Summary
タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin vitroアッセイである。また、プリオン検出アッセイとして使用することができます。
Abstract
プリオンは、動物とヒト9,18で必然的に致命的な伝達性 海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性病原体である。プリオンタンパク質は、2つの異なるアイソフォームは、非感染性宿主でエンコードされたタンパク質（PrP C）および感染質（PrP Sc）は、PrP Cの8の異常に折り畳まれたアイソフォームを持っています。
プリオン剤での作業の課題の1つは、ホスト13接種後の臨床徴候の開発の前に長い潜伏期間があります。これは、伝統的に長く、高価な動物のバイオアッセイ研究を命じた。さらに、PrP Scの生化学的および生物物理学的特性はあまり彼らの異常なコンフォメーションと凝集状態に起因する特徴がある。
PrP Sc は 試験管 14 内 の PrP ScへのPrP Cの種子変換することができます。 PMCAはアドバを取るのin vitro手法ですのPrP CとPrP Scの種子19微量の過剰な量を含んでいるシステムから、加速度的に、PrP Scのを大量に生成するために超音波処理およびインキュベーションサイクルを使用してこの能力のntage。この手法は、効果的にプリオン株の干渉をエミュレートするためには、PrP CからPrP Scの変換の種および株特異性を再現するために、感染した組織、体液、および環境試料6,7,16からPrP Scの非常に低いレベルを増幅することが証明されています23。
一貫性のある結果を生成し、それらの結果を定量化、汚染を最小限にするための提言を含め、本稿では詳細PMCAプロトコルを、。我々はまた、感染性プリオン株、プリオン株の干渉、及び環境中のプリオンの検出の発生と特性化など、いくつかのPMCAアプリケーションを、議論する。
Protocol
1。機器の準備
- Misonix 3000または37の温度を一定に保つためにサーモエレクトロンNeslab EX-7水槽（ニューイントン、ニューハンプシャー州）に接続Misonix 4000ソニケーター（ファーミングデール、ニューヨーク州）℃を使用するサーモサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手したドーム型のキャップ付き200μlの薄壁PCRチューブストリップのサンプルを超音波洗浄します。
- 真新しいソニケーターは連続運転9の"慣らし"期間を必要とします。 2ヶ月のブレークイン期間は10に設定されて振幅レベルを持つ40秒の超音波処理バーストと10分インキュベーションサイクルで構成されています。一つはチタンプレートホーン（ 図1、パネルB）の表面全体に浸食を確認する必要があります。循環水は、チタンマイクロホーンの浸食による白濁を見ていきます。毎日この水を交換してください。
- PrP Scの増幅は、マイクロプレートホーンを通して変化します。最高のPrP Scの増幅効率が内に取得することができるマイクロホーンの中心から5cmの半径（ 図1、パネルCを参照してください）。
- PMCAの一周は144サイクルで構成されています。各サイクルは、5秒の超音波処理し、10分間のインキュベーションで構成されています。これは大体PMCAのラウンドごとに24時間に負わせるでしょう。
- 超音波破砕機のコントロールパネルに表示されて超音波処理の電力出力は、超音波破砕機のラックと水浴から循環水の温度に存在するPCRチューブの数によって異なります。水は37℃で平衡化されていることを確認し、超音波処理装置のチューブラック（ 図1、パネルC）の30％以上を記入しない。マイクロプレートホーンを通してPCRチューブを広げた。 PCRチューブストリップ間の空の空間の少なくとも1つの行を持っている（ 図1、パネルC）ストリップあたり一緒に接続されていない4つ以上のチューブを許す。
- 超音波処理の強度は、成功したプリオン株の増幅のために重要です。超音波処理しながら、パワー出力を持つように振幅を調整155〜170ワットの間の範囲。私たちの研究室では、電力レベルは、それぞれMisonix 3000およびMisonix 4000の6と7に設定されています。
- 硬水の汚れを蓄積しないように水浴中で蒸留水を使用します。毎週この水を交換してください。インキュベーションおよび超音波処理サイクル中に、凝縮水は、マイクロプレートホーンのふたの内側に発生します。 図1に示すように、結露を避けるために、パネルA、超音波破砕機の筐体ボックスの上部に小さな水槽の熱·アタッチ·パッド
