Summary
En ELISA let kan omdannes til en Luminex xMAP assay og gennem fordelene ved multipleksing flere antistoffer kan screenes samtidigt at identificere en optimal antistof par, hvilket resulterer i forøget følsomhed og dynamikområde, og samtidig reducere assay omkostninger.
Abstract
Den enzym-linket immunosorbent assay (ELISA) har længe været det primære middel til påvisning af analytter af interesse i biologiske prøver for både life science forskning og klinisk diagnostik. Imidlertid ELISA har sine begrænsninger. Det er typisk udført i en 96-brønds mikroplade, og brøndene coatet med indfangningsantistof, som kræver en forholdsvis stor mængde prøve til at indfange et antigen af interesse. Det store overfladeareal af brøndene, og den hydrofobe bindingen af indfangende antistof kan også føre til ikke-specifik binding og øget baggrund. Desuden har de fleste ELISA'er afhængige af enzym-medierede amplifikation af signal for at opnå en rimelig følsomhed. Sådan amplifikation er ikke altid lineære og kan således forvrænge resultater.
I de seneste 15 år har en ny teknologi frem, der giver fordelene ved ELISA, men muliggør også højere overførselshastighed, øget fleksibilitet, reduceret prøvevolumen, og lavere omkostninger, med en lignende workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology er en mikrosfære (perle) række platform, så både monoplex og multiplex assays, der kan anvendes til både protein og nukleinsyre applikationer 3-5. Perlerne har det indfangende antistof kovalent immobiliseret på et mindre overfladeareal, som kræver mindre indfangningsantistof og mindre prøvevolumener, sammenlignet med ELISA, og ikke-specifik binding reduceres betydeligt. Mindre prøvevolumener er vigtige, når der arbejdes med begrænsende prøver, såsom cerebrospinalvæske, synovialvæske, etc. 6. Multipleksering assayet reducerer yderligere prøvevolumen krav, hvorved flere resultater fra en enkelt prøve.
Nylige forbedringer ved Luminex omfatter: det nye MAGPIX system en mindre, billigere, nemmere at anvende analysator; lav koncentration Magnetic MagPlex mikrokugler, som eliminerer behovet for dyre filterplader og kommer i en arbejdskoncentration bedre egnet til assay udvikling oglav-throughput anvendelser og xMAP antistof Coupling (ABC) kit, som omfatter en protokol, reagenser og hjælpematerialer, der er nødvendige til kobling perler til indfangningsantistoffet af interesse. (Se Materialer afsnittet for en detaljeret liste over kit indhold.)
I dette eksperiment, konvertere vi en præ-optimeret ELISA-assay for TNF-alfa cytokin til xMAP platformen og sammenligne effektiviteten af de to metoder 7-11. TNF-alfa er en biomarkør anvendt til måling af inflammatoriske responser i patienter med autoimmune sygdomme.
Vi begynder med at koble fire kandidatlande indfangningsantistoffer til fire forskellige mikrosfæreformuleringerne sæt eller regioner. Når de blandes sammen, de fire sæt mulighed for samtidig test af alle fire kandidater med fire separate påvisnings-antistoffer for at bestemme den bedste antistof par, sparer reagenser, prøve og tid. To xMAP analyser derefter konstrueret med de to mest optimale antistof par og deres præstationer ersammenlignet med det oprindelige ELISA-assay med hensyn til signalstyrke, dynamikområde, og følsomhed.
Protocol
I. Reagensforberedelse
- Antibody Selection og klargøring
- Identificere antistoffer, der skal anvendes i eksperimentet.
- Fire indfangnings-antistoffer: specifikke for human TNF-alfa, enten monoklonale eller polyklonale, alligevel værtsarter.
- Fire detektion antistoffer: specifikke for human TNF-alfa, enten umodificeret, biotinyleret eller PE-konjugeret.
- En bekræftelse antistof: PE-konjugerede og specifik for værtsarten af indfangnings-antistoffer.
- Opløs alle antistoffer mod de producent-anbefalede arbejder koncentrationer.
