Summary
Overflod av nevrotransmitterreseptorer grupperte ved synapser påvirker sterkt synaptiske styrke. Denne metoden kvantifiserer fluorescently-merket nevrotransmitterreseptorer i tre dimensjoner med single-synapse oppløsning i
Abstract
Synapse styrke refererer til amplituden postsynaptiske responser til presynaptiske neurotransmitterfrigivning arrangementer, og har en stor innvirkning på den samlede nevrale krets funksjon. Synapse styrke avhenger kritisk av overflod av nevrotransmitterreseptorer grupperte på synaptiske steder på postsynaptisk membran. Reseptor nivåer er etablert utviklingshemmede, og kan endres av reseptor trafficking mellom overflate-lokalisert, subsynaptic, og intracellulær bassenger, som representerer viktige mekanismer for synaptisk plastisitet og neuromodulation. Strenge metoder for å kvantifisere synaptically-lokalisert nevrotransmitter reseptorer overflod er viktig å studere synaptisk utvikling og plastisitet. Fluorescens mikroskopi er en optimal tilnærming fordi det bevarer romlig informasjon, skille synaptic fra ikke-synaptiske bassenger, og diskriminere blant reseptor populasjoner lokalisert til forskjellige typer synapser. Den genetiske modell organisme Caenorhabditis elegans er spesielt godt egnet for disse studiene på grunn av liten størrelse og relativ enkelhet av sitt nervesystem, sin åpenhet, og tilgjengeligheten av kraftige genetiske teknikker, slik at undersøkelse av innfødte synapser i intakte dyr.
Her presenterer vi en metode for å kvantifisere fluorescently-merket synaptiske nevrotransmitterreseptorer i C. elegans. Dens viktig funksjon er automatisk identifisering og analyse av individuelle synapser i tre dimensjoner i multi-plane confocal mikroskop utdatafiler, tabulerer posisjon, volum, fluorescens intensitet, og total fluorescens for hver synapse. Denne tilnærmingen har to vesentlige fordeler fremfor manuell analyse av z-planet projeksjoner av confocal data. Først fordi hver planet av confocal datasettet er inkludert, er ingen data tapt gjennom z-planet projeksjon, typisk basert på pikselintensiteten gjennomsnittsverdier eller maxima. Second, identifisering av synapser er automatisert, men kan inspiseres av experimenter som dataanalysen inntektene, slik at rask og nøyaktig uttak av data fra et stort antall synapser. Hundrevis til tusenvis av synapser per sample kan enkelt oppnås, produsere store datasett for å maksimere statistisk styrke. Hensyn for utarbeidelse C. elegans for analyse, og utføre confocal bildebehandling for å minimere variasjonen mellom dyr innenfor behandlingsgruppene blir også diskutert. Selv utviklet for å analysere C. elegans postsynaptiske reseptorer, er denne metoden generelt nyttig for enhver type synaptically-lokalisert protein, eller faktisk, noen fluorescens signal som er lokalisert til diskrete klynger, puncta eller organeller.
Prosedyren utføres i tre trinn: 1) forberedelse av prøvene, 2) confocal bildebehandling, og 3) bildeanalyse. Trinn 1 og 2 er spesifikke for C. elegans, mens trinn 3 er generelt gjelder til enhver punctate fluorescens signal i confocal mikrografer.
Protocol
1. Utarbeidelse av Worms for Imaging
Dette segmentet av protokollen er basert på offentlig C. elegans kultur teknikker 1,2, og er skissert i figur 1.
- Grow ormer på høye Peptone NGM agar plater (10 cm) seeded med NA22 E. coli-bakterier før nesten sultet. Hvis farging, vil en plate pålitelig produsere nok mark til en individuell flekken, tar hensyn til tap underveis, og de strenge kriteriene som brukes for å velge ormer for bildebehandling (se del 2).
- Harvests ormer ved å helle et par ml DDH 2 0 på tallerkenen, virvlende kort, og helle væske inn i en 15 ml konisk rør (gjenta om nødvendig å overføre de fleste ormer til røret). Pellet i klinisk sentrifuger i 3 min, 1000x g. Vask pellet 1-3x med DDH 2 O til supernatanten er klar for å fjerne rester av bakterier. Bruk polypropylen overføre pipetter å fjerne supernatants, som ormer hold deg til glass(Fra dette trinnet og fremover er det avgjørende å minimere tid mellom tiltak for å unngå tap i egg levedyktighet).
