Summary
Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.
Abstract
Prionen zijn infectieuze agentia die de onvermijdelijk fatale overdraagbare spongiforme encefalopathie (TSE) veroorzaken bij dieren en mensen 9,18. De prion eiwit heeft twee verschillende isovormen, niet-infectieuze gastheer gecodeerd eiwit (PrP C) en infectieus eiwit (PrP Sc), een abnormaal gevouwen isovorm van PrP C 8.
Een van de uitdagingen van het werken met prion middelen is de lange incubatietijd voorafgaand aan de ontwikkeling van klinische tekenen die volgden gastheer inoculatie 13. Dit traditioneel opdracht lange en dure dieren bioassay studies. Verder zijn de biochemische en biofysische eigenschappen van PrP Sc slecht vanwege hun bijzondere conformatie en aggregatietoestanden gekarakteriseerd.
PrP Sc kan zaad de omzetting van PrP C PrP Sc in vitro 14. PMCA een in vitro techniek die wordt Advantage van dit vermogen gebruik sonificatie en incubatie cycli om grote hoeveelheden PrP Sc produceren hogere snelheid, een systeem met overmaat PrP C en kleine hoeveelheden van het PrP Sc seed 19. Deze techniek heeft bewezen effectief te recapituleren de soort en stam specificiteit van PrP Sc omzetting van PrP C tot prionstam interferentie emuleren, en zeer lage niveaus van PrP Sc amplificeren van geïnfecteerde weefsels, vloeistoffen en milieumonsters 6,7,16, 23.
Dit document beschrijft de PMCA protocol, met inbegrip van aanbevelingen voor het minimaliseren van verontreiniging, het genereren van consistente resultaten, en kwantificeren van die resultaten. We bespreken ook verschillende PMCA toepassingen, inclusief productie en karakterisering van besmettelijke prion stammen prionstam interferentie en de detectie van prionen in het milieu.
Protocol
1. Voorbereiden van de Apparatuur
- Gebruik Misonix 3000 of 4000 Misonix sonicator (Farmingdale, NY) verbonden met een Thermo Electron Neslab EX-7 waterbad (Newington, NH) om een constante temperatuur te houden van 37 ° C. Sonificeer de monsters in 200 ul dunwandige buis PCR strips met gewelfd deksel verkregen Thermo Scientific (Waltham, MA).
- Een gloednieuwe sonicator vereist een "break-in"-periode van continue werking 9. Een twee maanden break-in periode bestaat uit een 40-sec sonificatie burst en 10 minuten incubatie cycli met de amplitude ingesteld op 10. Men moet opmerken erosie gehele oppervlak van de microplaat titanium hoorn (Figuur 1, panel B). Het circulerende water ziet er wit troebel als gevolg van erosie van de titanium microplaat hoorn. Dagelijks te vervangen dit water.
- De amplificatie van PrP Sc varieert gedurende de microplaat hoorn. De beste PrP Sc amplificatie-efficiëntie kan bekomen wordeneen straal van 5 cm van het midden van de microplaat hoorn (zie figuur 1, paneel C).
- Een ronde van PMCA bestaat 144 cycli. Elke cyclus bestaat uit 5 sec sonicatie en 10 min incubatie. Dit zal ongeveer inhouden tot 24 uur per ronde van PMCA.
- Het vermogen van sonicatie op het bedieningspaneel van de sonicator paneel, varieert met het aantal PCR-buizen in de sonificator rek en de temperatuur van het circulerende water uit het waterbad. Garanderen dat het water in evenwicht is bij 37 ° C en niet invullen meer dan 30% van de tube sonicator rack (Figuur 1, panel C). Spreid de PCR-buizen door de microplaat hoorn. Hebben ten minste een rij van lege ruimte tussen PCR-tube-strips en laat niet meer dan vier buizen aan elkaar per strip verbonden (figuur 1, paneel C).
- De kracht van sonificatie is cruciaal voor een succesvolle amplificatie prionstam. Terwijl sonicatie, stel de amplitude om een vermogen hebbenvariërend tussen 155 ~ 170 watt. In ons laboratorium het vermogen is ingesteld op zes en zeven voor de Misonix 3000 en Misonix 4000, respectievelijk.