- Vælg fire hætteglas med lav koncentration MagPlex mikrosfære (perle) sæt eller regioner, for eksempel, Luminex reservedelsnumre MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, og MC10015-ID.
- Identificere antistoffer, der skal anvendes i eksperimentet.
- Kobling af antistoffer til MagPlex Mikrosfærer, ved hjælp af xMAP antistof (ABC) Coupling Kit'et
ReFer til ABC Kit Brugerhåndbog (Part # 89-00002-00-319) for hele kobling procedure. (Bemærk: fotosensitiv mikrosfærer skal beskyttes mod lys, når det er muligt.)- Bringe reagenserne i ABC kit til stuetemperatur og etiketten fire reaktionsrørene med vulsten region tal valgt til koblingsreaktionen. Overfør indholdet af de fire hætteglas MagPlex perler (1 ml hver eller 2,5 x 10 6 perler) i de fire mærkede reaktionsrørene.
- Vask hver af vulsten sæt to gange i 500 pi Aktivering puffer, som beskrevet i ABC kit manual.
- Aktiveres, hver perle sæt med 480 pi Aktivering puffer, 10 pi af sulfo-NHS, og 10 pi af EDC reagens ifølge fremgangsmåden i ABC kit manual, og inkuberes i 20 minutter. (Bemærk:. EDC reagens skal rekonstitueres i 250 pi aktiveringsbuffer umiddelbart forud for dette trin)
- Gentage den tidligere vasketrin med den nu "aktiveret" mikrosfærer alt three gange med 500 pi Aktivering puffer, som beskrevet i ABC kit manual.
- Fremstille fire separate opløsninger, der hver indeholder 7,5 pg (dvs. 3 ug / million mikrokugler) af indfangningsantistof i aktiveringsbuffer.
- Tilføje disse fire indfangningsantistof opløsninger til deres respektive reaktionsrør, vortex hvert rør med det samme, og inkuberes i to timer på en rotator.
- Gentage den tidligere vasketrin med den nu "koblet" mikrosfærer i alt tre gange med 500 pi af vaskebuffer, der følger med ABC kit.
- Efter den sidste vask trin, tilsættes 500 pi vaskebuffer til hvert reaktionsrør for at tilvejebringe en endelig stamkoncentration på 5 millioner antistof-koblede perler pr milliliter. Vortex, og sonikeres reaktionsrørene for at dispergere mikrosfærerne.
BEMÆRK: Delvis nedsænke den lukkede mikrosfære hætteglasset i en ultralydsrenser fyldt med DI-vand giver en effektiv lydbehandling for alle vasketrin. (Se Materialer tabel for equipment detaljer.) - Lagre koblede perlerne ved 2-8 ° C og beskyttet mod lys indtil brug.
- Tælling af Coupled mikrosfærer
- Tælle antallet af mikrokugler udvundet efter koblingsreaktionen under anvendelse af en celletæller eller hæmacytometer. Se tælle instrumentets brugermanual for passende instrukser herfor. Genopretning fra koblingsreaktionen er typisk over 90%.
- Kobling Bekræftelse
- Bekræfte koblingsreaktion var vellykket ved fremstilling testopløsninger af de koblede vulst lagre hvert sæt med den endelige koncentration på 100 perler / ul i assaypuffer (PBS med 1% BSA). Forberede fortyndinger af phycoerythrin-(PE-) mærket anti-arter IgG bekræftelse antistof ved 4 ug / mL i assaypuffer.
- Portion 50 uL af hver testopløsning i fire brønde i en rundbundet 96-brønds plade, for i alt 16 brønde. Derpå tilsættes 50 μL-assaybuffer til otte af brønde for at måle baggrund og 50 pi fortyndet bekræftelse antistof i de resterende otte brønde.
- Bland reaktioner forsigtigt ved pipettering op og ned adskillige gange med en multi-kanal pipette. Dæk pladen, og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur på en pladeryster.
- Pladen på en magnetisk plade separator i 1-2 minutter for at trække perlerne fra opløsningen. Derefter fjernes væsken ved kraftigt at vende pladen, mens separatoren over en spildbeholder.
