Summary
נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O
Abstract
חמצן חיוני metazoans כל לשרוד, עם חריג אחד ידוע 1. ירידה O 2 זמינות (היפוקסיה) יכולים להיווצר במהלך מצבים של התפתחות המחלה, רגיל או שינויים בתנאי הסביבה 2-5. הבנת מסלולי איתות תאיים המעורבים בתגובה ל היפוקסיה יכול לספק תובנה חדשה אסטרטגיות טיפול של מחלות אנושיות שונות, משבץ לסרטן. מטרה זו כבר הקשתה, לפחות בחלקה, בשל קשיים טכניים הקשורים עם חשיפה מבוקרת hypoxic באורגניזמים מודל מקובל מבחינה גנטית.
Caenorhabditis elegans את נמטודות הוא אידיאלי כאורגניזם מודל לחקר בתגובה חוסר חמצן, כפי שהוא קל תרבות גנטית לתפעל. יתר על כן, ניתן ללמוד התגובות הסלולר ספציפיים חוסר חמצן O 2 בריכוזים ללא תופעות מבלבלים מאז ג elegans להשיג O 2 (ו גזים אחרים) על ידי דיפוזיה, בניגוד למערכת הנשימה הקל 6. גורמים הידועים כמעורבים בתגובה ל היפוקסיה שמורים ב C. elegans. תגובה ממשית היפוקסיה תלויה בריכוז מסוים של O 2 הזמין. ב C. elegans, חשיפה מתונה היפוקסיה מעורר תגובה תעתיק מתווכת במידה רבה על ידי HIF-1, את הפערים המשתמרים היפוקסיה, גורם שעתוק מושרה 6-9. ג. עוברים elegans דורשים HIF-1 לשרוד עמודים לדקה 5,000-20,000 O 2 7,10 . היפוקסיה היא מונח כללי של "פחות מ רגיל 2". Normoxia (רגיל O 2) יכול להיות גם קשה להגדיר. בדרך כלל אנחנו רואים האוויר בחדר, שהיא 210,000 עמודים לדקה O 2 להיות normoxia. עם זאת, הוכח כי ג elegans יש העדפה התנהגותי עבור O 2 בריכוזים של 5-12% (50,000-120,000 עמודים לדקה O 2) 11. ב Larvae ומבוגרים, HIF-1 פעולות כדי למנוע היפוקסיה-Induced diapause בשנת 5000 ppm O 2 12. עם זאת, HIF-1 אינו משחק תפקיד בתגובה לריכוזים נמוכים יותר של O 2 (anoxia, הגדרה תפעולית <10 עמודים לדקה O 2) 13. ב anoxia, C. elegans נכנס למצב של חיות מושהית הפיך שבו כל פעילות הנצפה במיקרוסקופ מפסיק 10. העובדה כי התגובות הפיזיולוגיות השונות להתרחש בתנאים שונים מדגיש את החשיבות של בעל השליטה ניסיוני על ריכוז של חוסר חמצן O 2.
כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ויישום של תאים המייצרים תנאים סביבתיים hypoxic אמין לשחזור עם ריכוזים מוגדרים של O 2. שיטת הזרימה המתמשכת מבטיחה איזון מהיר של החדר ומגביר את היציבות של המערכת. בנוסף, שקיפותהנגישות של החדרים לאפשר ראיה ישירה של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה. בנוסף, אנו מדגימים שיטה יעילה של קצירת ג elegans דגימות במהירות לאחר חשיפה היפוקסיה, אשר יש צורך לבחון רבים במהירות, מהופכים השינויים המתרחשים 10,14 היפוקסיה. שיטה זו מספקת תשתית בסיסית כי ניתן לשנות בקלות עבור הצרכים מעבדה נפרדים, כולל מערכות מודל שונות ועוד מגוון של גזים.
Protocol
1. בניית לשכות הסביבה
- בחר את נפח סביר של החדר הקטן ביותר הדרוש היקף הפרוייקט. לשכת חייבת להתבצע על גז (O 2) חומר בלתי חדיר. מנות פיירקס התגבשות, קופסאות Anaeropack או גדולים יצוק אקריליק תיבות (מכשור Ellard), ניתן להשתמש. מצאנו כי 9 50 צלחות מ"מ יכול להתאים מנה 100 x 50 Kimex התגבשות. לוחות זכוכית יכול לשמש מכסים של צלחות פיירקס התגבשות.
