Protein misfoldning Cyklisk Amplifikation af Prioner

Summary

Protein misfoldning cyklisk amplifikation (PMCA) er et in vitro assay til undersøgelse af prion konvertering og stamme og artsbarrierer. Den kan også anvendes som et prion påvisningsassay.

Abstract

Prioner er infektiøse stoffer, der medfører uundgåeligt fatal transmissible spongiforme encephalopatier (TSE) hos dyr og mennesker ^9,18. Prionproteinet har to forskellige isoformer, de ikke-infektiøse host-kodede protein (PrP ^C) og smitsomt protein (PrP ^Sc), et unormalt-foldet isoform af PrP ^{C 8.}

En af udfordringerne ved at arbejde med prion midler er den lange inkubationstid før udviklingen af kliniske symptomer efter vært podning ^13. Dette traditionelt pålagt lange og dyre dyr bioassay undersøgelser. Endvidere er de biokemiske og biofysiske egenskaber af ^PrPsc dårligt karakteriseret på grund af deres usædvanlige konformation og aggregering tilstande.

^PrPsc kan frø omdannelsen af PrP ^C til PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA er en in vitro-teknik, der tager advantage af denne evne ved hjælp af sonikering og inkubering cyklusser for at producere store mængder af PrP ^Sc, med en accelereret hastighed, fra et system indeholdende overskydende mængder af ^PrP ° og små mængder af PrP ^Sc frø ^19. Denne teknik har vist sig effektivt at rekapitulere arten og stammen specificiteten af ^PrPsc konvertering fra PrP ^C, for at emulere prion stamme indgreb, og til amplifikation af meget lave niveauer af PrP ^Sc fra inficerede væv, væsker, og miljøprøver ^{6,7,16, 23.}

Dette papir beskriver den PMCA protokol, herunder anbefalinger til minimering af forurening, genererer ensartede resultater, og kvantificere disse resultater. Vi diskuterer også adskillige PMCA applikationer, herunder generering og karakterisering af smittebærere prion stammer, prion stamme indgreb og påvisning af prioner i miljøet.

Protocol

1. Klargøring af udstyr

1. Brug en Misonix 3000 eller Misonix 4000 sonikator (Farmingdale, NY) forbundet med en Thermo Electron Neslab EX-7 vandbad (Newington, NH) for at holde en konstant temperatur på 37 ° C. Soniker prøverne i 200 ul tyndvæggede PCR-rør strips med hvælvede låg opnået fra Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. En helt ny sonikator kræver et "break-in" periode med kontinuerlig drift ^9. En to-måneders pause-periode består af en 40-sec sonication burst og 10-minutters inkubation cykler med amplituden niveau sat til 10. Man bør bemærke erosion hele overfladen af titan mikroplade horn (fig. 1, panel B). Det cirkulerende vand vil se hvid uklar på grund af erosion af titanium mikroplade horn. Erstat dette vand dagligt.
3. Amplifikationen af PrP ^Sc vil variere i hele mikroplade horn. Den bedste ^PrPsc amplifikationseffektivitet kan opnås indenen radius på 5 cm fra midten af mikroplade horn (se figur 1, panel C).
4. En runde PMCA består 144 cyklusser. Hver cyklus består af 5 sek lydbehandling og 10 minutters inkubation. Dette vil groft medføre til 24 timer pr runde af PMCA.
5. Udgangseffekten af ​​sonikering, vises på sonikator betjeningspanel, varierer med antallet af PCR-rør til stede i sonikatoren s rack og temperaturen af ​​det cirkulerende vand fra vandbadet. Sikre, at vandet bringes i ligevægt ved 37 ° C, og som ikke fylder mere end 30% af sonikatoren er røret rack (figur 1, panel C). Spred PCR-rørene gennem mikroplade horn. Har mindst en række af tomme rum mellem PCR-rør strimler og giver ikke mere end fire rør forbundet sammen pr strimlen (figur 1, panel C).
6. Styrken af ​​lydbehandling er kritisk for en vellykket prion stamme amplifikation. Mens sonikering, justere amplituden for at have en effektpå mellem 155 ~ 170 watt. I vores laboratorium strømmen er sat til seks og syv for Misonix 3000 og Misonix 4000, hhv.
7. Brug destilleret vand i vandbad for at undgå at akkumulere hårdt vand pletter. Erstat dette vand om ugen. Under inkubation og lydbehandling cyklusser, vil vand kondensvand inden mikroplade horn låg. For at undgå kondensdannelse, vedhæfte et lille akvarium varmepude til toppen af sonikatoren s kabinet som vist i Figur 1, felt A.