- Vask hver brønd to gange ved tilsætning af 100 pi assaybuffer og fjernelse af supernatanten fra pladen på en lignende måde ved anvendelse af den magnetiske plade separatoren.
- Resuspendere perlerne i 100 pi assaybuffer ved forsigtigt at pipettere op og ned fem gange med en multi-kanal pipette.
- Analysere på en Luminex xMAP instrument, såsom MAGPIX instrumentet. Intensiteten af det fluorescerende signal af denne reaktion er directly proportional med mængden af protein på overfladen af perlerne, hvilket giver en hurtig vurdering af den relative mængde af protein koblet til perlerne.
- Kobling Biotin med umodificeret antistoffer til detektion
- Hvis der anvendes umodificerede påvisning antistoffer, biotinylere disse antistoffer med Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin-reagens (kat. nr. PI-21.335) og fremgangsmåden beskrevet i indlægssedlen. Når biotinyleret, kan påvisningen antistoffer senere mærkes med streptavidin phycoerythrin (SA-PE) i assayet (trin III.6.), Således at de kan detekteres med xMAP analysatoren.
II. Assay Setup
- Fremstille en initial blanding af alle fire perler sæt ved tilsætning af 10 pi af hver til 0,96 ml PBS med 1% BSA (assaybuffer. Se Materialer tabellen) for at bestemme, som er mest effektive med xMAP Assay.
- Forbered detektionsantistoffet løsninger ved diluting hver til 1 ug / mL i assaypuffer.
- Forbered R & D Systems TNF-α protein standard ved 2000 pg / ml i analysebuffer.
- Fortynd Streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (forudsat @ 1 mg / ml) til 8 ug / mL i assaypuffer.
III. Antistofscreening
- Tilsættes 50 uL af antistof-koblede mikrosfære blanding til hver af 16 brønde af en Costar rundbundet 96-brønds plade til screeningsassayet.
- Tilsættes 50 pi assaybuffer til 8 af de 16 brønde, at måle baggrund.
- Tilsæt 50 ul af R & D Systems TNF-α standard (@ 2.000 pg / ml) til de øvrige 8 brønde, til at måle respons.
- Inkuberes i en time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, under omrystning på en assay pladeryster.
- Tilsættes 50 uL af hver af de fire påvisning af antistoffer mod fire brønde (to baggrund og to respons) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, under omrystning på en assayplade shaker.
- Tilsættes 50 pi af SA-PE-reagens til alle brønde og inkuber 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, under omrystning på en assay pladeryster.
- Pladen på en magnetisk plade separator i ét minut og derefter fjerne væsken ved kraftigt at vende pladen.
- Tilsæt 100 pi assaybuffer til hver af de 16 brønde, anbringes pladen på den magnetiske plade separatoren i et minut og derefter fjerne væsken ved kraftigt at vende pladen, mens den separatoren.
- Tilsæt 100 ul af Assay Buffer til hver af de 16 brønde og læse pladen med Luminex MAGPIX instrument henvises til brugervejledningen for korrekt funktion.
- Vælg et antistof par, der opfylder dit ønskede signalstyrke.
IV. xMAP Funktionel analyse
- Efter udvælgelse af det bedste indfangningsantistoffet fortyndes 100 pi, at antistof-koblede perle lager (fra trin IB8) til 10 ml med assaybuffer.
- Tilsæt 50 piDe fortyndede perler til 78 brønde i to Costar rundbundede 96-brøndsplader. (78 brønde x 2 plader = 156 brønde) Hver plade vil blive anvendt til at vurdere resultaterne af en anden påvisnings-antistof.
- Forbered en 12-punkts standardkurve, der begynder ved 8000 pg / ml og slutter ved 4 pg / ml, med R & D Systems TNF-α standard. Tilsættes seks 50 uL replikater af hver fortynding til hver af pladerne, plus seks brønde med 50 pi assaybuffer hver som en baggrund, i alt 78 brønde / plade.
- Pladerne inkuberes i en time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, under omrystning på en assay pladeryster.