- לקדוח חור בתא הנבחר ולהשתלב עם זכר פלסטיק Luer ל הולם צינור בארב (קול בן הזוג). אביזרי יכול להיות מאובטח על ידי מתאם צינור או עם אפוקסי. התקן מתאים דומה בצד השני של המיכל כדי לאפשר לגז לזרום פנימה והחוצה של החדר. אם אפשר, לקזז חורים להגדיל ערבוב סוערת.
- להשיג בלוני גז דחוס עם המוגדרים O 2 בריכוזים (מאוזנת עם N 2) אשר מאושר על תקן CO 2 Ontent או התנאים anoxic, טהור N 2 (<10 עמודים לדקה פלט 2). השתמש אוטומטית לעבור על הרגולטורים, על מחקרים ארוכי טווח כדי שלא לשבש את רמות החמצן החדרים.
- בתגובה האורגניזם כדי היפוקסיה הוכח להיות תלויה בטמפרטורה 15. על ידי הצבת חדר באינקובטור, טמפרטורות שונות יכול להישמר. הטמפרטורה בתוך חממה עלול להיות לא אחיד, וככזה, זה נבון לעשות שימוש לוגר הטמפרטורה נתונים כל הזמן למדוד את הטמפרטורה בתוך החדר.
2. חיבור הגז לשכת הסביבה
- לחיבורים כל, להשתמש שמינית אינץ' חיצוני בקוטר צינורות מחוברים משני מחברי הצמד או אביזרי דחיסה. צינורות צריך להיות בלתי חדיר ו unreactive עם 2 O, כגון אתילן פרופילן fluorinated (FEP) או ניילון (קול בן הזוג). עבור סכמטי של ההתקנה הושלמה, ראה איור 1.
- חיבור COMגז טנקים צמודות מכשיר בקרת זרימה, כגון בקר מסת הזרימה (סיירה מכשירים) או rotameter (אלבורג). ודאו כי לחץ הזרם מטנק נמצא בטווח של המכשיר זרימה אביזרי צינור עקיצה. שני שלבים הרגולטורים משמשים בדרך כלל, כאשר בשלב השני מוגדר הלחץ הרצוי [ראה סעיף 3 לבחירת קצב הזרימה המתאים]
- גז מימה ידי מבעבע במים מזוקקים באמצעות שטיפת גז בקבוק עם גליל fritted, ישירות לתוך אחד על אביזרי חדר הסביבה, עוזב מתאים 2 פתוח פליטה גז (ראה איור 1). על מחקרים קצרי טווח, לחות הגז מגן מפני dessication צלחת, אבל ניטור לחות עשוי להיות נחוץ עבור מחקרים ארוכי טווח.
- Dow Corning גריז אבק יכול לשמש כדי לאטום את החדר. משקולות מקום על מכסה תא כדי להבטיח חותם אטום. כדי לאשר חותם חזק וזרימה נאותה, לקיים בריכה קטנה של מים בכף y יד עטוית כפפה שלנו מתאים על החדר ולבדוק בועות.
3. בחירת קצב הזרימה
- בהנחה ערבוב מושלם, יש חילוף הגזים של האטמוספירה 90% גזי בכל פעם את עוצמת הקול של החדר מוחלף (חוק Fick). כך, למשל, בחדר 100 סמ"ק עם קצב זרימה של 100 סמ"ק / דקה, לאוורר את הבית המקורי בחדר יוחלפו 90% גז הרצוי אחרי דקה 1, ויהיה asymptotically להתקרב בתמורה מלאה על ידי 90% מכל רגע לאחר מכן.
- ספיקה גבוהה יותר, מיכלים קטנים יותר יגיע ריכוז החמצן הרצויה מהר יותר. עבור 100 x 50 Kimex מכולות (400 סמ"ק), קצב הזרימה של 120 סמ"ק / דקה יגיע תמורת 99.9% ב 10 דקות (3 חילופי). זה קצב הזרימה מתאים לתנאי חמצן מרבית. למיטב ידיעתנו לא היתה חקירה שיטתית של איך את שיעור השינוי של ריכוז 2 O משפיע על התגובה ב C. elegans.