2。サンプルの準備
- 動物を含むすべての手順は、クレイトン大学施設内動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠した。任意の組織採取する前に、動物を麻酔とtranscardially氷冷リン酸を用いて灌流しなければなりませんが、脳から血液を除去するとの阻害を回避するために、pH7.4の5mMのEDTAとの緩衝生理食塩水血液7によるPMCA反応。無菌技術を用いて急速に動物組織を採取し、それぞれのプリオン株のための専用の解剖ツールを持っている。切開した後、1.5 mlのマイクロチューブに組織を置き、フラッシュがドライアイスの上に凍結し、-80℃で保管して℃を均質化するまで。
- PMCA基板（PrP Cの ）溶液を調製し、Tenbroeck組織グラインダーを用いて氷冷変換バッファで10％重量/体積（w / v）溶液（パート3を参照）に感染ハムスター脳（国連BH）ホモジナイズする。ホモジナイズしながら、溶液の過剰な泡立ちを避けるために、グラインダーの内側に空気を入れないように注意してください。 30秒、アリコートを1.5ml微量遠心チューブの上清を500×gで遠心分離することによって解決策を明らかにする。 -80℃で保存さらなる使用まで。
- PMCAシード（PrP Scの）溶液を調製し、氷冷ウォートを10％（w / v）の溶液中に感染性物質（脳、脾臓、リンパ節、他の組織または汚染された土壌）をホモジナイズrとアリコート0.6ミリリットルマイクロチューブ内の溶液。 -80℃で保存さらなる使用まで。
3。変換バッファの準備
- 50mlのメスフラスコ（結果はトリトンX-100の1％の最終濃度である）（;シュタインハイム、ドイツのSigma-Aldrich社）でのTriton X-100の0.5093グラムの重量を量る。
- 1コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット（;マンハイム、ドイツロシュ·ダイアグノスティックス社）を追加します。
- EDTAの0.0931グラム（これはEDTAの5mMの最終濃度になります）（;フィリップスバーグ、ニュージャージー州マリンクロット·ベイカー社）を追加します。
- 1N NaOHでpHを7.4に調整してください。
- ダルベッコのリン酸50mlに音量を調節するには（;マナッサスメディアテック株式会社）（DPBS）緩衝生理食塩水。
- 真空ろ過装置と0.45μmのニトロセルロース膜を通して溶液をフィルタリングします。変換バッファが一箇月以内に4℃で保存することができます。
4。 PMCAを使用したプリオン株の増幅
- PCRチューブに1:20の比率（ すなわちミックス PMCAシードの5μlとPMCA基板の95μl）をPMCAで基板にPMCAシードを希釈します。 -80℃で15μlのアリコート°unsonicated制御のためのCを削除して保存すること。このunsonicatedコントロールはウエスタンブロット（WB）の分析に続いてプロテイナーゼK（PK）消化によりPrP Scの増幅を定量化するために使用されます。追加unsonicated制御はPMCA反応の持続時間のために37℃で第二15μlのアリコートを配置することによって生成することができます。 3回繰り返しの最小値は統計上の目的のために必要です。
- 主題図1に示すように、PMCAの1ラウンドにサンプルの残り（70μl）を、パネルA.シェイクチューブPCRチューブのドーム型キャップの結露を避けるために、すべての5時間。
- サンプルのチューブがhomog確保するために、任意の手順の後に開く前に（溶液はドーム形キャップに行っていないことに注意して）スピンダウンし、軽くボルテックスして下さいeneityと潜在的な汚染を避ける。
- 短い潜伏期間株（ すなわち 、HY、TME、HaCWD、または263K）のシリアルPMCA（sPMCA）では、新鮮な未感染の95μLにラウンド1からの超音波処理したサンプルの5μlを転送することにより、1:20の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。
- 潜伏期間が長い株（ すなわち DY TME、139H、22CH、22AH、またはME7H）のsPMCAについては、感染していない新鮮な50μlのにラウンド1からの超音波処理したサンプル50μlを転送することにより、1:1の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。