- Etter siste vask, resuspender orm pellet i 5 ml basisk hypokloritt løsning for å lyse ormer og slipp egg. Rock forsiktig, og undersøke rør under et dissekere mikroskop omtrent en gang per minutt. Når ca 50% av ormer er lysert (de vises bøyd og brutt åpen), avslutte lysis ved å fylle røret til topps med Egg Buffer, inverterende flere ganger, og pelletering for 3 min, 1000x g. Lyse tid må ikke overstige 5 min.
- Fjern supernatanten med overføringspipetten, og vaske pellet 3x med Egg buffer.
- For å skille egg fra rusk, flyte dem på en pute av 30% sukrose i DDH 2 O: etter siste vask fra trinn 1,4, fjern forsiktig supernatanten og resuspender pellet i 5 ml DDH 2 0. Tilsett 5 ml steril 60% sukrose i DDH 2 O, og bland godt. Spinn i klinisk sentrifuge 6 min, 1000x g. Egg vil samle på menisken (de vil have en overskyet utseende), mens vrakgods vil pellet.
- Ved hjelp av en plast overføringspipetten, suge opp egg i en minimal volum og overføre til unseeded NGM agar plater. Eventuelle egg fester seg til siden av røret kan skylles forsiktig ned og overføres også. En 10 cm unseeded plate per belastning analysert er tilstrekkelig.
- Inkuber unseeded platene med eggene natten (~ 16 timer) ved 20 ° C. Luft platen for de første timene for å tørke det ved å la lokket litt av i noen timer, men sørg for å dekke over natten.
- Etter klekking, overføre L1 larvene til en 15 ml konisk rør i S Basal (legg et par ml S Basal til plate, swirl, helles i rør). Pellet i klinisk sentrifuge (3 min, 1000x g), resuspender i en minimal mengde S Basal, og overføring til 10 cm NGM agar plater seeded med NA22 bakterier. Bruk 2 plater her for hver original plate fra trinn 1,1. Inkuber inntil ormer kommer ønsket alder.
- Overvåke kulturer én eller to ganger per dag. Hvis de er i fare of sulter, overføre til ferske NA22 plater. For vill type N2 ormer, er sult innledes med dannelsen av en linje eller bølge av ormer som beveger seg over platen som dyr vandrer en masse bort fra mat-utarmet soner. Når denne skjemaer, vil maten bli helt tømt i løpet av få timer.
- Worms er nå klar for farging eller live bildebehandling. Fikse og flekker ormer i suspensjon er optimal fordi store mengder intakte ormer kan avbildes enkelt. Farging prosedyrer basert på Finney og Ruvkun protokoll 3-6 er å foretrekke fremfor fryse-knekke prosedyrer fordi store mengder av ormer er nødvendig for bildebehandling.
2. Confocal Imaging
- Monter ormer på lysbilder for confocal avbildning. Juster tetthet av ormer til noen få hundre per mikroliter. Lag en pute av 2% agarose i S-basal omgitt av en tynn ring av vaselin for å hindre fordamping under avbildning (søkt via en 3 ml sprøyte utstyrt med en cut-off 25 gauge nål). Pipettering enfå mikroliter av ormen suspensjon inn mot et dekkglass (bruk bedøvelse hvis bildediagnostikk levende ormer), og senk agarose puten på dekkglass, spre ormer jevnt over puten.
- Velg ormer for bildebehandling. Velg ormer der synapsene av interesse er orientert mot objektiv, med radial forskyvning av ikke mer enn ± 45 ° (hvor 0 ° betyr orientert direkte mot mål). Utfør denne vurderingen raskt (noen få sekunder) for å unngå photobleaching. Omfanget av de første kulturer er optimalisert for å sikre tilstrekkelig ormer vil tilfredsstille disse geometriske kriteriene.