2. Forberedelse af prøver

1. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Creighton University Institutional Animal Care og brug Udvalg og overholde vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Før helst væv samling, skal dyret være bedøvet, og transcardialt perfunderet med iskold phosphatpufret saltopløsning med 5 mM EDTA ved pH 7,4 for at fjerne blod fra hjernen og undgå inhibering afPMCA reaktion med blod ^7. Saml dyrevæv hurtigt ved hjælp af aseptisk teknik og har dedikerede Dissektionsværktøj for hver prion stamme. Efter dissektion, vævet placeres i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, flash fryse den på tøris og opbevares ved -80 ° C indtil homogenisering.
2. Til fremstilling af PMCA substratet (PrP ^C) opløsning, homogenisere en ikke-inficeret hamster brain (UN BH) til en 10% vægt / volumen (w / v) opløsning med iskold omdannelse puffer (se del 3) under anvendelse af en Tenbroeck vævsformaler. Mens homogenisering, skal du passe på ikke at få luft ind i vinkelsliberen til at undgå overdreven skumning af opløsningen. Tydeliggøre opløsningen ved centrifugering ved 500 x g i 30 sek, og aliquot af supernatant i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
3. Til fremstilling af PMCA frø (PrP ^Sc) opløsning, homogenisere et infektiøst materiale (hjerne, milt, lymfeknuder, andre væv eller forurenet jord) til en 10% vægt / vol opløsning med iskold water og aliquot af opløsningen i 0,6 ml mikrocentrifugerør. Opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

3. Forberedelse Conversion Buffer

1. Afvej 0,5093 g Triton X-100 i en 50 ml målekolbe (Resultatet er en 1% slutkoncentration af Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Tyskland).
2. Tilsæt en Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland).
3. Tilsættes 0,0931 g EDTA (dette vil resultere i en 5 mM slutkoncentration på EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ).
4. PH justeres til 7,4 med 1N NaOH.
5. Justere volumen til 50 ml med Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA).
6. Opløsningen filtreres gennem et 0,45 um nitrocellulosemembran med en vakuumfiltrering apparat. Omdannelsen puffer kan opbevares ved 4 ° C i højst en måned.

4. Amplifikation af Prion stammer under anvendelse PMCA

1. Fortynd PMCA såsæd i PMCA substrat i et forhold på 1:20 (dvs. mix 5 pi af PMCA frø og 95 ul af PMCA substrat) i et PCR-rør. Fjerne og lagre en 15 pi alikvot ved -80 ° C i unsonicated kontrol, hvilket unsonicated kontrol vil blive anvendt til at kvantificere ^PrPsc amplifikation via proteinase K (PK) spaltning efterfulgt af Western blot (WB) analyse. En yderligere unsonicated kontrol kunne genereres ved at anbringe en anden 15 pi alikvot ved 37 ° C under hele den PMCA reaktionen. Mindst tre gentagelser kræves til statistiske formål.
2. Om den resterende del af prøven (70 ul) til en runde PMCA som afbildet på figur 1, panel A. rysterør hver 5 hr at undgå vandkondensation på den kuppelformede hætte af PCR-rør.
3. Prøvens rør bør centrifugeres ned og forsigtigt hvirvelbehandlet (være omhyggelig, at løsningen ikke gå ind i den hvælvede cap) før åbning efter enhver procedure for at sikre homogeneity og undgå potentiel forurening.
4. For serielle PMCA (sPMCA) af kort inkubationstid stammer (dvs. HY TME, HaCWD eller 263K), fortyndes den sonikerede materiale i et forhold på 1:20 ved at overføre 5 ul af den lydbehandlede prøve fra runde i 95 pi af frisk uinficerede hjernehomogenat (figur 2, panel B).
5. For sPMCA af lange inkubationstid stammer (dvs. DY TME, 139H, 22CH, 22AH eller ME7H), fortyndes den sonikerede materiale til et forhold på 1:1 ved at overføre 50 pi af den lydbehandlede prøve fra runde i 50 pi af frisk uinficerede hjernehomogenat (figur 2, panel B).
6. Fjern to 15 gl portioner fra den tidligere fortyndet sonikerede blanding (fra trin 4,4 eller 4,5) og gemme en af ​​dem ved -80 ° C og den anden ved 37 ° C (unsonicated styringsløsninger til PMCA runde to). Emne resterne til en PMCA runde to.
7. Denne procedure kan gentages i det uendelige. I vores laboratorium har vihave udført op til femten PMCA runder, med strain egenskaber forbliver uændrede.
8. PK fordøje prøverne. Til en typisk WB, bland 5 ul af PK 80 ug / ml til 5 ul prøve (denne løsning vil have en endelig PK koncentration på 40 ug / ml) og inkuber ved 37 ° C i en time. Der tilsættes 10 pi gel loading buffer. Koge denne opløsning i 10 minutter. Lad opløsningen afkøle og indlæse 10 pi i gelen.
9. For at beregne succes forstærkning udføre en WB analyse af de PK-fordøjede prøver at vurdere mængden af amplificeret PrP ^Sc ved at sammenligne dem til enten de unsonicated kontroller ^20,21 figur 2, Panel C eller til kendte beløb i PK-ufordøjet rekombinant PrP.