- Gebruik gedestilleerd water in het waterbad om te voorkomen dat accumulatie van hard water vlekken. Vervang dit water per week. Tijdens de incubatie en sonicatie cycli, zal het water condenseren op de microplaat hoorn deksel. Om condensatie te voorkomen, voeg een klein aquarium warmte-pad naar de top van de behuizing van het sonificator doos zoals weergegeven in figuur 1, paneel A.
2. Voorbereiding van de monsters
- Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Creighton University Institutional Animal Care en gebruik Comite en voldoen aan de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Voordat een weefselverzameltoestel, moet het dier verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing met 5 mM EDTA bij pH 7,4 om bloed uit de hersenen en de remming van voorkomenPMCA reactie van het bloed 7. Snel verzamelen dierlijke weefsels met behulp van aseptische techniek en hebben speciale dissectie-instrumenten voor elke prionstam. Na dissectie het weefsel plaatsen in een 1,5 ml microcentrifugebuisje, flash bevriezen op droogijs en bewaard bij -80 ° C tot homogenisatie.
- De PMCA substraat (PrP C) oplossing te bereiden homogeniseer een geïnfecteerde hamster hersenen (UN BH) een 10% gewicht / volume (w / v) oplossing met ijskoude buffer conversie (zie deel 3) met een tissue Tenbroeck molen. Onder homogeniseren, wees voorzichtig dat u de lucht binnen in de molen om te voorkomen dat overmatige schuimvorming van de oplossing. Verduidelijken de oplossing door centrifugeren bij 500 xg gedurende 30 sec en de supernatant aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik.
- De PMCA zaad (PrP Sc) te bereiden, homogeniseer een infectueus materiaal (hersenen, milt, lymfeknopen, andere weefsels of vervuilde grond) om een 10% w / v oplossing met ijskoude water en aliquot de oplossing in 0,6 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik.
3. Voorbereiden Conversie Buffer
- Weeg 0,5093 g Triton X-100 in een 50 ml maatkolf (resultaat is een 1% eindconcentratie van Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland).
- Voeg een complete proteaseremmer Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland).
- Voeg 0,0931 g EDTA (dit zal resulteren in een 5 mM eindconcentratie van EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc Phillipsburg, NJ).
- Stel de pH op 7,4 met 1 N NaOH.
- Stel het volume op 50 ml met fosfaat gebufferde Dulbecco's fysiologische zoutoplossing (DPBS) (Mediatech Inc Manassas, VA).
- Filtreer de oplossing door een 0,45 um nitrocellulose membraan met een vacuümfiltratie inrichting. De omzetting buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende niet langer dan een maand.
4. Amplificatie van Prion stammen gebruik PMCA
- Verdun de PMCA zaad in de PMCA substraat in een verhouding van 1:20 (ie mix 5 ul van de PMCA zaad en 95 ul van de PMCA substraat) in een PCR buis. Verwijder en bewaar een 15 pi aliquot bij -80 ° C gedurende unsonicated controle; dit unsonicated controle wordt gebruikt om de PrP Sc amplificatie via proteinase K (PK) digestie gevolgd door Western blot (WB) analyse kwantificeren. Een extra unsonicated controle kan gegenereerd worden door een tweede 15 pi aliquot bij 37 ° C voor de duur van de PMCA reactie. Een minimum van drie herhalingen nodig is voor statistische doeleinden.
- Betreft de rest van het monster (70 ul) een ronde PMCA zoals afgebeeld op Figuur 1, Paneel A. Shake ze om 5 h water condensatie te vermijden op de gewelfde kap van de PCR buis.
- Het monster buizen moeten worden gecentrifugeerd en voorzichtig gevortext (let erop dat de oplossing niet ingaan op de koepelvormige kap) voor het openen na een procedure te waarborgen homogeniseringeneity en vermijd mogelijke besmetting.
- Voor seriële PMCA (sPMCA) korte incubatieperiode stammen (bijvoorbeeld HY TME, HaCWD of 263K), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:20 door overdracht 5 pl van het monster van gesonificeerde ronde in 95 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B).
- Voor sPMCA lange incubatietijd stammen (bijvoorbeeld DY TME, 139H, 22CH, 22AH of ME7H), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:1 door de overdracht 50 ul van het monster van gesonificeerde ronde in 50 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B).
- Verwijder twee 15 ul aliquots van de eerder verdunde sonicated mengsel (van stap 4.4 of 4.5) en een van hen opgeslagen bij -80 ° C en de andere bij 37 ° C (unsonicated besturingssystemen voor PMCA ronde). Onderwerpen de overblijfselen van een PMCA de tweede ronde.