- Fullfør confocal avbildning av prøven. Relativt flate prøver som kan omfattes innen ca 14 0,4 mikrometer tykke seksjoner gir de beste resultatene. Høy hastighet, bilder med lav oppløsning (512 x 512 piksler) er tilstrekkelig for rask nøyaktig datainnsamling. Unngå å mette detektoren med overdreven signalstyrker, da dette vil føre til undervurdering av fluorescenssignaler.
3. Automatisert identifisering og analyse av individuelle synaptiske Clusters
- Åpne multi-TIF utdatafiler fra confocal mikroskopet bruker Volocity 4.0 (eller høyere) software (PerkinElmer).
- Crop bort deler av bildet som ikke inneholder strukturen av interesse (Image -> Extended Focus -> Velg område av interesse å bruke "Freehand ROI 'verktøy -> Handlinger -> Beskjær til markering; Figur 2A). Obs, Utvidet Focus produserer en z-planet projeksjon på skjermen for å hjelpe din analyse, men påvirker ikke de underliggende dataene, det samme gjelder for lysstyrke og kontrast justeringer om nødvendig).
- Måle lengden av området analysert ved hjelp av Linjeverktøy. Lengden på linjen vil bli beregnet og lagt til datatabellen (figur 2B).
- Identifiser objekter ved hjelp av "Objects av Intensity 'filter (Mål-modus). Angi en terskel slik at synaptiske klyngene eruthevet og ikke-synaptiske bakgrunn er ikke (Figur 2C). Inkludering av en uavhengig synaptiske markør merket med en annen farge kan hjelpe entydig identifisere synapser. Typiske synapser varierer fra noen få til noen få hundre voxels. Sett terskelen gang med en kontroll prøve, og bruke det for alle påfølgende prøver. Thresholding hver prøve er separat uakseptabelt fordi den introduserer potensialet for eksperimentator bias. Objekter er valgt og ordnet automatisk (Figur 2D).
- Ordne og eksportere data. Eliminere objekter på 2 eller færre voxels, siden disse er vanligvis bakgrunnen flekker. Disse kan elimineres ved ytterligere filtrering, eller under påfølgende analyse. For å lette deres fjerning nedstrøms, re-sortere datafilen av "objektet størrelse" så vil de alle gruppen sammen. Eksportere dataene i CSV-format, som kan åpnes av Microsoft Excel eller andre regnearkprogrammer. Hvert bilde produserer en output fil.
- Dersom Volocity mykware er utilgjengelig, alternative metoder for å analysere Z-flyet projeksjoner av confocal data kan benyttes (f.eks ref.. 7, eller manuell analyse ved hjelp ImageJ), selv om 3-dimensjonal informasjon går tapt (se diskusjon).
4. Representative Resultater
Kvantifiseringen metoden presenteres bør kunne skille mellom cluster bestander av ulik lysstyrke og ulike volumer. Representative bilder og tilsvarende kvantitative data presentert i Figur 3 viser eksempler på differensiering på grunnlag av disse parametrene. Som en generell regel resultatene bør tilsvare det som er tydelig for øyet. Ved UNC-49 GABA reseptorer farging ventrale nerve ledningen av C. elegans, alle dyr vanligvis virket svært lik i størrelse og modenhet, og totalt synaptiske fluorescens verdier for en gruppe på fem ormer (normalisert til lengden av nerve ledningen analysert) viste Standard Feil verdier på om lag 10% av gjennomsnittlig fire. Genetisk mutasjon og andre eksperimentelle behandlinger (f.eks narkotika eksponering) kan endre ikke bare volum og intensitet verdier og frekvensfordelinger av synaptiske klynger, men muligens den utviklingsmessige tid-kurs og synkronitet av ormer, som fører til høyere variabilitet. Men de kvantitative resultatene skal alltid reflektere hva som kan bli verdsatt visuelt og hvis ikke, inspeksjon av bildene og objektene er identifisert av Volocity skal avsløre hvor feilen oppstod og foreslå korrigerende tiltak som re-thresholding eller fjerning av artefactual objekter.
Figur 1. Utarbeidelse av synkron C. elegans kulturer. Synkrone kulturer er hentet fra denne prosedyren fordi C. elegans utvikling arrestasjoner og L1 larvestadiet i fravær av mat, og starter igjen når maten er innført.