- 以前に希釈混合超音波処理（ステップ4.4または4.5）から215μlのアリコートを取り出して、-80℃で、それらのいずれかを格納し、37℃と他の℃（PMCAラウンド2用unsonicated制御ソリューション）。 PMCAラウンド2への残党を施す。
- この手順は、無限に繰り返すことができます。私たちの研究室では、我々ひずみ特性は変わらずで、PMCA 15ラウンドまで行ってきた。
- PKはサンプルを消化。典型的なWBのために、サンプルを5μl（この溶液は、40μg/ mlの最終濃度のPKを持つことになります）にPKを80μg/ mlの5μlを混合し、37℃で1時間インキュベートする。ゲルローディング緩衝液10μlを追加します。 10分間この溶液を沸騰。解決策は冷えるとゲルに10μlをロードしましょう。
- 増幅の成功を計算するには、どちらかにそれらを比較することによって増幅されたPrP Scの量を推定するために、PK-消化サンプル、unsonicatedコントロール20,21 図2、パネルCまたは組換えPK-消化されていない既知の量に上のWB分析を実行プリオン。
5。クロスコンタミネーションの回避
重要なステップは、クロスコンタミネーション及びプロテアーゼ耐性製品の de novo形成に起因する偽陽性の発生を最小限に抑えるように注意する必要があります。
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Representative Results
タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はin vitroで 7 におけるPrP Scは、12、14、19、24を増幅するために使用されます。 図3に示すように、成功したPrP Scの増幅が PK耐性プリオンタンパク質（ハムスター由来のプリオン株の19および30kDaの間の移行）のウエスタンブロットのバンド強度の増加によって示されている。後のバンド強度の増加PMCAはPK耐性PrP Scの物質の増幅を示しています。ハムスター由来のプリオンタンパク質、HaCWDとDY TMEの成功は、PMCA増幅前（レーン5および7）、（レーン4,6）後のバンド強度を比較することにより、 図3のWB分析に示されている。
PrP ScのPK消化は、それぞれジ、モノ、および非グリコシル化型プリオン蛋白質に対応する、アッパーミドルと下のバンドを示したWB分析が続く。いくつかのプリオン株は、そのエレメントによって区別することができますctrophoreticモビリティ。例えば、HaCWDとDYのTMEプリオン株の間の移行で2-kDaの違いがあります。 （それぞれ図3、レーン1および2）。
高忠実度の PrP Sc の増幅はPMCA 1、7、12、19、23、24によって達成される。 HaCWDとDY TMEのレーン1＆4と2＆6; PMCA増幅におけるこの高忠実度は、それらに対応する種子（ 図3に比べPMCA増幅されたプリオン株（HaCWDとDY TME）の類似した電気泳動によって観察されるそれぞれ）。
交差汚染またはde novoの PrP Scの形成が発生しなかった場合、モックコントロールPMCAサンプルのWB解析はPK消化（ 図3、レーン8,9）後に透明のままです。
図1。結露を防ぐには、定期的な水槽の熱パッド、マイクロプレートホーン（パネルA）の蓋の上に配置されています。真新しいソニケーターは約2ヶ月間連続超音波処理のブレークイン期間を許可する必要があります。パネルBは、ブレークイン期間後のチタンマイクロホーンの侵食を示しています。パネルCは、サンプルの最適な超音波処理を可能にするPCRチューブストリップの可能な配置を示しています。
図2：PMCA（パネルA）、sPMCA（パネルB）、WBの分析（パネルC）のフローチャート。 PrP Sc は、PMCAの種であり、感染していない脳ホモジネート（国連BHは）PMCA基板である。各ラウンドのPMCA増幅PrP Scの定量は、PMCAの前に、それに対応するバンド強度によってPMCA後にバンド強度を割ることによって得られる。