5. Undgå Krydskontaminering

Kritiske trin må tages for at minimere krydskontaminering og forekomsten af falske positive som følge af de novo dannelse af protease-resistente produkter.

Brug en dedikeret sæt Dissektionsværktøj (dvs. pincet, pincetter, sakse) for prøvetagning for hver prion stamme.

Inden homogenisering inficerede hjerner, der skal bruges som et PMCA substrat, tørre pipetter med 1% blegemiddel. Soak sonikator PCR-rør rack, væv homogenizers, og PCR-rør lagerreoler med 1% blegemiddel i 10 minutter og skyl grundigt med destilleret vand.

Dæk arbejdsområdet med en frisk Versi-Dry Lab Soaker hver gang en ny prøve skal homogeniseres, en ny PMCA eksperiment er at være forberedt, eller når udportionering mellem sPMCA runder.

Brug nye handsker hver gang nye prøver håndteres (især ved overførsel af portioner mellem sPMCA runder).

Benytte korte sonikering bursts for hver PMCA cyklus. Cycles of 5 sec lydbehandling kombineret med 10 minutters inkubering er tilstrækkeligt til at amplificere prioner uden at generere de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Som andre laboratorier har vist, at øgesonication tid, hvilket øger sonication amplitude, og udvide antallet af PMCA cyklusser øger sandsynligheden for de novo ^{PrPsc-dannelse 2.}

Representative Results

Protein misfoldning cyklisk amplifikation (PMCA) anvendes til at amplificere PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} En vellykket ^PrPsc amplifikation er vist med en stigning i båndintensitet på Western blots af PK-resistent prionprotein (migrerer mellem 19 og 30 kDa for hamster-afledte prion-stammer) som vist i fig. 3. Stigningen i sin båndintensitet efter PMCA indikerer amplificering af PK-resistent ^PrPsc materiale. Vellykkede amplifikation af hamster-afledte prionprotein, HaCWD og DY TME, er vist i WB analyser af figur 3 ved at sammenligne båndintensiteter før (bane 5 og 7) og efter (bane 4 og 6) PMCA.

PK-fordøjelse af PrP ^Sc efterfulgt af WB analyse viser en øvre, midterste og nederste bånd svarer til di-, mono-og uglycosylerede prion protein. Nogle prion stammer kan differentieres efter deres electrophoretic mobilitet. For eksempel er der en to-kDa forskel i migration mellem HaCWD og dy TME prion-stammer. (Figur 3, bane 1 og 2, henholdsvis).

Et hi-fi ^PrPsc amplifikation opnås ved PMCA ^{1, 7, 12, 19, 23, 24.} Denne high fidelity i PMCA amplifikation observeres ved en lignende elektroforetisk migration af PMCA-amplificerede prion stammer (HaCWD og DY TME) i sammenligning med deres tilsvarende frø (figur 3, bane 1 og 4 samt 2 og 6 for HaCWD og DY TME, henholdsvis).

Hvis der ikke krydskontaminering eller de novo ^{PrPsc-dannelse} opstår, skal WB analyse af mock kontrol PMCA prøver forblive klar efter PK fordøjelse (figur 3, bane 8 og 9).

Figur 1. For at undgå vandkondensation, en regelmæssig akvarium varme-pude er placeret over låget på mikropladen horn (panel A). En helt ny sonikator bør have en break-in periode med kontinuerlig lydbehandling i omkring to måneder. Panel B viser erosion på titanium mikropladen horn efter indbruddet i perioden. Panel C viser et muligt arrangement af PCR rørstrips der ville muliggøre en optimal ultralydsbehandling af prøverne.