- Tilsættes 50 pi af den første påvisning antistof til alle 78 brønde i den første plade. Gentag for det andet detekteringsforsøg antistoffet på den anden plade.
- Pladerne inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys under omrystning på en assay pladeryster.
- Tilsæt 50 pi af SA-PE-reagens til alle brøndene i hver plade.
- InkuberDe to plader i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys under omrystning på en assay pladeryster.
- Læg pladerne på magnetisk plade separatorer til ét minut, og derefter fjerne væske ved kraftigt at vende pladen mens du er på separatoren.
- Tilsæt 100 pi assaybuffer til hver af de 78 brønde på plader, placere pladerne på magnetiske plade separatorer i et minut, derefter fjerne væsken ved kraftigt at vende pladen.
- Tilsæt 100 pi assaybuffer til hver af de 78 brønde på pladerne og analysere den MAGPIX instrumentet, med henvisning til brugermanual for korrekt funktion.
V. ELISA Assay
- Efter de instruktioner, der følger med R & D Systems Menneskelig TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit (R & D Part # DY210), svar genereret af standard forsynet med R & D kit måle. Gentag ELISA-analysen yderligere tre gange, erstatte den R & D Systems opsamling og detektion antibodies med antistoffer af andre leverandører. For enkelhedens skyld par antistofferne fra leverandøren (f.eks Millipore indfangningsantistof med Millipore detektionsantistoffet, Abcam indfangningsantistof med Abcam detektionsantistoffet, etc.).
- Vurdere hvert par uafhængigt, som kræves af ELISA-format, idet hver af de tre TNF-a-protein-standarder.
VI. Repræsentative resultater
Denne protokol viser, hvordan en typisk ELISA kan omdannes til xMAP platformen, medens anvendelse af multiplex evne teknologi til hurtigt at optimere assay. ELISA anvendt i dette eksempel var human tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) DuoSet ELISA-kit fra R & D Systems (R & D Part # DY210).
Ud over antistoffet par tilvejebragt i kittet, blev tre andre antistof par fra forskellige kilder (se Materialer tabellen) evalueret samtidig anvendelse af xMAP platformen. Four af antistofferne blev betegnet som indfangnings-antistoffer og blev koblet til MagPlex lav koncentration mikrosfærer. De andre fire antistoffer blev betegnet som påvisnings-antistoffer, tre, der blev købt som biotin-koblet, og den fjerde blev biotinyleret som beskrevet i protokollen.
De antistoffer til denne undersøgelse blev valgt ud fra tilgængelighed og leverandør. Men i praktisk sammenhæng, bør antistoffer vælges udgangspunkt i den enkelte brugers præferencer og tidligere præstationer erfaringer med dette antistof. Selv dette eksperiment tester ikke egnede af et antistof som opfangningsantistof versus detektionsantistoffet, kan denne protokol kan let modificeres til dette formål.
Luminex xMAP assays blev udført som en multipleks til evaluering af alle fire indfangnings-antistoffer som en blanding ved at kombinere fire sæt af TNF-α-antistof koblet MagPlex mikrosfærer. De indfangnings-antistoffer blev evalueret med hver af de firebiotinylerede detektion antistoffer individuelt, således at vekselvirkningen af en påvisnings-antistof til hver af de fire indfangnings-antistoffer kunne bestemmes samtidigt. Fire sådanne assays udført parallelt, bestemmes interaktionerne af alle fire detektion af antistoffer med alle fire indfangnings-antistoffer. Figur 1 viser de komparative data fra disse screeningsassays.
Resultaterne viste, at antistoffet par fra R & D Systems DuoSet klaret sig bedst med en deraf følgende respons på 6183 Median (MFI) enheder. Det blev også observeret, at påvisning antistoffer fra Millipore (86% af R & D-antistof par respons) og Abcam (67%) gav en rimelig reaktion i xMAP analysen, når den kombineres med R & D Systems capture-antistof. De omhandlede bindingsprober antistoffer fra Abcam, Millipore og Novus frembragte en mindre ønskelig respons i xMAP assay.