התחת = "jove_title"> 4. הכנת דוגמאות עבור assay ליכולת הקיום
- תולעים שנחשפו לתנאי חוסר חמצן בדרך כלל לברוח את פני השטח של צלחות אגר. כדי למנוע זאת, במקום טבעת של חומצה פלמיטית (10 מ"ג / מ"ל של אתנול) מסביב לקצה של הצלחות. חומצה פלמיטית ייצא פתרון כמו מתאדה אתנול, להקים מכשול פיזי. מחסומים חומצה פלמיטית אינם משפיעים על שיעור הטלת ביצים, פוריות או תוחלת החיים ב C. elegans 16,17. מתחפרת אינה מתרחשת בתדירות גבוהה יותר בתנאי חוסר חמצן, אמצעי המניעה נוספות, כך אינם נדרשים בדרך כלל.
- צור אוכלוסיות מסונכרנים על ידי הלבנת מבוגרים הרה להולדת בטיפה קטנה של תמיסת אקונומיקה בסיסי על unseeded הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) 18 צלחות. בניגוד אצווה גדול פרוטוקולים סטנדרטיים hypochlorite הלבנה, לאסוף 1-100 חיות בטיפת פתרון אקונומיקה על פני השטח של צלחת NGM, ולאחר מכן לאפשר פתרון אקונומיקה לספוג לתוך הצלחת
- למנוע חשיפת עוברי מולבן היפוקסיה, כמו זה יכול להפחית את הכדאיות 13. לאסוף עוברים צעירים (2-4 תאים), מבוגרים הרה להולדת ניתן קצוץ בנפח קטן של מים עם סכין גילוח לבין עוברי עברה צלחות ידי pipet הפה לחשיפה לאחר היפוקסיה.
- צור אוכלוסיות מסונכרנים על ידי הלבנת מבוגרים הרה להולדת בטיפה קטנה של תמיסת אקונומיקה בסיסי על unseeded הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) 18 צלחות. בניגוד אצווה גדול פרוטוקולים סטנדרטיים hypochlorite הלבנה, לאסוף 1-100 חיות בטיפת פתרון אקונומיקה על פני השטח של צלחת NGM, ולאחר מכן לאפשר פתרון אקונומיקה לספוג לתוך הצלחת
- לאטום צלחות בחדר הסביבה. חיות בקרת יש לשמור normoxia (בית אוויר) באותה טמפרטורה כמו תולעים שטופלו. אין הבדל הנצפה בין דגימות שנשארו בבית אוויר ואלה שמרו בתא זהה בבית האוויר זורם עליהם. ליזום זרימת הגז ולשמור על חשיפה לזמן הרצוי. כדי להבטיח אחידות הרמפה, כדי להיות בטוחלהחליף את המים בבקבוק גז לשטוף לפני החשיפה.
- להישרדות assay של עוברים, לאפשר התולעים לפתח עבור ה 48 לאחר החזרה לאוויר החדר, ובשלב זה הם צריכים להיות 4 שלבים זחלים / יום אחד למבוגרים. ציון על הישרדות, לצנזר את כל התולעים שלא ניתן להסביר.
- כדי להמחיש חיות שנחשפו היפוקסיה, להעביר תולעים ירידה של M9 על coverslip 22 מ"מ 2, להפוך על משטח של agarose 2% M9 18. אם levamisole הצורך, (25 מ"מ) או נתרן אזיד (10 mM) יכול לשמש חומר הרדמה. אזיד הנתרן levamisole עשוי לבלבל כמה תצפיות בשל רעילות ויש להשתמש בהם בתבונה 19.
5. קציר מהירה של היפוקסיה חשופים תולעים (דוגמה: הכנת דוגמאות לאנליזה HIF-1 במערב)
רבים היפוקסיה המושרה תופעות מתהפכים במהירות עם שובו לאוויר החדר, כולל חידוש של ייצור ביצים 12, זירחון של אפיטופים mitoticב 13 embryogenesis והשפלה של החלבון HIF-1 9,20. בידוד מהיר של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה נדרש כדי להשיג אפקטים לשחזור בתנאים אלה. עם ההגדרה הזאת, בעלי חיים ניתן לקצור ו קפוא חנקן נוזלי תוך פחות משתי דקות. למרות חוסר חמצן לתאי כפפה תיבת לאפשר מניפולציה של דגימות בתנאים anoxic, העלות שלהם ומעשיות תנאים אחרים מאשר anoxia להגביל את התועלת שלהם.