Figur 2. Kvantitering av synaptiske puncta.
- Utenforliggende områder av bildet er beskåret for å redusere filstørrelser og øke spesifisiteten. Venstre hånd panelet viser startbildet, viser midtpanelet valgt region, viser retten panel bilde etter beskjæring. Red signal er UNC-49 GABA receptor immunfluorescens, er grønt signal synaptobrevin-GFP (en presynaptisk markør) uttrykt i presynaptiske GABA nevroner 4. Klikk her for å se større figur .
- En linje er trukket lengden på nerve ledningen segmentet som skal analyseres, og dens lengde blir automatisk registrert i resultatene tabellen. Denne informasjonen er nødvendig for å normalisere synaptiske data på grunn av lengden på analyzable nerve ledningen, som kan variere flere ganger hvis ormer bli fragmentert under farging.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
- En terskel brukes til å identifisere individuelle synaptiske klynger. Venstre panel viser bildet før thresholding; eksempler på ulike thresholding nivåer er vist i egne paneler (grønt signal utelatt). Hver identifiserte objektet er avbildet på bildet som en farget region. Legg merke til korrespondanse mellom de visuelt tydelig synaptiske klynger i lengst til venstre panel og de fargede regioner på høyre-mest panel. Klikk her for å se større figur .
- Hver identifiserte objektet er oppført separat i resultatlisten tabellen. Individuelle objekter kan velges, og er markert på bildet for inspeksjon hvis ønskelig. Merk at tabellen inneholder informasjon om den røde ('rhodamine') og grønn ('EGFP') kanalene, den grønne kanalen informasjonen er potensielt misvisende ettersom objektene varidentifisert basert strengt på rød fluorescens. Denne analysen kan også utføres på enkle fargebilder. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Representative resultater. Representative mikrografer fra vill-type C. elegans farget for UNC-49 GABA reseptorer før (A) og etter (B) behandling med muscimol, en GABA reseptor agonist som fører til at reseptorene blir downregulated etter lang eksponering. Paneler viser beskåret bilder før (til venstre) og etter (høyre) thresholding og fjerning av små bakgrunn flekker. (C) plott av kvantitative synaptiske parametre for de prøvene som er vist i (A) og (B): total fluorescens normalisert til nerve ledningen lengde (venstre), og kumulative sannsynlighet histogrammer av individuell synapse fluorescens innhold (i midten) og synapse volum (høt), viser statistisk signifikant reduksjon i synaptiske innhold og volum indusert av agonist eksponering (n = 60 synapser for ubehandlet, n = 115 synapser for muscimol-behandlet, p <0,001, Kolmogorov-Smirnov test http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her er utformet for å trekke kvantitative multi-Parameterdataene for store bestander av synapser i C. elegans, samtidig maksimere konsistens i behandlingsgruppene. Tre funksjoner bidra til disse målene. Først blir farging utføres på synkrone ormen populasjoner for å sikre at alle dyr er like gamle. Dette trinnet er kritisk fordi utviklingsmessig regulering av uttrykk nivåer kan tilsløre virkningene av den eksperimentelle behandlingen (f.eks UNC-49 GABA receptor immunfluorescens varierer flere ganger under utvikling (K. Davis et al., I forberedelse)). I tillegg kan permeabilization og fiksering være svært variabel, noe som gjør kvantitative sammenligninger vanskelig. Bruke synkroniserte kulturer reduserer denne iboende variabilitet, forbedre påliteligheten av teknikken. Andre måter å løse denne variasjonen inkluderer bruk en andre antistoff til et uavhengig mål som kan være uavhengig visualisert som en internkontrollerer for permeabilization, eller bildebehandling GFP-merket proteiner i levende ormer, som unngår behovet for permeabilization helt. Men denne siste tilnærmingen introduserer nye problemer fordi den endogene proteinet ikke lenger blir målt direkte, slik at potensielle gjenstander på grunn av uoverensstemmelser i transgene uttrykk / kopi nummer, strukturell endring på grunn av sammensmeltingen av GFP, eller ikke-fysiologiske transgenet uttrykk nivåer må være vurderes. Ingen enkelt metode er perfekt, perfekt, kan