Det er vigtigt at bemærke, at PURblik på denne undersøgelse er ikke nødvendigvis at fremhæve forskellene mellem bestemte antistoffer eller leverandører, men blot for at illustrere, at der er observerbare forskelle i deres ydeevne, når de anvendes under lignende forhold, og at xMAP platformen kan tilbyde et effektivt middel til at vurdere disse forskelle.
R & D Systems DuoSet protokol blev anvendt til at sammenligne de fire antistof par i et ELISA-format. R & D Systems protokol blev anvendt med alle antistof par, fordi det er reflekterende over typiske ELISA-protokoller, der i vid udstrækning anvendes i dag, og det er analog til protokoller, der bruges med xMAP teknologi. ELISA tests viste, at antistoffet par fra R & D Systems igen gav de bedste resultater (figur 2). Antistoffet par fra Abcam produceret ingen respons og antistof par fra Millipore og Novus produceret beskedne svar.
For at vurdere eventuel variation i antistof reaktivitet med den standard, alle fire antistofferney par blev testet med tre forskellige rekombinante TNF-a-protein-standarder, fra tre forskellige leverandører (se Materialer tabellen). Dataene i figur 2 viser, at de rekombinante TNF-a-protein-standarder fra de tre leverandører gav tilsvarende resultater.
TNF-α-protein fra R & D Systems blev anvendt til at generere standardkurver med ELISA (tabel 1) og xMAP assays (tabel 2 og 3). Mens ELISA-analysen blev udført med R & D Systems antistof par, xMAP analyser udnyttede R & D Systems indfangningsantistof og enten detektionsantistoffet fra R & D Systems eller Millipore. TNF-α-protein fra R & D Systems blev fortyndet til frembringelse af en række koncentrationer fra 8000 til 4 pg / ml. Kun antistof par fra R & D Systems fremstilles det forventede resultat ved xMAP assay, med en respons> 20.000 MFI, som vist i tabel 2 ogFigur 3. Når påvisningsantistof fra Millipore blev anvendt med xMAP Assay i stedet for R & D Systems detektions-antistof (tabel 3), reaktion (6000 MFI) var omkring 30% af responset opnået med detektionsantistoffet fra R & D Systems, som vist i figur 3.
Dataene i tabel 1 repræsenterer den standard kurve af ELISA, som havde en fabrikantens anbefalede TNF-α området 16 til 1000 pg / mL. Dette interval er meget begrænset på grund af OD ved 1000 pg / ml var lidt større end 2 OD-enheder og spektrofotometret er i stand til at måle ovenfor CD3OD. På grund af begrænsningen i spektrofotometret, var det ikke muligt at forøge det område af ELISA-assayet yderligere. Desuden viser dataene i tabel 1 viser, at R & D Systems DuoSet ELISA ikke er i stand til at detektere TNF-α i koncentrationer langt under 16 pg / mL. På den anden side er xMAP assay kan målening TNF-α i en koncentration på mindre end 7,8 pg / ml med det indfangende antistof fra R & D Systems kombineret med detektionsantistoffet fra enten R & D Systems eller Millipore.
Det dynamiske område og følsomheden af begge metoder er bedre illustreret ved afbildet i en log-log skala (fig. 4). En klar forskel mellem hældningen af ELISA reaktioner og reaktioner fra xMAP assays kan ses, at yderligere indikerer en mere begrænsende evne til påvisning af TNF-α med ELISA ved både højere og lavere koncentrationer.