- Deze procedure kan onbeperkt worden herhaald. In ons laboratorium hebben wehebben uitgevoerd tot vijftien PMCA rondes, met de stam eigenschappen ongewijzigd blijven.
- PK verteren de monsters. Voor een typische WB, mix 5 pi PK 80 ug / ml tot 5 pl monster (deze oplossing een uiteindelijke PK concentratie van 40 ug / ml zijn) en incubeer bij 37 ° C gedurende een uur. Voeg 10 ul van gel loading buffer. Kook deze oplossing gedurende 10 minuten. Laat de oplossing afkoelen en plaats 10 ul in de gel.
- Om het succes van amplificatie berekenen WB voeren van de PK-gedigereerd samples om de hoeveelheid geamplificeerd PrP Sc schatten door ze te vergelijken met hetzij de unsonicated controles 20,21 Figuur 2, Paneel C of in vaststaande PK-onverteerd recombinant PrP.
5. Het vermijden van Kruisbesmetting
Kritische stappen worden genomen om kruisbesmetting en het ontstaan van valse positieven door de novo vorming van protease resistente producten te minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) wordt gebruikt om PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24 amplificeren. Een succesvolle PrP Sc amplificatie wordt aangetoond door een verhoging in bandintensiteit op Western blots van de PK-resistente prioneiwit (migreren tussen 19 en 30 kDa voor hamster prion afgeleide stammen) zoals getoond in figuur 3. De toename van de band intensiteit na PMCA geeft amplificatie van het PK-resistente PrP Sc materiaal. Succesvolle amplificatie van de hamster afgeleide prion eiwit HaCWD en DY TME, wordt in de WB analyse van Figuur 3 door vergelijking van de band voordat intensiteiten (lanen 5 en 7) en na (banen 4 en 6) PMCA.
PK digestie van PrP Sc gevolgd door WB-analyse toont een bovenste, middelste en onderste band die overeenkomt met de di-, mono-en geglycosyleerde prion eiwit. Sommige prion-stammen kunnen worden onderscheiden door hun electrophoretic mobiliteit. Zo is er een twee-kDa verschil in migratie tussen de HaCWD en DY TME prion stammen. (Figuur 3, banen 1 en 2, respectievelijk).
Een high fidelity PrP Sc amplificatie wordt uitgevoerd door de PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24. Dit natuurgetrouwe PMCA amplificatie wordt waargenomen door eenzelfde elektroforetische migratie van de PMCA geamplificeerde prion stammen (HaCWD en DY TME) in vergelijking met hun overeenkomstige zaden (Figuur 3, banen 1 en 4 en 2 en 6 voor HaCWD en DY TME, respectievelijk).
Indien geen kruisbesmetting of de novo PrP Sc vorming optreedt, dient WB analyse van mock control PMCA monsters helder blijven na PK digestie (Figuur 3, lanen 8 en 9).
Figuur 1. Om condensatie van water te voorkomen, een regelmatige aquarium warmte-pad is geplaatst boven het deksel van de microplaat hoorn (paneel A). Een gloednieuwe sonicator moeten over een break-in periode van continue sonicatie gedurende ongeveer twee maanden. Paneel B toont de erosie op het titanium microplate hoorn na de inrijperiode. Panel C toont een mogelijke opstelling van PCR buizenstrips dat een optimale sonicatie van de monsters zou.
Figuur 2. Stroomschema PMCA (panel A), sPMCA (panel B), en WB-analyse (paneel C). PrP Sc is PMCA zaad en de geïnfecteerde hersenhomogenaat (UN BH) is PMCA substraat. De kwantificering van het geamplificeerde PrP Sc per PMCA ronde verkregen door de band intensiteit na PMCA door de bijbehorende bandintensiteit voor PMCA.