- לגדול בריסטול N2 תולעים על 4 10 ס"מ צמיחה גבוהה (כספית) צלחות עד רוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת 18. לשטוף את התולעים אל צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל פתרון אקונומיקה אלקליין 01:05 ו דגירה עם סיבוב עד תולעים מתחילים להתמוסס, לא יותר מ 5 דקות 9. לשטוף את התולעים שלוש פעמים עם M9, מסתובב ליד XG 1500 בין כל שטיפה ללא בלימה.
- צלחת עוברים מולבן על גבי 8 לוחות NGM 150 מ"מ המאפשרים לפתח את הזחלים L4 (~~~HEAD=NNS 48 שעות עבור בריסטול N2 ב 22 מעלות צלזיוס).העבר צלחות לתאי סביבתיים ולחשוף את חוסר חמצן (1,000 עמודים לדקה, 5,000 עמודים לדקה) ו anoxic (N2) תנאי למשך 4 שעות. פעמים חשיפה ישתנה בהתאם עיצוב ניסיוני. בעוד החשיפה היפוקסיה יש השפעה מיידית על קצב ההטלה, שני עוברי תאים מתים לאחר 16-18 שעות של חשיפה 12. עם תוכנית התקנה זו קאמרית היפוקסיה, הגבול התחתון של חשיפה מוגבלת על ידי שער החליפין האווירה צורך להגיע לשיווי משקל.
- 1 לייבל 1.5 microfuge מ"ל צינור ואחד צינור חרוטי 15 מ"ל למדגם כל ניסיוני. תולעים שנחשפו היפוקסיה נוטים יותר להיצמד צידי הצינור במהלך הקטיף. כדי למנוע זאת, במקום 100 μL של 1% נתרן סולפט dodecyl (SDS) בצינור כל קוני 15 מ"ל. אם SDS מעכב יישומים במורד הזרם, שור סרום אלבומין (BSA) ניתן להשתמש כדי למנוע הידבקות. השימוש השגרתי של SDS או BSA לא נראה שיש הבדל ניכר. הוסף 50 μl של 2x טוען חלבון צבע (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol וזכר כחול bromphenol ב גליצרול 30% (w / v)) צינור מ"ל 1.5 microfuge. יש דיואר של חנקן נוזלי מוכן.
- הזמן את הצעדים לאחר הסרת תולעים מ היפוקסיה ולהקליט. הסר את המכסה לתא hypoxic, קח 1 צלחת המדגם, לאטום את החדר. להשתמש במים מזוקקים לשטוף את התולעים אל מסנן ניילון ואז לשפוך לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. לסובב את התולעים למטה צנטריפוגה שולחנית XG ב 1500 על 15-20 שניות עם הבלם.
- השתמש בשואב אבק כדי להסיר את רוב supernatant מהצינור, עוזב את התולעת גלולה ללא שינוי.
- בעזרת פיפטה, העבר את התולעת גלולה ב 50 μL לצינור מ"ל 1.5 microfuge. לאטום צינור לטבול את בחנקן נוזלי.
- חזור על הפעולה עד שכל הדגימות היו מבודדים. בצע את ההליכים עבור דגימות בית אוויר בקרה עקביות. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C.
6. נציג תוצאות
תופעות האורגניזם של היפוקסיה ניתן לראותעל ידי בחינת הכדאיות לבגרות של C. elegans (איור 2). עוברים שנקבעו על ידי wild-type בריסטול (N2) ו HIF-1 (ia04) מוטציות מחיקה כולם שורדים בבית אוויר O 2 בריכוזים (210,000 עמודים לדקה פלט 2). N 2 תולעים מסוגלים להסתגל ולשרוד לבגרות בשנת 5000 ppm O 2, ואילו HIF-1 עוברים לא בת קיימא. זה מראה כי HIF-1 הוא חיוני להתאים את רמות משתנות של חמצן זמין בסביבה 10. לא N2 ולא HIF-1 בעלי חיים יכולים לשרוד חשיפה עמודים לדקה 1000 O 2.