Detektionsgrænserne (LOD) for de to funktionelle TNF-a xMAP analyser blev tilnærmet ved at identificere den laveste TNF-α koncentration med en observeret respons niveau (MFI) større end baggrunden, plus tre gange standardafvigelsen (SD). For at opnå statistisk signifikans, seks replikater blev anvendt til at bestemme SD for både xMAP og ELISA-metoder. THESe skøn over LOD er optimistisk og har til formål at give en "best-case" scenariet med den forståelse, at under normale driftsforhold kun to eller tre replikater vil blive brugt. I tabel 2 kan det bemærkes, at ved anvendelse af R & D Systems par, den laveste TNF-α koncentration på 3,91 pg / ml frembragte en reaktion på 66 MFI, der er større end responsen på baggrund + 3SD, der opfylder dette kriterium . Når Millipore påvisning antistof blev anvendt med R & D Systems indfangningsantistof (tabel 3), detektionsgrænsen var mindre end 7,81 pg / ml. I dette tilfælde fremstilles 2. laveste TNF-α koncentration en acceptabel reaktion af 17 MFI, der er større end responsen på den laveste TNF-α koncentration plus tre gange standardafvigelsen. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Tilsvarende blev detektionsgrænsen for R & D Systems DuoSet ELISA skønnes at være mellem 63 pg / ml og 31 pg / ml (Tabel 1).
Figur 1. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) i R & D Systems standard (@ 2.000 pg / ml) for hver mulig kombination af de fire indfangningsantistoffer (koblet til fire forskellige mikrosfæreformuleringerne regioner) og de fire påvisnings-antistoffer. Klik her for at se større regne .
Figur 2. Den optiske densitet (OD) af tre forskellige rekombinante standard (@ 1000 pg / ml) i fire indfangning og påvisning antistofpar kombinationer. Indfangning og påvisning antistoffer blev vilkårligt parret af leverandør, for nemheds skyld. Klik her for at se større figur .
| pg / ml | OD | Std Dev | 3 SD |
| 1000 | 2,084 | 0,035 | 2,187 |
| 500 | 1,328 | 0,038 | 1,441 |
| 250 | 0,787 | 0,025 | 0,863 |
| 125 | 0,476 | 0,026 | 0,554 |
| 63 | 0,304 | 0,023 | 0,374 |
| 31,3 | 0,212 | 0,025 | 0,287 |
| 15,6 | 0,167 | 0,244 | |
| 0 | 0,118 | 0,021 | 0,182 |
Tabel 1 optiske densitet (OD) af 2-fold fortyndingsrække angivet af R & D Systems DuoSet indlægsseddel, til anvendelse som en standard kurve. Herunder standardafvigelse (SD) og anslåede detektionsgrænse (LOD), mellem 31,3 pg / ml og 63 pg / mL.
| R & D Systems Capture and Detection antistoffer | |||
| pg / ml | MFI | Std Dev | 3 SD |
| 8000 | 20.320 | 463 21.707 | |
| 4000 | 15.594 | 223 | 16.263 |
| 2000 | 11.098 | 79 | 11.336 |
| 1000 | 6.985 | 160 | 7.465 |
| 500 | 4.149 | 80 | 4.390 |
| 250 | 2.233 | 30,0 | 2.323 |
| 125 | 1.199 | 43,8 | 1.330 |
| 63 | 636 | 14,0 | 678 |
| 31,3 | 340 | 12,9 | 379 |
| 183 | 5,9 | 201 | |
| 7,8 | 103 | 2,2 | 109 |
| 3,9 | 66 | 2,4 | 73 |
| 0 | 11 | 0,8 | 13,8 |
Tabel 2 Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af en standard fortyndingsrække målt ved xMAP teknologi, bruger antistoffet parret, der følger med R & D Systems DuoSet;. Herunder standardafvigelse (SD) og den estimerede detektionsgrænse (LOD), mindre end 3,91 pg / ml.
| R & D Systems Capture Ab med Millipore Detection Ab | |||
| pg / ml | MFI | | 3 SD | |
| 8000 | 5.800 | 143 | 6.229 |
| 4000 | 3.881 | 120 | 4.242 |
| 2000 | 2.176 | 73 | 2.396 |
| 1000 | 1.138 | 32,1 | 1.234 |
| 500 | 578 | 31,3 | 671 |
| 250 | 289 | 6,2 | 307 |
| 125 | 142 | 3,1 | 151 |
| 63 | 75 | 5,3 | 91 |
| 31,3 | 44 | 3,3 | 54 |
| 15,6 | 28 | 2,6 | 35,5 |
| 7,8 | 17 | 1,5 | 21,2 |
| 3,9 | 10 | 2,0 | 16,3 |
| 0 | 7 | 1,4 | 11,4 |
Tabel 3 Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af en standard fortyndingsrække målt ved xMAP teknologi, ved hjælp af R & D Systems indfangningsantistoffet og EMD Millipore detektionsantistoffet;. Herunder standardafvigelse (SD) og den estimerede detektionsgrænse (LOD), mindre end 7,81 pg / ml.