図3：PK -消化HaCWDとDY TMEハムスター由来のプリオン株のウエスタンブロット。 PrP Scのは 3F4抗プリオン抗体を用いて検出される。 WBの分析が豊富（ブロット強度）とPrP Scの電気泳動移動度を示しています。 PMCA反応はHaCWD（レーン4-5）またはDY TME（レーン6-7）エージェントのいずれかに感染したハムスターから脳ホモジネートを接種した。コントロール（〜6レーン5から4と7を比較） - （PMCA +）PMCAを施行したサンプルは、それらの非増幅（PMCA）に比べ、PrP Scの存在量の増加を示す。 HaCWDとDY TME（レーン1-2）のプリオンタンパク質の間に電気泳動で2-kDaの違いがあります。マイグレーションにおけるこの差はHaCWDとDYのTMEホモジェネート（レーンそれぞれ4と6）を用いて、PMCA生成されたサンプルで維持されます。感染していない脳（モック）ホモジネートを播種したPMCA反応はPを増幅するために失敗するRP SC（レーン8）。分子マーカー19と21 kDaのための場所は、パネルの左側に表示されます。
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Discussion
感染性プリオンタンパク質を増幅するという課題は、長い潜伏期間および in vivo実験での経費です。 PMCA技術は感染性プリオンエージェントを増幅するための費用効果的な手段です。いくつかの研究室では、正確に試験管 7、9、12、14、19,24 のプリオン株を増幅するPMCAの能力を確認しています。
プリオン病は、種間で送信することができます。 Bessenとマーシュは効果的に二つの異なるハムスター由来のプリオン株5を生産伝染性ミンク脳症、とハムスターに接種した。エレガントな研究では、シカ科のPrP Cが点（Tg（CerPrP）1536 + / - ）を発現するトランスジェニックマウスを使用して、RML、占いや同僚マウス由来のプリオン株を増幅するsPMCAを使用PMCA基板としての。疾患の迅速な開始は、Tgの接種（CerPrP）後に観察された1536 + / - PMCA適応材料12と。同様に、クルトらが増幅することができた非シカ科の種PMCA基板15を用いた慢性消耗病（CWD）cervidsのプリオン病、。これらのデータは、プリオン病における種の壁がPMCAを経由して、in vitroでバイパスすることができることを示唆している。
Bessenとマーシュは、その長い潜伏期間の対応、DY TME 3、5と比較すると、ハムスターの短い潜伏期間のひずみ、HY、TMEは、迅速PrP Scの蓄積を持っていることが示されている。同様に、この潜伏期間の間の相関関係と蓄積率は、いくつかのハムスター由来のプリオン株1、23、24にPMCA後に観察される。
増幅率は、各株に固有のプロパティです。 PMCAは、この増幅率を定量化するために使用されています。エアーズらは与えられたハムスター由来のプリオン株1の増幅率を表す単位のない数字と呼ばれる増幅係数を計算することができました。
プリオン同じホストに存在する場合、株はお互いに干渉することがあります。長い潜伏期間菌株の存在は潜伏期間を延長したり、疾患を引き起こす短い潜伏期間の株の能力をブロックすることができます。潜伏期間中のこの拡張は、ひずみ干渉と呼ばれます。ひずみ干渉がマウス10およびハムスター22で発生することが示されている。バーツと共同研究者らは、ハムスターのプリオン株の干渉を研究するPMCAを使用している。その結果は、PMCA実験は in vivo 22,23 で同様の実験で得られた知見と相関することを示している。
中枢神経系外のPrP Scの比較的低いレベルがあるので、プリオンが唯一正確に免疫組織化学に続く脳の解剖を介して、事後診断を行うことができる。それはPrP Scの7の微量を増幅するの偉大な能力を示してきたので、PMCAさえハムスターの尿samplから、診断ツールとして使用することができますES 11。
プリオンエージェントは、過酷な環境条件に耐え、16,17感染性を保つことができる。しかし、環境中のPrP Scの量は、WB、このような従来の技術を用いて検出するには小さすぎる。 PMCAは、土壌と水16、17、20、21のように、環境をPrP Scのおおよその量を増幅し、計算するために使用されています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、原稿の批判的な読みのために博士はヴェスパーのFeマリーラモスに感謝したいと思います。この作業は、研究資源のためのナショナルセンター（P20 RR0115635-6、C06 RR17417-01とG20RR024001）と国立神経疾患研究所およびストローク（2R01 NS052609）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
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