לדמיין התולעת ישירות היפוקסיה אפשרית עם השימוש של היקף הניתוח, מיכל ברורה (איור 3). ישירות על ידי הצבת חדר היפוקסיה על היקף הניתוחים, אין צורך להסיר את התולעים מ היפוקסיה לראות תגובות האורגניזם. היקף יכול להיות מצויד עם illumation הקרינה (כמו באיור 3
באיור 1. דוגמה כיוון קאמרית. היפוקסיה של זרימת הגז מצוין באמצעות החצים. הגז המאוחסן במיכלים דחוסים גז עם המוגדרים O 2 בריכוזים (1) ו הרגולטור 2 בשלב מצורף (2). הגז נכנס התחתון של הצינור זרימה (3), היציאה העליונה בקצב הזרימה הנכונה. הגז זורם לתוך הבקבוק ואז הבועה (4), לחות הגז (להבטיח חיבור נכון של הבקבוק בועות על ידי התבוננות בועות). גז התייבשות לאחר מכן הוא עובר לחדר היפוקסיה על שסתום יבוא (5), חושפת את דגימות היפוקסיה. גז ולבסוף פתחי אל תוך החדר דרך חור פליטה קדח בתא.
איור 2. הכדאיות של עוברים חשופים 1,000 עמודים לדקה O 2, 5000 עמודים לדקה O
איור 3. ויזואליזציה של C. elegans ב היפוקסיה עם מיקרוסקופ. תולעים נחשפים היפוקסיה באמצעות השיטות המתוארות. החדר הסביבה שקוף (שנבנה עם צלחת התגבשות פיירקס ואת צלחת זכוכית) ממוקם ישירות על במת היקף הניתוחים. שתי השקפות מוצגות, כולל 1 זרימת הגז כל להגדיר, והשני עם חדר רק על הבמה מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מהווה אסטרטגיה לבניית סביבה hypoxic המאפשר לסביבות עם ריכוזים מדויקים של חמצן להישמר במעבדה. לשכות אלה מספקים שיטה פשוטה חשיפת אורגניזמים בריכוזים נמוכים ספציפיים של O 2 וניטור התפוקות מולקולריות ופיזיולוגיות. החדר הסביבה תיאר מורכב על ידי המעבדה במקום לרכוש מסחרית ולכן יכול להיות שונה כדי להתאים את הצרכים של הניסוי.
אחת יתרון בולט של שיטה זו הוא עיצוב זרימה רציפה. זו מבטלת את הקשיים שבהם נתקלו בדרך כלל עם שמירה על ריכוזים נמוכים של 2 O בתאי כאשר החיצוני O 2 בריכוז גבוה הרבה יותר (210,000 עמודים לדקה O 2 באוויר חדר). החלופה היא שיטת הפסיקה זרימת, שבו הסביבה hypoxic נשמר בתא אטום. דליפות קטנות אפילו, אשר יכול להיות קשה לזהות מראש,לפרוק את קיום התנאים hypoxic באמצעות הפסיקה זרימה שיטות. שיטת זרימה רציפה הרף חילופי אוויר החדר עם ריכוז חמצן מוגדר במיכל אוויר דחוס ושומר על לחץ חיובי המונע דליפות מ לשבש את תנאי חוסר חמצן.
קבלת בדיוק, לפני מעורבות ריכוזי חמצן מהספק הגז פותר בעיה קשה נוספת עם היפוקסיה. זה די קשה למדוד ריכוזים נמוכים מאוד של O 2. רוב O 2 חיישנים הם דיפוזיה מוגבלת ויקרה למדי. כי O 2 מתמוסס לאט, מדידה נמוכה O 2 בריכוזים יכול להיות איטי או לא מדויק 21. לעומת זאת, זה די קל ליצור תערובות גז על ידי מדידת המשקל של גזים. תערובות שאנו רוכשים באופן קבוע מוסמכים רגיל להיות בתוך% 2 O 2 התוכן של תערובת הרצוי.
בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לעורר H הנצפהypoxia-Induced שינויים הן ברמת האורגניזם מולקולרית. בעוד ששיטה זו מתאר מבחני הישרדות התולעת המהירה בידוד כל לניסויים מולקולרית, יש readouts במורד הזרם עצום שיכול לשמש. לדוגמה, עיצוב זה מאפשר הדמיה כיוון תולעים היפוקסיה לחקר התנהגות בזמן אמת שינויים מבנים הכתב. לדמיין תולעים בהיקף לנתח, להרכיב את החדר באמצעות קופסאות שקופות עם נפח קטן, גובה מינימלי. החדר כולו ניתן להציב על היקף הניתוח, היא יכולת תמרון בקלות אופטימלית עבור להדמיה (ראה איור 3). זה גם יהיה ניתן לראות דוגמאות בהגדלה גבוהה יותר על ידי שימוש בתאי זלוף עם מיקרוסקופ הפוכה. זה דורש קצת הסתגלות החדרים לממשק אותה עם צינור המשמש בדרך כלל זרימת גז, לקבוע קצב הזרימה המתאים. התוצאות המוצגות מייצגות רק לגרד את פני השטח של possibi ניסיוניlities, כמו היפוקסיה הוכח להשפיע על מערכות הסלולר של סינתזת ה-DNA כדי פירוק חלבונים 22,23.
האופי המעשי של שיטה זו אינה מוגבלת C. elegans. כל עוד המתאים בגודל החדרים משמשים, שיטה זו היא בקלות להתאמה כמעט לכל מערכת המודל. על ההסתגלות התקשורת נוזלי או תרבית תאים, דיפוזיה חמצן קבועים בתמיסה, outgassing מ פלסטיק הזמן לאזן בתרבות יש לקחת בחשבון, וזה יכול להיות מתאים ביותר להשתמש O 2 צלחות חדיר תרבות 24,25.
אפשר לשנות את החדרים שהוצגו בפרוטוקול זה לשימוש עם גזים אחרים. למשל, בתאי ניתן להתאים לספק סביבה anoxic רק על ידי השמטת O 2 של בלוני גז דחוס המשמשים ליצירת תא היפוקסיה (עם מאזן להיות מלא עם חנקן). זה מותר לצורך השגחה של C. elegans ב לכל חשאנימציה הסתיים (מידע לא מוצג) 10,13,26. שינויים קלים צריכה להיעשות על בסיס תכונות של תערובת גז המשמש. ההרכב של צינורות גז המשמש צינור לתוך ומחוץ לתא עשוי להיות מגוונות. פלסטיק מסוימים הם חדיר ל-CO 2, בעוד שאחרים אינם תואמים גזי מאכל כזה מימן גופרתי (H 2 S) 16,26. רשימה של פלסטיק תואמים ניתן למצוא באתר האינטרנט קולמן בן הזוג.
עבור גזים רעילים לשקע גז החדר חייב להיות שפכו לתוך במנדף מוסמך מגן אישי מתאים, כגון גלאי, חייב להיות מועסק. בנוסף, קציני EH & S יש להתייעץ לפני תחילת כל ניסוי באמצעות גזים העלולים להיות מסוכנים. גזים קורוזיביים גם דורשים תשומת לב מיוחדת. כך, למשל, H 2 S יכול לגרום לשיתוק רבים של פלסטיק המשמשים חומר צינור רגיל וכן ראוי פליז שיאכלו. בדרך כלל אנחנו לוודא שכל רטובטד פלסטיק Kalrez או שווה ערך במכשירים המשמשים עם H 2 S. גזים מסוימים עשויים לתקשר עם זיהומים במי ברז, כך DiH 2 0 יש להשתמש בבקבוק בועה. שיקולים מיוחדים לגבי כלי זכוכית יכול להיות גם חובה, למשל, H 2 S מחייבת ציוד wetted עם טבעות אטימה.
שינויים גם האורגניזם מולקולרית הם נצפו ניצול ניסויים אשר יכול להסתיים תוך יום. זו היכולת להציג במהירות דגימות היפוקסיה מספק כלי רב ערך בתחומים מפני הזדקנות וסרטן לפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המעבדה מילר לדיון קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס החוקר חדש מהמרכז הלם נתן למצוינות הביולוגיה הבסיסית של הזדקנות ל DLM לבין המכון הלאומי לבריאות הפרס R00 AG030550 כדי DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T.
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