Figur 3. De standardkurver for de to xMAP analyser og R & D Systems DuoSet ELISA. Klik her for at se større figur .
Figur 4. En sammenligning af de xMAP standardkurver og ELISA standardkurve i et log-log skala. Klik her for at se større figur .
Discussion
Omdannelse af en ELISA-assay til Luminex xMAP platformen kan være så simpelt som at substituere streptavidin-peberrodsperoxidase (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin phycoerythrin (SA-PE), og optimering af ydeevne. For dem, der ønsker at oprette en xMAP immunoassay fra jorden op, kan dette ske med en simpel protokol, som også gør det muligt hurtigt, multiplex evaluering af antistof par. Reagenserne til xMAP assayet blev let fremstillet ved anvendelse af xMAP antistof Coupling Kit'et at koble de udpegede indfangnings-antistoffer til MagPlex lav koncentration mikrosfærer. Anvendelsen af en lav koncentration mikrokugler reducerer omkostningerne til assayet udvikling samtidig med det samme assay ydeevne højere koncentration mikrosfærer. Den mængde tid, der kræves til fremstilling koblet MagPlex mikrosfærer er cirka 3 timer, hvilket er meget hurtigere end 22 - 24 timer for at belægge brønd i en ELISA-plade, efterfulgt af behandlingDe coatede brønde. Udførelse af xMAP assayet er også overlegen i forhold til ELISA med hensyn til detektionsgrænse (<4 pg / ml versus> 31 pg / ml) og dynamikområde (<4 pg / ml til> 8000 pg / ml versus 16 pg / ml til 1000 pg / ml). Plade læsere har en begrænset OD område, som er enten 3 eller 4 OD, begrænser den øvre grænse for det dynamiske område for en assay.
Utvivlsomt vil ikke alle antistoffer virker i et ELISA-format, og ikke alle antistoffer, der fungerer godt i en ELISA er let overføres til xMAP assayformat. Men eftersom xMAP assays kan multiplekses (dvs. køres samtidigt), er det muligt at evaluere flere indfangning og påvisning antistof kombinationer samtidigt at identificere den bedste par til brug for et assay. Denne fremgangsmåde sparer betydelig tid og reagenser i forhold til ELISA udvikling procedure, der er begrænset til evaluering af et par ad gangen. Hvis to eller flere antistoffragmenter par udføre tilsvarende; andre parametre af assayet kananses for at bestemme egnethed af parret (f.eks tilgængelighed, pris, etc.).
Ud over forbedret assay ydeevne og fleksibilitet med xMAP assay, er der også signifikante omkostningsbesparelser. Den anbefalede mængde af antistof, der kræves til at belægge en enkelt brønd på en ELISA-plade er 400 ng, medens den mængde, der kræves for perlerne anvendes i en brønd i en xMAP assay er ca 7,5 ng. Således er mængden af antistof påkrævet til en ELISA og giver mere end 50 testresultater, hvis de anvendes i en xMAP assay. Til anvendelser, der involverer kostbare prøver også xMAP har en betydelig fordel. Volumenet af prøven anbefales til ELISA er 100 uL hvorimod volumen, der kræves for xMAP assayet kan være halvdelen af den, eller mindre.
Sammenfattende, er omdannelsen af en ELISA-analyse for at Luminex xMAP platform ukompliceret, effektiv og omkostningsbesparende, og samtidig producere en analyse med overlegen dynamikområde og følsomhed.
Disclosures
Dette arbejde blev udført på Luminex Corporation med udstyr fremstillet på Luminex Corporation.
R & D Systems & EMD Millipore er strategiske partnere for Luminex Corporation, licens til at udvikle og kommercialisere multiplex xMAP-baserede analyser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Luminex Corporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