Figur 2. Rutediagram for PMCA (panel A), sPMCA (panel B), og WB-analyse (panel C). PrP ^Sc er PMCA frø og den ikke-inficerede hjernehomogenat (UN BH) er PMCA substratet. Kvantificeringen af det amplificerede PrP ^Sc for hver PMCA runde opnås ved at dividere båndintensitet efter PMCA af dets korresponderende båndintensitet før PMCA.

ys ">
Figur 3. Western blot af PK-fordøjet HaCWD og dy TME hamster-afledte prion-stammer. PrP ^Sc påvises ved anvendelse af 3F4 anti-prion-antistof. Analyse af WB viser overflod (blot-intensitet) og elektroforetisk mobilitet af PrP ^Sc. PMCA reaktioner blev podet med hjernehomogenat fra hamstere inficeret med enten HaCWD (bane 4-5) eller DY TME (bane 6-7) midler. Prøver, der undergik PMCA (PMCA +) viser en stigning i ^PrPsc overflod i forhold til deres ikke-amplificeret (PMCA -) kontrol (sammenlign bane 5-4 og 7-6). Der er en to-kDa forskel i elektroforetisk migration mellem prionproteiner i HaCWD og DY TME (bane 1-2). Denne forskel i migration opretholdes i PMCA-genererede prøver ved anvendelse HaCWD og dy TME homogenater (bane 4 og 6, henholdsvis). PMCA reaktioner podet med ikke-inficeret hjerne (mock) homogenat ikke amplificere PrP ^Sc (bane 8). Placeringen af ​​de 19 og 21 kDa molekylære markører er angivet til venstre på panelet.

Discussion

Udfordringer for uddybende smitsomme prionproteiner er de lange inkubationstid og udgifter i in vivo forsøg. Det PMCA teknik er en omkostningseffektiv måde at amplificere smitsomme prion agenter. Adskillige laboratorier har bekræftet evne PMCA til præcist at amplificere prion-stammer in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Prionsygdomme kan overføres mellem arter. Bessen og Marsh har faktisk inokuleret hamstere med transmissibel minkencephalopati, der producerede to forskellige hamster-afledte prion stammer ^5. I et elegant studie, Telling og kolleger brugte sPMCA til at opformere muse-afledte prion stamme, RML, ved hjælp af transgene mus, der udtrykker hjortedyr PrP ^C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) som PMCA substrat. En hurtig indtræden af sygdom blev observeret efter inokulation af Tg (CerPrP) 1536 + / - med PMCA-tilpassede materiale ^12. Tilsvarende var Kurt et al. Stand til at amplificerechronic wasting disease (CWD), en prion disease hos hjortedyr, anvendelse af ikke-Hjortearter PMCA substrat ^15. Disse data antyder, at artsbarriere i prionsygdomme kan omgås in vitro via PMCA.

Bessen og Marsh har vist, at hamsters kort inkubationstid stamme, HY TME, har en hurtigere ^{PrPsc-akkumulering} i sammenligning med den lange inkubationstid modstykke, DY TME ^{3, 5.} Tilsvarende er denne korrelation mellem inkubationstiden og akkumuleringen, der iagttages efter PMCA i flere hamster-afledte prion-stammer ^{1, 23, 24.}

Den forstærkning sats er en egenskab iboende til hver stamme. PMCA er blevet anvendt til at kvantificere denne amplifikation rate. Ayers et al. Var i stand til at beregne en unitless nummer, betegnet amplifikation koefficient, der repræsenterer hastigheden for amplifikation for en given hamster-derived prion stamme ^1.

Prionstammer kan forstyrre hinanden, når de findes i den samme vært. Tilstedeværelsen af ​​en lang inkubationstid stamme kan forlænge inkubationsperioden eller endog blokere evnen for en kort inkubationstid stamme til at forårsage sygdom. Denne udvidelse i inkubationstiden kaldes stamme interferens. Stamme interferens har vist sig at forekomme hos mus ¹⁰ og hamstere ^22. Bartz og kolleger har brugt PMCA at studere prion stamme indblanding i hamstere. Deres resultater viser, at PMCA eksperimenter korrelerer med resultaterne af et lignende forsøg in vivo ^{22, 23.}

Eftersom der er et relativt lavt niveau af PrP ^Sc uden for det centrale nervesystem, kan prioner kun præcist diagnosticeret post mortem via dissektion af hjernen efterfulgt af immunohistokemi. PMCA kan anvendes som diagnostisk værktøj, eftersom det har vist en stor evne til at amplificere meget små mængder af PrP ^{Sc 7,} selv fra hamster urin samples ^11.

Prion agent er i stand til at modstå barske miljøforhold og forblive infektiøs ^16,17. Imidlertid er mængden af PrP ^Sc i miljøet er for lille til påvises under anvendelse af traditionelle teknikker, WB. PMCA er blevet anvendt til at amplificere og beregne den omtrentlige mængde af PrP ^Sc miljøet, såsom jord og vand ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4