som bekrefter data innhentes ved hjelp av flere tilnærminger. I denne protokollen, har størrelsen på startkulturer blitt optimalisert for å gi et tilstrekkelig antall faste og beiset ormer for confocal analyse. Et stort antall av ormer er nødvendig fordi de geometriske kriterier som brukes for å velge ormer for bildebehandling er strenge, som er den andre funksjonen i protokollen for å minimere variasjonen. Det samme anatomiske strukturen skal avbildes i hvert dyr (enten den mest biologisk relevant område, eller envilkårlig valgt sted i tilfelle av bred vev fordeling av protein av interesse), og at strukturen må være orientert mot objektiv med bare svak avvik til begge sider. Dette kriteriet forbedrer konsistensen ved å eliminere variasjoner i mengden av mellomliggende vev som kan spre eksitasjon og emisjon lys, påvirker signalstyrken. Det er viktig at dette er det eneste kriteriet som brukes for å velge ormer, som det er lett å justere resultatene basert på forventningen om et bestemt resultat. Faktisk eksperimenter er best utføres blind der det er mulig. Den tredje funksjon som bidrar til kraften av denne teknikken er automatisert identifikasjon og kvantitativ karakterisering av synaptiske klynger i tre dimensjoner ved hjelp Volocity. Denne analysen er enkel og rask, i stand til å identifisere og tabulerer hundrevis til tusenvis av individuelle synapser for hver eksperimentell betingelse. Enda viktigere, omfatter Volocity data fra alle flyene av multi-plane confocal data stabler, snarere enn forkaste data til å generere to-dimensjonale z-anslagene brukt i tidligere protokoller. Nedstrøms denne analysen, kan eksperimentelle grupper sammenlignes med hensyn til samlet synaptiske fluorescens per dyr, den romlige fordeling av synapser, og frekvensfordelinger av volumer, total fluorescens, og maksimal fluorescens for individuelle synapser. Disse parametrene kan avsløre viktige overganger som indikerer synaptiske Arrangementer, de roller utviklingsmessige og regulatoriske proteiner, og synaptisk plastisitet.
Kvantitering av fluorescens signaler ved hjelp Volocity har programmer i nevrobiologi utover analyse av permeabilized fast C. elegans prøver, være nyttig for kvantifisering av noe fluorescerende signal lokalisert til høy kontrast puncta. Derfor er det egnet for analyse av fast vev eller celler fra enhver organisme. Men fører fiksering og permeabilization til visualisering av total synaptiske protein befolknings uavhengig av om de er overflatebehandlet uttrykt, mens for reseptorer minst, bidrar bare overflaten-uttrykte brøk til synaptisk styrke. Volocity-baserte analyser kan også brukes til å kvantifisere overflate-uttrykt populasjoner, forutsatt ikke-permeabilizing fiksering betingelser brukes. Volocity analyse vil også være nyttig å studere protein dynamikk i levende celler. Mange protein domener skyttel mellom blemmer og ekstracellulær miljøer med ulik pH under nevrale Signalanlegg hendelser (f.eks karboksy endestasjonen synaptobrevin under synaptiske vesicle utgivelse 8-10, eller aminosyrer terminal domener nevrotransmitterreseptorer under menneskehandel til celleoverflaten 11). Fusing pH sensitive ekliptikken GFP koder til disse regionene kan produsere in vivo reportere av disse overgangene som kan studeres kvantitativt ved hjelp av en Volocity tilnærming. Tilsvarende GFP-merking av neuropeptid gener resulterer i GFP-merkede tett-core vesikler som de-beis somdisse blemmer sikring med plasmamembranen 12; Volocity analyse kan være nyttig i denne sammenheng som en test for spesifikk neuropeptid utgivelse in vivo. Fordelen med Volocity analyse i alle disse innstillingene er dens evne til å raskt identifisere og kvantifisere store antall synapser, slik at små forskjeller i deres individuelle egenskaper eller befolkningen utdelinger skal demonstrert med statistisk rigor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke A. Benham for å bistå med utviklingen av protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av NIH stipend NS06747 til BAB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T.
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
