול קי (3 איור, נתיבים 8 ו 9).

איור 1. כדי למנוע התעבות מים, אקווריום רגיל חום משטח ממוקם מעל מכסה microplate הצופר (פנל). Sonicator מותג חדש יש לאפשר תקופת החניכות של sonication הרציף למשך כחודשים. לוח ב 'מציג את השחיקה בטיטניום microplate הקרן לאחר תקופת החניכות. לוח C מראה הסדר אפשרי של רצועות צינור PCR שיאפשר sonication אופטימלי של הדגימות.

איור 2. תרשים זרימה לPMCA (פנל), sPMCA (לוח ב '), וניתוח WB (הפנל C). PRP ^Sc הוא זרע PMCA וhomogenate המוח אינו הנגוע (האו"ם BH) הוא מצע PMCA. כימות המוגברות PRP ^Sc עבור כל PMCA סיבוב מתקבלות על ידי חלוקת עצמת הלהקה לאחר PMCA לפי עצמת הלהקה המתאימה לו לפני PMCA.

ys ">
איור 3. כתם מערבי של זני פריוני אוגר-derived dy TME PK-מתעכל HaCWD ו. PRP ^Sc הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי 3F4 פריון. ניתוח של WB מראה שפע (עוצמת כתם) וניידות electrophoretic של PRP ^Sc. תגובות PMCA נזרעו עם homogenate המוח מהאוגרים נגועים או HaCWD (נתיבי 4-5) או ד.י. TME (נתיבי 6-7) סוכנים. דגימות שעברו PMCA (PMCA +) מצביעות על עלייה בשפע ^Sc PRP לעומתם unamplified (PMCA -) הפקדים (השווה נתיבים 5-4 ו 7 עד 6). יש הבדל של שני kDa בהגירת electrophoretic בין חלבוני הפריונים של HaCWD וד.י. TME (נתיבים 1-2). הבדל זה בהגירה נשמר בדגימות PMCA שנוצרה באמצעות homogenates TME dy (נתיבים 4 ו 6, בהתאמה) וHaCWD. תגובות PMCA seeded עם מוח שאינו נגוע (מדומה) homogenate להיכשל כדי להגביר PRP ^Sc (מסלול 8). המיקומים במשך 19 ו 21 kDa סמנים מולקולריים מצוינים לצד השמאל של הלוח.

Discussion

אתגרים של חלבוני פריונים זיהומיות הגברה הם תקופות ארוכות דגירה וההוצאות של בניסויי vivo. טכניקת PMCA היא אמצעי חסכוני לסוכנים להגביר את פריון זיהומיות. מספר מעבדות שאשרו את היכולת של PMCA במדויק כדי להגביר זני פריון במבחנה ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

מחלות פריונים יכולות להיות מועברת בין מינים. Bessen ומארש שחסנו את האוגרים ביעילות עם אנצפלופתיה מינק המסירה, שהפיקה שני זנים המופקים מאוגר פריונים שונים ^5. במחקר אלגנטי, הוכנס ועמיתים לעבודה המשמשת sPMCA כדי להגביר את לחץ העכבר המופק מהפריונים, RML, תוך שימוש בעכברים מהונדסים המבטאים cervid PRP ^C (TG (CerPrP) 1536 + / -) כמצע PMCA. התפרצות מהירה של מחלה נצפתה לאחר ההרכבה של Tg (CerPrP) 1536 + / - עם חומר PMCA ^{המותאם-12.} בדומה לכך, הקורט ואח'. הצליח להגבירמחלה כרונית מבזבז (CWD), מחלות פריונים בcervids, תוך שימוש בזנים שאינם cervid מצע PMCA ^15. נתונים אלה מראים כי מחסום מינים במחלות Prion אפשר לעקוף במבחנה באמצעות PMCA.

Bessen ומארש הראו כי הזן של האוגר קצר דגירת התקופה, ח.י. TME, יש הצטברות ^Sc PRP מהירה יותר בהשוואה למקבילו ארוך דגירת התקופה, ד.י. ^{3 TME, 5.} כמו כן, המתאם הזה בין תקופת הדגירה ושיעור ההצטברות נצפה לאחר PMCA במספר זנים המופקים מאוגר פריונים ^{1, 23, 24.}

שיעור ההגברה הוא מאפיין מהותי לכל זן. PMCA נעשה שימוש כדי לכמת שיעור הגברה זה. איירס et al. היו מסוגל לחשב מספר unitless, מקדם הגברת כינה, המייצג את הקצב להגברת לחץ האוגר נגזר פריון ניתן ^1.

פריוניםזנים יכולים להפריע זה לזה בעת שנכחו באותה השורה. הנוכחות של זן תקופת דגירה ארוכה יכולה להאריך את תקופת הדגירה או אפילו לחסום את היכולת של זן תקופת דגירה קצרה כדי לגרום למחלה. תוסף זה בתקופת דגירה שמכונה הפרעת מתח. הפרעת מתח הוכחה להתרחש בעכברים ובאוגרים ^{10 22.} רץ ועמיתים השתמשו PMCA ללמוד הפרעות מתח פריון באוגרים. התוצאות שלהם מראות כי ניסויי PMCA תואמים לממצאיו של ניסוי דומה ^{ב22 vivo, 23.}

מאז יש רמה נמוכה יחסית של PRP ^Sc מחוץ למערכת העצבים המרכזית, פריונים ניתן לאבחן במדויק רק לאחר המוות באמצעות נתיחה של המוח ואחרי אימונוהיסטוכימיה. PMCA יכול לשמש ככלי אבחונים, שכן הוא הראה יכולת נהדרת של הגברת כמויות זעירות של PRP ^{7 Sc,} גם מsampl השתן של האוגר¹¹ es.

סוכן הפריונים הוא מסוגל לעמוד בתנאים סביבתיים קשים ולהישאר מדבק ^16,17. עם זאת, הכמות של PRP ^Sc בסביבה קטנה מדי כדי להיות מזוהה באמצעות טכניקות קונבנציונליות WB כזה. PMCA נעשה שימוש כדי להגביר ולחשב את הסכום המשוער של PRP ^Sc הסביבה, כגון קרקע ומים ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4