Figuur 3. Western blot van PK-verteerd HaCWD en DY TME hamster-afgeleide prion stammen. PrPSc wordt gedetecteerd met behulp van 3F4 anti-prionen antilichaam. Analyse van de WB blijkt dat een groot (blot intensiteit) en elektroforetische mobiliteit van PrP Sc. PMCA reacties werden geënt met hersenhomogenaat van hamsters geïnfecteerd met ofwel de HaCWD (lanen 4-5) of DY TME (lanen 6-7) middelen. Monsters die PMCA ondergaan (PMCA +) tonen een toename van de PrP Sc overvloed in vergelijking met hun niet-versterkte (PMCA -) controles (vergelijk lanen 5-4 en 7 en 6). Er is een twee-kDa verschil in elektroforetische migratie tussen prion eiwitten van HaCWD en DY TME (lanen 1-2). Dit verschil in migratie wordt gehandhaafd in de PMCA gegenereerde monsters met HaCWD en DY TME homogenaten (lanen 4 en 6, respectievelijk). PMCA reacties bezaaid met niet-geïnfecteerde hersenen (mock) homogenaat niet P versterkenrP Sc (laan 8). De locaties voor de 19 en 21 kDa moleculaire merkers zijn aangegeven aan de linkerkant van het paneel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uitdagingen van het amplificeren besmettelijke prion-eiwitten zijn de lange incubatietijd en de kosten van de in vivo experimenten. De PMCA techniek is een kosteneffectieve manier om besmettelijke prionen agenten te versterken. Verschillende laboratoria hebben het vermogen van PMCA nauwkeurig prion stammen amplificeren in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Prionziekten worden overgedragen tussen soorten. Bessen en Marsh effectief hebben geënt hamsters met overdraagbare encefalopathie van de nerts, die twee verschillende hamster-afgeleide prionen stammen 5 geproduceerd. In een elegant onderzoek vertellen en medewerkers gebruikt sPMCA de muis afgeleide prionstam, RML amplificeren, transgene muizen die hertachtige PrP C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) zoals PMCA substraat. Een snelle begin van de ziekte waargenomen na inoculatie van Tg (CerPrP) 1536 + / - de PMCA aangepaste materiaal 12. Ook Kurt et al.. Konden amplificerenChronic Wasting Disease (CWD), een prionziekte bij hertachtigen, met behulp van niet-soorten hertachtigen PMCA substraat 15. Deze gegevens suggereren dat soort barrière in prion ziekten kunnen worden veronachtzaamd in vitro zijn via PMCA.
Bessen en Marsh hebben aangetoond dat de hamster korte incubatietijd stam, HY TME, sneller PrP Sc accumulatie in vergelijking met de lange incubatietijd tegenhanger, DY TME 3, 5. Evenzo is deze correlatie tussen de incubatietijd en de accumulatie waargenomen na PMCA in verschillende hamster prion afgeleide stammen 1, 23, 24.
De versterkingsfactor is een eigenschap die inherent zijn aan elke stam. PMCA is gebruikt om deze versterkingsfactor kwantificeren. Ayers et al.. Konden een aantal zonder eenheid, genaamd amplificatie coëfficiënt, dat de mate van versterking voor een bepaald hamster afgeleide prionstam 1 vertegenwoordigt berekenen.
Prionstammen kunnen interfereren met elkaar wanneer aanwezig in dezelfde gastheer. De aanwezigheid van een lange incubatietijd stam kunt de incubatieperiode of blokkeren het vermogen van een korte incubatietijd stam om ziekte te veroorzaken. Deze uitbreiding in incubatie-periode wordt genoemd stam interferentie. Strain interferentie is aangetoond dat het plaatsvindt in muizen en hamsters 10 22. Bartz en collega's hebben gebruikt PMCA om prionstam interferentie te bestuderen bij hamsters. De resultaten blijkt dat de PMCA experimenten correleren met de resultaten van een soortgelijk experiment in vivo 22, 23.
Aangezien er een relatief laag niveau van PrP Sc buiten het centrale zenuwstelsel, prionen alleen nauwkeurig worden post-mortem diagnose via dissectie van de hersenen gevolgd door immunohistochemie. PMCA kan worden gebruikt als diagnostisch middel, aangezien is gebleken dat een grote capaciteit voor het amplificeren van kleine hoeveelheden PrP Sc 7, zelfs urine hamster samples 11.
Het prion vertegenwoordiger zijn barre omstandigheden te weerstaan en besmettelijke blijven 16,17. De hoeveelheid PrP Sc in het milieu te klein worden gedetecteerd met behulp van conventionele technieken zoals WB. PMCA is gebruikt voor het amplificeren en bereken de schatting van PrP Sc het milieu, zoals de bodem en water 16, 17, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr Vesper Fe Marie Ramos bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 en G20RR024001) en het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (2R01 NS052609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C.
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C.
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C.
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
